董洪雨 許丁帆 易元慧 何遠(yuǎn)秦 李得萍 劉艷軍

摘? ? 要：以絨毛白蠟組培苗莖段為外植體，建立絨毛白蠟松散型胚性愈傷組織誘導(dǎo)體系，為絨毛白蠟遺傳轉(zhuǎn)化與離體誘變等研究奠定基礎(chǔ)。試驗(yàn)結(jié)果顯示：幼嫩莖段在WPM+0.5 mg·L-1 2，4-D + 5 mg·L-1 GA3 + 30 g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上可誘導(dǎo)出理想的松散型愈傷組織;將松散型愈傷組織在MS + 0.5 mg·L-1 2，4-D + 1.0 mg·L-1 KT + 30 g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，每15 d繼代1次，繼代時(shí)選擇結(jié)構(gòu)松散質(zhì)地較硬的愈傷組織，3次繼代培養(yǎng)后，可獲得絨毛白蠟松散型胚性愈傷組織。

關(guān)鍵詞：絨毛白蠟 ;松散型胚性愈傷組織;組織培養(yǎng)

中圖分類號(hào)：S722.3+7? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2022.05.002

Study on the Induction of Loose Embryogenic Callus from Fraxinus velutina Torr

DONG Hongyu， XU Dingfan， YI Yuanhui， HE Yuanqin， LI Deping， LIU Yanjun

（School of Horticulture and Landscape Architecture， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300392， China）

Abstract： Using the stem segments of tissue cultured seedlings of Fraxinus velutina Torr， as explants， the loose embryogenic callus induction system of Fraxinus velutina was established， which laid a foundation for the study of genetic transformation and in vitro mutagenesis of Fraxinus velutina. The results showed that the young stem segments could induce ideal Loose callus on the medium of WPM+ 0.5 mg·L-1? 2，4-D+5 mg·L-1? GA3+30 g·L-1? sucrose; The loose callus was subcultured on the medium of MS+0.5 mg·L-1? 2，4-D+1.0 mg·L-1? KT+30 g·L-1? sucrose， and subcultured once every 15 days. The callus with loose structure and hard texture was selected during subculture. After subculture for 3 times， the loose embryogenic callus of Fraxinus velutina Torr could be obtained.

Key words： Fraxinus velutina; loose embryogenic callus; tissue culture

絨毛白蠟（Fraxinus velutina）為木犀科（Oleaceae）白蠟屬（Fraxinus）落葉喬木，樹體高大，枝節(jié)粗壯，抗逆性強(qiáng)，是防風(fēng)固沙的重要樹種[1]。目前，絨毛白蠟以種子繁殖、扦插繁殖為主要繁殖方式，受時(shí)間和環(huán)境條件的影響較大，繁殖效率較低。利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)可以顯著縮短繁殖周期，同時(shí)還能保持親本的優(yōu)良特性[2]。

植物組織培養(yǎng)技術(shù)與傳統(tǒng)的植物繁殖技術(shù)相比，植物組織培養(yǎng)技術(shù)不僅節(jié)省繁殖材料，而且促進(jìn)植株的生長發(fā)育、人為調(diào)控影響植株的因素使其植株處于最佳狀態(tài)[3]。松散型胚性愈傷組織是經(jīng)過人工誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種特殊的植物組織類型，這種組織主要由彼此聯(lián)系松散的愈傷組織細(xì)胞構(gòu)成，而愈傷組織細(xì)胞的特點(diǎn)是其具有一定的胚性，即這些細(xì)胞可以在一定條件下經(jīng)過分化與分裂，逐步發(fā)育成胚狀體。這類細(xì)胞在組培快繁、體細(xì)胞誘變育種、遺傳轉(zhuǎn)化和植物組織脫毒培養(yǎng)方面都有良好的應(yīng)用前景，并存在較強(qiáng)的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，而且具有很強(qiáng)的體細(xì)胞胚發(fā)生和植株再生能力[4]。

關(guān)于白蠟屬的研究，其他學(xué)者也有一定的進(jìn)展。他們?cè)诎紫瀸僦谐晒φT導(dǎo)出愈傷組織的有美國白蠟[5]，水曲柳[6-7]，對(duì)節(jié)白蠟[8-9]等。在白蠟組織培養(yǎng)技術(shù)中，已見種子[10]、莖段[11-12]等作為外植體進(jìn)行白蠟愈傷組織誘導(dǎo)的報(bào)道。在絨毛白蠟組織培養(yǎng)研究中，寧苓等[13]和許丁帆等[14]以幼嫩莖段為材料建立組織培養(yǎng)快速繁育體系;燕麗萍等[15]利用胚根誘導(dǎo)絨毛白蠟體細(xì)胞胚發(fā)生，建立再生體系。但至今沒有人采用松散型愈傷組織培育絨毛白蠟完整植株。

本試驗(yàn)以絨毛白蠟組培苗莖段為外植體，在不同培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷和胚性愈傷組織，并結(jié)合顯微鏡觀察及繼代選擇，最終建立其穩(wěn)定的絨毛白蠟松散型胚性愈傷組織誘導(dǎo)體系。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用的絨毛白蠟組培苗由天津農(nóng)學(xué)院園林植物實(shí)驗(yàn)室提供。組培苗所用的繼代培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 絨毛白蠟松散型愈傷組織誘導(dǎo) 將絨毛白蠟組培苗剪成5～7 mm的幼嫩莖段，將其接種到事先配制的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，本試驗(yàn)采用不同基本培養(yǎng)基，同時(shí)附加不同的植物激素，配成誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每個(gè)品種接種10塊外植體，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。將接種好的三角瓶放到培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)，其培養(yǎng)的條件為：采用連續(xù)光照，光照強(qiáng)度為1 000 lx，培養(yǎng)溫度為24±2 ℃。培養(yǎng)時(shí)間為40 d，最后統(tǒng)計(jì)每種處理的試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.2 松散型胚性愈傷組織誘導(dǎo) 將上一步驟誘導(dǎo)出的白色、松散的愈傷組織從三角瓶中取出，在超凈臺(tái)中，用鑷子分成大小約0.25 cm3的愈傷組織塊，將愈傷組織團(tuán)接種到事先配制的培養(yǎng)基上。試驗(yàn)用的基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，并添加不同種類與濃度的激素。每個(gè)試驗(yàn)處理重復(fù)5次，每瓶接種8塊外植體。培養(yǎng)條件與前面相同，溫度改為22±2 ℃，經(jīng)過10 d的培養(yǎng)，將每個(gè)處理的愈傷組織采用相同的培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)，最后把每個(gè)試驗(yàn)處理的愈傷組織的誘導(dǎo)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)記錄。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

愈傷組織誘導(dǎo)率%=（誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%;

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2013和SPSS Statistic 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 絨毛白蠟愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果

將絨毛白蠟莖段外植體接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上后，每天觀察愈傷組織誘導(dǎo)情況。隨著時(shí)間的延長，在不同處理的外植體上出現(xiàn)明顯的差異，具體結(jié)果見表1。

從表1可以看出，不同培養(yǎng)基上絨毛白蠟愈傷組織誘導(dǎo)的情況明顯不同，首先從愈傷組織誘導(dǎo)率來看，采用MS和B5作為基本培養(yǎng)基，愈傷組織誘導(dǎo)率都不太高，說明這兩種培養(yǎng)基都不適合愈傷組織的誘導(dǎo)。然而采用WPM作為基本培養(yǎng)基時(shí)，不論2，4-D的濃度是0.5 mg·L-1還是1.0 mg·L-1，這時(shí)愈傷組織的誘導(dǎo)率都可以達(dá)到100%，說明WPM適合白蠟愈傷組織的誘導(dǎo)，適合組培苗的生長;其次，從愈傷組織生長來看，不同基本培養(yǎng)基上愈傷組織生長情況也不同。當(dāng)培養(yǎng)基中只加入2，4-D時(shí)，3種基本培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出的愈傷組織都生長緩慢，只是在WPM和B5上愈傷組織是白色緊密型的類型，而MS上是白色半透明，并且隨著2，4-D濃度增加，愈傷組織出現(xiàn)褐變現(xiàn)象，說明在MS中增加2，4-D濃度會(huì)對(duì)愈傷組織產(chǎn)生強(qiáng)烈的毒害作用。而白色緊密型愈傷組織對(duì)于胚性愈傷組織的誘導(dǎo)不利，一般很難從這種愈傷組織誘導(dǎo)出胚性愈傷（圖1-A）。因此，本試驗(yàn)通過調(diào)整試驗(yàn)方案，在培養(yǎng)基中加入了GA3來增加外植體的生理活性，使得愈傷組織生長速度增快，從而在愈傷組織類型上有所改變。試驗(yàn)結(jié)果顯示在WPM+0.5 mg·L-1 2，4-D+5 mg·L-1 GA3的培養(yǎng)基上愈傷組織生長速度明顯增快，同時(shí)，松散型愈傷組織也可以誘導(dǎo)出來，這類組織進(jìn)一步誘導(dǎo)很容易獲得胚性愈傷組織。當(dāng)采用更高濃度的GA3時(shí)，愈傷組織生長速度不但沒有增快，相反出現(xiàn)褐變現(xiàn)象，這說明過高濃度對(duì)愈傷組織產(chǎn)生了毒害作用，因此綜上試驗(yàn)結(jié)果，誘導(dǎo)白蠟愈傷組織的理想培養(yǎng)基配方為：WPM+0.5 mg·L-1 2，4-D+5 mg·L-1 GA3+30 g·L-1蔗糖。

2.2 絨毛白蠟胚性愈傷組織誘導(dǎo)的結(jié)果

從表2可以看出，在不同激素配比條件下，絨毛白蠟愈傷組織胚性化誘導(dǎo)結(jié)果不同。首先，單獨(dú)使用2，4-D時(shí)，雖然愈傷組織可以生長，但速度較慢，而且愈傷組織逐漸變硬，結(jié)構(gòu)也變得緊密，單獨(dú)使用2，4-D不能誘導(dǎo)白蠟愈傷組織胚性化;當(dāng)使用0.5 mg·L-1 2，4-D與0.5 mg·L-1 BA和KT配合使用時(shí)，愈傷組織生長速度還是較慢，愈傷組織硬并且結(jié)構(gòu)緊密，愈傷組織很難胚性化;當(dāng)采用 0.5 mg·L-1 2，4-D+1.0 mg·L-1 BA培養(yǎng)基時(shí)，愈傷組織生長較快，質(zhì)地與結(jié)構(gòu)也都與胚性愈傷組織相似，通過鏡檢發(fā)現(xiàn)，一部分愈傷組織細(xì)胞呈現(xiàn)球型、細(xì)胞質(zhì)濃、細(xì)胞核明顯，細(xì)胞分裂旺盛，屬于胚性細(xì)胞（圖1-B），但多數(shù)是一些具有較大液泡的薄壁細(xì)胞，這說明該配方可以誘導(dǎo)絨毛白蠟愈傷組織轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝杂鷤?，只是效果較差;當(dāng)采用0.5 mg·L-1 2，4-D+1.0 mg·L-1 KT時(shí)，愈傷組織結(jié)構(gòu)松散、質(zhì)地較硬，通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞大多呈球形，細(xì)胞核明顯，屬于胚性愈傷組織細(xì)胞（圖1-C），說明該配方適合誘導(dǎo)絨毛白蠟愈傷組織往胚性愈傷組織轉(zhuǎn)變;當(dāng)提高2，4-D濃度并采用較低濃度的BA和KT時(shí)，愈傷組織生長速度較快，但質(zhì)地較軟，通過鏡檢發(fā)現(xiàn)只有少數(shù)細(xì)胞為胚性細(xì)胞;當(dāng)采用1.0 mg·L-1 2，4-D+1.0 mg·L-1 KT和1.0 mg·L-1 2，4-D+1.0 mg·L-1 BA時(shí)，誘導(dǎo)效果并不理想，經(jīng)過多次繼代培養(yǎng)，愈傷組織仍然是非胚性狀態(tài)，這說明較高濃度2，4-D抑制了愈傷組織向胚性化轉(zhuǎn)變。為此，試驗(yàn)采用了較高濃度KT的配方：0.5 mg·L-1 2，4-D+1.0 mg·L-1 KT，經(jīng)過2次繼代培養(yǎng)后這時(shí)其誘導(dǎo)的愈傷組織，通過顯微鏡可以看到，愈傷組織細(xì)胞基本轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝约?xì)胞，因此選用此培養(yǎng)基配方可以獲得理想的絨毛白蠟胚性愈傷組織。

3 結(jié)論與討論

培養(yǎng)基的組成對(duì)誘導(dǎo)絨毛白蠟胚性愈傷組織的影響較大。本試驗(yàn)3種基本培養(yǎng)基中，WPM培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)率最高。如本試驗(yàn)中選用的WPM培養(yǎng)基適合絨毛白蠟愈傷組織誘導(dǎo)和外植體生長，而MS培養(yǎng)基則表現(xiàn)出高鹽的毒害作用。郭靜等[16]發(fā)現(xiàn)WPM是適合植物組織培養(yǎng)的一種培養(yǎng)基，這與本試驗(yàn)研究一致。

其次，生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度也對(duì)愈傷組織胚性化有影響[17-19]。分裂素有利于愈傷組織胚性化，因此在誘導(dǎo)愈傷組織胚性化時(shí)，一般會(huì)使用細(xì)胞分裂素。本試驗(yàn)采用BA和KT這兩種分裂素來誘導(dǎo)愈傷組織胚性化的發(fā)生。本試驗(yàn)中除了使用分裂素，還用到了2，4-D，一般說來，2，4-D會(huì)抑制愈傷組織胚性化，因?yàn)檫@種激素會(huì)抑制細(xì)胞分化，然而胚性化就是一種非常復(fù)雜的分化過程，如果沒有2，4-D，愈傷組織首先會(huì)組織化，轉(zhuǎn)變?yōu)橐恍┏墒旖M織，如導(dǎo)管和木質(zhì)部，因此為了抑制愈傷組織的分化，必須要使用2，4-D;為了獲得胚性化的愈傷組織，就必須選擇適宜的分裂素與2，4-D的比例，從本試驗(yàn)結(jié)果可以看出，較高的分裂素與2，4-D的比值會(huì)促進(jìn)愈傷組織胚性化。在愈傷組織誘導(dǎo)的研究中，2，4-D濃度變?yōu)? mol·L-1時(shí)，會(huì)出現(xiàn)褐變、對(duì)外植體產(chǎn)生毒害現(xiàn)象;GA3濃度變?yōu)? mol·L-1時(shí)，也會(huì)對(duì)外植體產(chǎn)生嚴(yán)重的毒害現(xiàn)象。所以，選擇適宜的生長調(diào)節(jié)劑濃度對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)很重要。

松散型胚性愈傷組織中處于胚性階段的細(xì)胞顯著多于緊密型愈傷組織;而且松散型胚性愈傷組織結(jié)構(gòu)松散，使其每個(gè)細(xì)胞具有高度的同一性[20]，可以提高遺傳和轉(zhuǎn)化效率，還易于再生;采用松散型胚性愈傷組織作為誘變材料可以獲得更高的誘變率;采用松散型胚性愈傷組織相比普通胚性愈傷組織簡化了脫毒步驟，節(jié)省了時(shí)間，提高了效率。

繼代培養(yǎng)中不同培養(yǎng)基配比也起到了重要的作用。其中最適宜繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方：2.0 mg·L-1 6，BA+0.1 mg·L-1 NAA。在繼代培養(yǎng)中，部分愈傷組織出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。相關(guān)研究表明，褐變主要由苯酚氧化形成，在多酚氧化酶作用下形成喹諾酮。褐變現(xiàn)象的出現(xiàn)與消毒劑和消毒時(shí)間、培養(yǎng)基組成和環(huán)境密切相關(guān)[21]。在后續(xù)試驗(yàn)中，可以去研究如何抑制在繼代培養(yǎng)中愈傷組織褐化[22]。

由于本試驗(yàn)只研究到了誘導(dǎo)胚性愈傷組織，為絨毛白蠟的無性快速繁殖、體細(xì)胞誘變與遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)，尚未對(duì)絨毛白蠟的再生進(jìn)行討論研究。因而，關(guān)于絨毛白蠟胚性愈傷組織的體細(xì)胞胚發(fā)生，有待進(jìn)一步研究。

通過以上試驗(yàn)，筆者基本建立了絨毛白蠟胚性愈傷組織誘導(dǎo)的一般方法，現(xiàn)將具體試驗(yàn)步驟總結(jié)如下：先選擇生長良好的絨毛白蠟組培苗，剪取細(xì)嫩的莖段，莖段不要木質(zhì)化;將處理好的莖段外植體接種到WPM+0.5 mg·L-1 2，4-D+5 mg·L-1 GA3+30 g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上，在采用連續(xù)光照，光照強(qiáng)度為1 000 lx，培養(yǎng)溫度為24 ℃的條件下進(jìn)行愈傷組織初步誘導(dǎo);經(jīng)過大約40 d的誘導(dǎo)，就可以獲得生長良好的絨毛白蠟愈傷組織，將愈傷組織團(tuán)切成直徑0.25 cm3大小的小塊，接種到MS+0.5 mg·L-1 2，4-D+1.0 mg·L-1 KT+30 g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上，在采用連續(xù)光照，光照強(qiáng)度為1 000 lx，培養(yǎng)溫度為22 ℃的條件下進(jìn)行胚性愈傷組織誘導(dǎo);經(jīng)過3次繼代培養(yǎng)，每次繼代時(shí)間為10 d，并結(jié)合顯微鏡檢，就可以獲得理想的絨毛白蠟胚性愈傷組織。本試驗(yàn)結(jié)果可以為絨毛白蠟組織培養(yǎng)和遺傳育種研究提供參考。該試驗(yàn)以絨毛白蠟莖段為外植體成功誘導(dǎo)出絨毛白蠟胚性愈傷組織，為之后的體胚誘導(dǎo)奠定了基礎(chǔ)，為絨毛白蠟大規(guī)模無性繁殖和遺傳轉(zhuǎn)化提供了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王因花， 燕麗萍， 孔雨光， 等. 絨毛白蠟組培快繁研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2019， 35（14）： 41-46.

[2] 王磊， 李淑娟， 徐云剛， 等. 絨毛白蠟成熟胚和莖段培養(yǎng)繁殖體系的建立[J]. 林業(yè)科技， 2008， 33（3）： 1-3.

[3] 陳紅. 植物組織培養(yǎng)技術(shù)的現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)[J]. 生物化工， 2018， 4（5）： 137-139.

[4] 許丁帆， 劉艷軍， 陶則滿， 等. 絲棉木松散型胚性愈傷組織的誘導(dǎo)與增殖[J]. 西部林業(yè)科學(xué)， 2021， 50（4）： 74-79.

[5] PREECE J E， BATES S. In vitro studies with white ash （Fraxinus americana） nodules[M]//AHUJA M R. Woody Plant Biotechnology. New York： Plenum Press， 1991： 37-44.

[6] 張麗杰， 趙麗蒙， 陸秀君， 等. 水曲柳子葉和下胚軸愈傷組織和體胚的誘導(dǎo)[J]. 分子植物育種， 2015， 13（7）： 1645-1652.

[7] 孔冬梅. 水曲柳體細(xì)胞胚胎發(fā)生及體細(xì)胞胚與合子胚的發(fā)育[D]. 哈爾濱： 東北林業(yè)大學(xué)， 2004.

[8] 董社琴， 李冰雯. 對(duì)節(jié)白蠟愈傷組織誘導(dǎo)的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2008， 36（26）： 11228-11229.

[9] 王彩云， 白吉?jiǎng)偅?楊玉萍. 對(duì)節(jié)白蠟的組織培養(yǎng)及植株再生[J]. 植物生理學(xué)通訊， 1999， 35（4）： 299-300.

[10] 葉景豐， 馬冬菁， 陳罡， 等. 美國白蠟組培快繁技術(shù)研究[J]. 林業(yè)實(shí)用技術(shù)， 2010（11）： 30-31.

[11] 咸洋， 韓彪， 穆艷娟， 等. 絨毛白蠟組織培養(yǎng)研究[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2020， 26（8）： 16-17， 32.

[12] 陳之群， 劉志敏. 絨毛白蠟莖段的組織培養(yǎng)及植株再生[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2006， 34（3）： 472-473.

[13] 寧苓. 絨毛白蠟組培快繁技術(shù)研究[J]. 遼寧林業(yè)科技， 2018（4）： 36-37.

[14] 許丁帆， 劉艷軍， 王趙囡， 等. 絨毛白蠟組培快繁體系的建立[J]. 北方園藝， 2021（19）： 78-83.

[15] 燕麗萍， 李麗， 劉翠蘭， 等. 絨毛白蠟體胚誘導(dǎo)和植株再生[J]. 植物學(xué)報(bào)， 2016， 51（6）： 807-816.

[16] 郭靜， 柴慈江， 史燕山， 等. 蘋果砧木G.11試管苗增殖與生根培養(yǎng)研究[J]. 天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2019， 26（4）： 38-42， 48.

[17] 孔祥生， 張妙霞， 陳明燦. 生長素類物質(zhì)對(duì)甘薯莖尖分生組織培養(yǎng)成苗的影響[J]. 山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)， 2003， 22（2）： 114-116.

[18] 周索， 李景照. 不同類型生長素及濃度對(duì)翠菊葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響[J]. 鄭州師范教育， 2012， 1（4）： 52-53.

[19] 李琴， 江千濤， 魏育明， 等. 生長素對(duì)小麥幼胚組織培養(yǎng)的影響[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2006， 19（5）： 806-810.

[20] 苗博瑛， 劉艷軍， 楊靜慧. 黑莓松散型胚性愈傷組織的誘導(dǎo)[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2014， 42（3）： 209-212， 216.

[21] 呂國昊， 趙杰堂. 植物組織培養(yǎng)中褐化現(xiàn)象的控制措施[J]. 農(nóng)村經(jīng)濟(jì)與科技， 2021， 32（13）： 50-52.

[22] 亓崢， 龐志強(qiáng)， 藍(lán)增全. 云南小葉種茶樹葉片和莖段愈傷組織誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)[J]. 科學(xué)技術(shù)與工程， 2020， 20（18）： 7206-7212.