田祥瑞 徐夢(mèng)彬 王飛 葉凌鳳

摘要：千金子是稻田一年生禾本科惡性雜草，已成為威脅水稻生產(chǎn)的優(yōu)勢種群。采用Illumina HiSeq測序及生物信息分析方法對(duì)千金子葉綠體全基因組序列進(jìn)行測定、組裝、注釋和解析。結(jié)果表明，千金子葉綠體基因組全長為135 656 bp，GC含量為38.26%，呈現(xiàn)典型的禾本科植物葉綠體基因組的4段閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)；其中，大單拷貝區(qū)80 843 bp，小單拷貝區(qū)12 768 bp，反向重復(fù)區(qū)42 045 bp；通過功能富集，共獲得注釋基因131個(gè)，包括84個(gè)蛋白編碼基因、39個(gè)tRNA基因和8個(gè)rRNA基因；另外，還檢測到49條簡單重復(fù)序列（SSR）和46條長度大于20 bp的重復(fù)序列。利用IQTREE軟件，基于葉綠體基因組以粳稻為外群構(gòu)建了25種禾本科雜草的系統(tǒng)進(jìn)化樹，顯示出千金子與真穗草屬、虎尾草屬和狗牙根屬雜草具有相對(duì)較近的親緣關(guān)系，而3種稗屬雜草則與水稻的親緣關(guān)系更近。本研究結(jié)果可為千金子的精準(zhǔn)識(shí)別和分子進(jìn)化解析提供理論借鑒。

關(guān)鍵詞：千金子；葉綠體基因組；結(jié)構(gòu)特征；功能基因注釋；SSR；系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

中圖分類號(hào)：S451 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1003-935X（2022）02-0006-09

Structure and Characterization Analysis of Chloroplast Genome of Leptochloa chinensis

TIAN Xiang-rui，XU Meng-bin，WANG Fei，YE Ling-feng

（Institete of Mordern Agriculture，Jiangsu Provincial Agricultural Reclamation and Development Corporation，Nanjing 210031）

Abstract：Leptochloa chinensis （L.） Nees is an annual gramineousmalignant weed in rice field，which has become a dominant weed population threatening rice production.In this study，Illumina HiSeq sequencing and bioinformatics analysis methods were used to determine，assemble，annotate and analyze the whole chloroplast genome sequence of L.chinensis. The results indicated that the full length of L. chinensis chloroplast genome was 135 656 bp and the content of GC was 38.26%，showing a typical four segment closed ring structure of chloroplast genome of gramineous plants；among them，the large single copy region was 80 843 bp，the small single copy region was 12 768 bp，and the inverted repeat region was 42 045 bp；through functional enrichment，131 annotated genes were obtained，including 84 protein encoding genes，39 tRNA genes and 8 rRNA genes；in addition，49 simple sequence repeats （SSRs） and 46 repeats longer than 20 bp were detected. Using IQTREE software，the phylogenetic tree of 25 weeds was constructed based on chloroplast genomes and japonica rice as outgroup；it showed that there were relatively close relationships among L. chinensis，Eustachys，Chloris and Cynodon，while 3 Echinochloa weeds were more closely relatedtorice.ThisstudyprovidesatheoreticalreferencefortheaccurateidentificationandmolecularevolutionanalysisofL.

收稿日期：2022-03-28

基金項(xiàng)目：江蘇省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：BE2019396）；江蘇省“雙創(chuàng)博士”及南京市留學(xué)人員科技創(chuàng)新計(jì)劃。

作者簡介：田祥瑞（1989—），男，河南新鄉(xiāng)人，博士，農(nóng)藝師，主要從事作物有害生物綜合治理技術(shù)研究。E-mail：635369028@qq.com。

chinensis.

Key words：Leptochloa chinensis；chloroplast genome；characterization；gene function annotation；SSR；phylogenetic tree

千金子［Leptochloa chinensis （L.） Nees］為稻田一年生禾本科惡性雜草，21世紀(jì)以來，伴隨少免耕栽培模式及直播水稻的大面積推廣，千金子在我國南方稻田迅速蔓延^［1］。加之生產(chǎn)上長期使用氰氟草酯進(jìn)行莖葉處理，缺乏合理的藥劑輪換，國內(nèi)已發(fā)現(xiàn)多個(gè)千金子田間種群對(duì)氰氟草酯產(chǎn)生了不同水平的抗藥性^［2］。生產(chǎn)上氰氟草酯的用藥量逐年遞增，防除難度越來越大，已演變成影響水稻生產(chǎn)的優(yōu)勢雜草之一，嚴(yán)重威脅糧食安全。當(dāng)前，對(duì)千金子的研究集中于發(fā)生規(guī)律、化除技術(shù)、抗性機(jī)制等方面，在利用高通量測序技術(shù)獲得的225個(gè)植物基因組中，有32個(gè)屬于禾本科植物，其中包括4種禾本科雜草^［3］，已報(bào)道轉(zhuǎn)錄組測序的雜草有菵草^［4］、稗草^［5］、牛筋草^［6］、雜草稻^［7］等。由于千金子的全基因組和轉(zhuǎn)錄組序列尚未公布，其遺傳背景和系統(tǒng)進(jìn)化等方面的研究仍需加強(qiáng)。

葉綠體基因組（cpDNA）為雙鏈環(huán)狀分子，是母系單親遺傳細(xì)胞器DNA，其序列和結(jié)構(gòu)保持相對(duì)穩(wěn)定保守，極少發(fā)生基因重復(fù)，易于提取、凈化、測序。葉綠體rbcL、matK、trnH-psbA基因與核基因ITS片段相結(jié)合，被推薦作為高等植物的DNA條形碼^［8］。葉綠體基因組簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）特異性、重現(xiàn)性較高，成為分析遺傳多樣性和物種起源和演化的重要標(biāo)記^［9］；葉綠體基因組單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）突變較為豐富，測序結(jié)果可直接用于生物統(tǒng)計(jì)和遺傳分型?；诙鄻踊姆肿訕?biāo)記技術(shù)，葉綠體基因組序列已被廣泛應(yīng)用于植物遺傳進(jìn)化、親緣關(guān)系及分類鑒定研究，如大田作物^［10-12］、水果花卉^［13-15］、茶葉^［16］、藥用植物^［17-18］、瀕危樹種^［19-20］等。

禾本科植物的葉綠體基因序列長度在115～150 kb之間，水稻、小大麥、高粱等主要作物的葉綠體基因組序列陸續(xù)在NCBI公布^［21］。在國內(nèi)的雜草葉綠體研究中，利用稗草葉綠體基因組trna-b1及psbA標(biāo)記可將稗屬材料分為4個(gè)大類^［22］；雜草稻的葉綠體基因組序列具有顯著多態(tài)性^［23］；在雜草稻葉綠體基因組中發(fā)現(xiàn)了1 020個(gè)SNP位點(diǎn)，新開發(fā)trnG-trnfM、psbM-trnC及trnT-trnL等3對(duì)葉綠體分子標(biāo)記^［24］；另外，山羊草^［25］、鼠尾草^［26］的葉綠體基因組也被測序組裝和注釋分析。本研究采用Illumina HiSeq測序及生物信息分析方法，對(duì)千金子的葉綠體基因組序列及結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析，以期為千金子的精準(zhǔn)識(shí)別鑒定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 葉綠體基因組的提取與測序

千金子整株雜草于2020年7月采集于江蘇省黃海農(nóng)場水直播稻田（34°15′3″N，119°58′15″E），在運(yùn)輸過程中用濕潤的脫脂棉裹住根系以保證雜草活力；到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后將樣品洗凈晾干，剪取葉片作為高通量測序樣品置于液氮中冷凍保存。采用MagMAX植物 DNA 試劑盒（Thermo Fisher）對(duì)千金子葉片進(jìn)行基因組DNA的提取與純化，樣品送蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行高通量測序。

采用Illumina HiSeq測序儀進(jìn)行基因組De Novo測序，采用VAHTS Universal DNA Library Prep Kit for Illumina 試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建。具體過程如下：200 ng gDNA用超聲波破碎儀（Covaris S220）隨機(jī)打斷成小于500 bp的片段，然后通過End Prep Enzyme Mix進(jìn)行末端修復(fù)，兩端加測序接頭。再使用VAHTSTM DNA Clean Beads純化470 bp左右的片段，最后用P5和P7引物進(jìn)行擴(kuò)增。使用Qsep100 （Bioptic）儀器檢測文庫質(zhì)量，并且通過Qubit 3.0檢測文庫濃度。DNA文庫混合后，按 Illumina NovaSeq儀器使用說明書進(jìn)行2×150 bp雙端測序，由NovaSeq自帶的NovaSeq Control Software （NCS） + OLB + GAPipeline-1.6軟件讀取序列信息。

1.2 葉綠體基因組的組裝與注釋

測序的Reads數(shù)據(jù)通過質(zhì)量控制后，采用velvet軟件進(jìn)行組裝和拼接，使用SSPACE及GapFiller軟件進(jìn)行缺口補(bǔ)洞和修正。采用GoSeq軟件尋找編碼基因，使用tRNAscan-SE程序和檢測轉(zhuǎn)移RNA（tRNAs）、RNAmmer程序鑒定核糖體RNA（rRNA）。利用NCBI中的BLAST程序?qū)⑶Ы鹱尤~綠體基因組序列與核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)注釋，采用GO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因功能富集分析、KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因通路富集分析。將組裝注釋完成的千金子葉綠體全基因組序列通過BankIt路徑上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫。

1.3 SSR與重復(fù)序列的預(yù)測分析

利用在線軟件MISA（http：//webblast.ipk-gatersleben.de/misa/index.php）分析鑒定千金子葉綠體全基因組的簡單重復(fù)序列，設(shè)定最小重復(fù)次數(shù)：單核苷酸≥10，二核苷酸≥6，三核苷酸≥5，四核苷酸≥3，五核苷酸≥3，六核苷酸≥3；使用在線程序REPuter（http：//bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/reputer）對(duì)千金子葉綠體基因組中的正向重復(fù)（forward repeats）、反向重復(fù)（reverse repeats）、互補(bǔ)重復(fù)（complement repeats）及回文重復(fù)（palindromic repeats）等4種重復(fù)序列進(jìn)行分析，設(shè)置最小重復(fù)（minimal repeat size）值為20、海明距離（hamming distance）值為3。

1.4 禾本科雜草的系統(tǒng)進(jìn)化分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫中選取25種禾本科雜草的葉綠體基因組序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。通過MAFFT軟件將序列矩陣對(duì)齊；經(jīng)過檢驗(yàn)和校正后，將對(duì)齊后的序列導(dǎo)入IQTREE軟件，以粳稻葉綠體基因組全序列作為外群，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，使用嵌入式超快引導(dǎo)方法（UFBoot）估計(jì)節(jié)點(diǎn)支持值。

2 結(jié)果與分析

2.1 千金子葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)特征

千金子葉綠體基因組序列全長為135 656 bp，GC含量為38.26%，將序列上傳至GenBank，獲得登錄號(hào)MZ901215。該基因組呈現(xiàn)典型的4段閉合環(huán)狀DNA結(jié)構(gòu)（圖1），其中，大單拷貝區(qū)（LSC）長度為80 843 bp，GC含量為36.17%；小單拷貝區(qū)（SSC）長度為12 768 bp，GC含量為32.40%；反向重復(fù)區(qū)A（IRA）長度為21 022 bp，GC含量為44.02%；反向重復(fù)區(qū)B（IRB）長度為21 023 bp，GC含量為44.03%（表1）；2個(gè)反向重復(fù)區(qū)結(jié)構(gòu)對(duì)稱、方向相反，被大、小單拷貝區(qū)隔開。

2.2 千金子葉綠體基因組的功能基因注釋

千金子葉綠體基因組共有131個(gè)基因，包括89個(gè)單拷貝基因和21個(gè)雙拷貝基因。其中，蛋白編碼基因（PCG）總計(jì)84個(gè)，編碼區(qū)堿基總長度 55 851 bp，最短基因長度91 bp，最長基因長度 4 538 bp，編碼基因的平均序列長度725 bp，GC比例為38.91%。非編碼ncRNA總計(jì)47個(gè)，包括核糖體RNA（rRNA）8個(gè)，轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）39個(gè)；LSC區(qū)域有82個(gè)基因，包括58個(gè)PCG和24個(gè)tRNA；SSC區(qū)域有38個(gè)基因，包括37個(gè)PCG和1個(gè)tRNA；IRA及IRB區(qū)域的基因序列相同、對(duì)稱分布，共有19個(gè)雙拷貝基因，包括8個(gè)雙拷貝PCG（rps19、rpl2、rpl23、ndhB、rps7、rps12、ycf68、rps15），7個(gè)雙拷貝tRNA（trnL-CAU、trnL-CAA、trnV-GAC、trnL-GAU、trnA-UGC、trnR-ACG、trnN-GUU）和全部4個(gè)雙拷貝rRNA（rrn16、rrn4.5、rrn23、rrn5）。

利用GO、KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因功能注釋（表2），光合作用有關(guān)基因（光系統(tǒng)、細(xì)胞色素b/f復(fù)合物、ATP合成酶、NADH還原酶、RubisCO大亞基）富集到46個(gè)，自我復(fù)制有關(guān)基因（RNA聚合酶、核糖體亞基、rRNA、tRNA）富集到78個(gè)，生物合成有關(guān)基因（成熟酶、蛋白酶、包裹膜蛋白、C型細(xì)胞色素合成基因、轉(zhuǎn)錄起始因子）富集到5個(gè)（matK、chpP、cemA、ccsa、infA），未知功能基因是雙拷貝的葉綠體假基因ycf68。

2.3 千金子葉綠體基因組的SSR及重復(fù)序列分析

通過設(shè)置不同長度基序的最小重復(fù)次數(shù)，由表3可知，在千金子葉綠體基因組中發(fā)現(xiàn)簡單重復(fù)序列49個(gè)。其中，單核苷酸重復(fù)為37個(gè)，占比75.51%，基序A（n）、C（n）、G（n）、T（n）的SSR重復(fù)分別為17、2、1、17個(gè)；二核苷酸重復(fù)為2個(gè)，AT（6）和TA（6）重復(fù)1次；無三核苷酸重復(fù)；四核苷酸重復(fù)為8個(gè)，占比16.33%，基序AACG（3）、AATA（3）、AGAA（3）、ATAC（4）、GTAG（5）、TCGT（3）、TTCT（3）、TTTA（3）重復(fù)1次；五核苷酸重復(fù)為2個(gè)，AAAGT（3）、TTTCTA（3）重復(fù)1次。

通過設(shè)置序列最小長度，在千金子葉綠體基因組中發(fā)現(xiàn)46條長度大于20 bp的重復(fù)序列，其中有正向重復(fù)25個(gè)，回文重復(fù)21個(gè)，無正向重復(fù)和互補(bǔ)重復(fù)（表4）；最長的重復(fù)序列大小為52 bp，分別位于trnN-GUU-ycf1、rps15-ycf1和rps18；最短重復(fù)序列大小為29 bp，位于trnS-UGA和trnS-GCU；有5條重復(fù)序列分別位于ycf3*、ndhB*的內(nèi)含子中。

2.4 基于葉綠體基因組的禾本科雜草系統(tǒng)發(fā)育分析

基于25種禾本科雜草的葉綠體基因組全序列，以粳稻葉綠體基因組作為外群構(gòu)建進(jìn)化樹（圖2），其中22種禾本科雜草聚為一個(gè)大支，稗（E. crusgalli）、稗原變種（E. crusgalli var. crusgalli）以及細(xì)葉旱稗（E.crusgalli var. praticola）等3種稗屬雜草單獨(dú)聚為一小支。22種禾本科雜草的大支分為2個(gè)分支，第1分支由千金子屬（L. chinensis、L. virgata、L. pluriflora）、真穗草屬（E. glauca）、虎尾草屬（C. virgata、C.barbata）、狗牙根屬（C. dactylon）聚成的分支，三齒稃草屬（T. basedowii、T. scintillans、T. lanigera、T. vanleeuwenii、T. concinna）、固沙草屬（O. kokonoricus）、鋒芒草屬（T. australianus）聚成的分支，以及結(jié)縷草屬（Z. japonic、Z. tenuifolia、Z. matrella）的分支組成；第2分支由香根草屬（H. macra）和蘆葦屬（P. australis）的小支、鷓鴣草屬（E. major、E. obtuse）的小支以及小麗草屬（C. africana）聚成。從親緣關(guān)系來看，千金子與真穗草屬、虎尾草屬和狗牙根屬雜草具有相對(duì)較近的親緣關(guān)系，而稗屬雜草則與水稻的親緣關(guān)系更近。

3 討論與結(jié)論

禾本科植物的葉綠體基因組一般呈現(xiàn)閉合環(huán)狀DNA結(jié)構(gòu)，已公布的禾本科作物的葉綠體基因組大小在115～150 kb之間，GC含量均在37.1%～38.9%之間，大單拷貝區(qū)長度約80 kb，小單拷貝區(qū)長度約13 kb，每個(gè)反向重復(fù)區(qū)長度約20 kb，蛋白編碼基因與tRNA的種類和數(shù)量存在物種間差異，而rRNA的種類和數(shù)量在物種間保持相對(duì)穩(wěn)定^［21］。水稻葉綠體基因組為134 525 bp（NC_008155），注釋基因162個(gè)；稻田惡性雜草水田稗的葉綠體基因?yàn)?39 891 bp，大單拷貝區(qū)長 82 108 bp，小單拷貝區(qū)長13 205 bp，反向重復(fù)區(qū)長44 578 bp，注釋基因131個(gè)，包含雙拷貝基因19個(gè)^［22］。本研究測序組裝的千金子葉綠體基因組序列長度為135 656 bp，大單拷貝區(qū)長 80 843 bp，小單拷貝區(qū)長12 768 bp，反向重復(fù)區(qū)長42 045 bp，共有基因131個(gè)，包括84個(gè)蛋白編碼基因、39個(gè)tRNA基因和8個(gè)rRNA基因；其雙鏈閉環(huán)結(jié)構(gòu)與經(jīng)典的葉綠體結(jié)構(gòu)相吻合，大、小單拷貝區(qū)，反向重復(fù)區(qū)的序列長度符合禾本科植物相關(guān)特點(diǎn)，注釋基因數(shù)量、雙拷貝基因數(shù)與稗草相似，補(bǔ)充了我國稻田重要惡性雜草的關(guān)鍵基因信息。

對(duì)于葉綠體基因組的編碼基因及功能方面，禾本科植物之間具有較小差異。與光合作用有關(guān)的ycf1、ycf2被發(fā)現(xiàn)在部分禾本科植物中逐漸退化^［27］，本研究同樣沒有在千金子中發(fā)現(xiàn)。與乙酰輔酶A羧化酶合成有關(guān)的accD基因在水稻中存在，而在小大麥、玉米、高粱及黑麥中發(fā)生退化缺失^［28］，本研究也發(fā)現(xiàn)accD的缺失現(xiàn)象；千金子葉綠體4個(gè)rRNA的種類與主要禾本科作物、稗草完全一致，也顯示出rRNA在禾本科植物中的高度保守性。本研究檢測的49個(gè)SSR基序和46條重復(fù)序列，提供了獨(dú)特的千金子DNA識(shí)別信息，將為開發(fā)葉綠體分子標(biāo)記提供依據(jù)。

葉綠體基因組多為直系同源，對(duì)揭示植物進(jìn)化及親緣關(guān)系具有重要作用。馮克偉利用禾本科葉綠體全基因組序列揭示了不同亞科、不同物種間的親緣關(guān)系，證實(shí)竹亞科與早熟禾亞科相對(duì)稻亞科更近^［29］。林張翔利用稗屬葉綠體基因組序列的進(jìn)化分析推算稗屬與稷屬的分化約在21.6百萬年前，水田稗與稗在3.3百萬年前發(fā)生分化^［22］。朱國忠等對(duì)13份栽培稻和野生稻的葉綠體基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)不同秈粳類型的栽培稻和野生稻分別被聚類到相應(yīng)類群的雜草稻中^［24］。本研究首次基于葉綠體基因組對(duì)25種禾本科雜草的系統(tǒng)進(jìn)化及親緣關(guān)系進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)稗屬雜草與水稻親緣關(guān)系較近，千金子屬、真穗草屬、虎尾草、狗牙根屬親緣關(guān)系較近，三齒稃草屬、固沙草屬、鋒芒草屬、結(jié)縷草屬親緣關(guān)系較近，香根草屬、鷓鴣草屬、小麗草屬親緣關(guān)系較近，該結(jié)果與傳統(tǒng)的禾本科植物形態(tài)分類學(xué)相對(duì)應(yīng)，成為研究禾本科雜草系統(tǒng)發(fā)育和演化的科學(xué)參考。

千金子作為重要的稻田惡性雜草，在水稻生長前期進(jìn)行土壤封閉和苗后早期進(jìn)行莖葉處理可以控制其危害^［30］。因此，早期精準(zhǔn)識(shí)別是提高藥劑化學(xué)除草效果的重要前提，而目前生產(chǎn)上對(duì)千金子的早期鑒定僅依賴于形態(tài)學(xué)識(shí)別，存在一定的局限性，本研究解析的千金子葉綠體基因組結(jié)構(gòu)與特征，將為千金子的精準(zhǔn)鑒定和分子進(jìn)化解析提供理論借鑒。

致謝：感謝江蘇省農(nóng)墾農(nóng)業(yè)發(fā)展股份有限公司黃海分公司孫文忠書記、蘇墾農(nóng)發(fā)黃海分公司董夢(mèng)雅主任對(duì)千金子田間樣品采集的幫助。

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