蔣 偉 盧麗麗 包麗仙 李秀芬，2 楊紹英，3 楊榮凱 楊美青 李先平*

（1 云南省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所，云南昆明 650205；2 云南省文山州硯山縣八嘎鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)綜合服務中心，云南文山 663109；3 云南省玉溪市峨山縣化念鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村綜合服務中心，云南玉溪 653203；4 云南省德宏州盈江縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，云南德宏 679300；5 包頭醫(yī)學院藥學院，內(nèi)蒙古包頭 014040）

病毒病是危害馬鈴薯健康生產(chǎn)的重要病害，特別是馬鈴薯Y 病毒（potato virus Y，PVY）。馬鈴薯感染PVY 后一般減產(chǎn)50%左右，當其與馬鈴薯X 病毒（PVX）或馬鈴薯A 病毒（PVA）復合侵染時，減產(chǎn)可達80%。PVY 不僅能降低馬鈴薯的產(chǎn)量，還嚴重影響馬鈴薯的品質(zhì)，是種薯退化的主要原因（Wang et al.，2011；沈林林 等，2016）。馬鈴薯抗病毒育種能有效控制病毒病對馬鈴薯的危害，是解決馬鈴薯病毒病危害、促進馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的有效手段（Solomon-Blackburn &Barker，2001a；王曉明 等，2005）。病毒的進化速度比較快，已被鑒定命名的PVY 株系至少有7 類（Singh et al.，2008）。隨著馬鈴薯抗病毒基因的克隆及抗性遺傳研究發(fā)展，開發(fā)分子標記篩選及聚合多個抗性基因的馬鈴薯種質(zhì)已成為一種有效的育種策略（Solomon-Blackburn &Barker，2001b；聶碧華，2010）。通過傳統(tǒng)育種方法將多個抗不同病毒或其他病害的抗性基因聚合到一個馬鈴薯品種中是非常困難且非常耗時的，分子生物學技術(shù)（如分子標記輔助育種）的運用可以大大縮短育種進程，快速有效地融合多個目標性狀（Solomon-Blackburn &Barker，2001b）。

目前已發(fā)現(xiàn)3 個馬鈴薯Y 病毒抗性基因Ry（Munoz et al.，1975）、Ry（Cockerham，1943）和Ry（Asama et al.，1982），能 夠 對PVY 所 有生理小種產(chǎn)生極端抗性。為了檢測馬鈴薯資源中是否含有這些抗性基因，已開發(fā)多個分子標記用于抗病毒馬鈴薯品種分子輔助育種，其中ADG2BbvI、RYSC3 和RYSC4 用于檢測抗性基因Ry（H?m?l?inen et al.，1998；Sorri et al.，1999；Kasai et al.，2000；劉程 等，2021）。因RYSC3 只需要一次PCR 而且準確率高，被廣泛用于Ry的 檢測（Kasai et al.，2000；Ottoman et al.，2009；Ortega &Lopez-Vizcon，2012；Fulladolsa et al.，2015）。SSR 標 記STM0003（Song et al.，2005）和STS 標記YES3-3A、YES3-3B（Song &Schwarzfischer，2008）用于檢測Ry。YES3-3A可以有效地檢測馬鈴薯品種Barbara 及其后代的PVY 極端抗性（Nie et al.，2016）。分子標記Ry186和Ry364 用于檢測Ry極端抗性（Hosaka et al.，2001；Mori et al.，2011）。

分子標記輔助育種在發(fā)達國家的抗病毒育種中開展比較早且研究比較深入。如Whitworth 等（2009）利用分子標記RYSC3、RYSC4 和ADG2成功鑒定了抗PVY 的親本來源，同時準確鑒定出后代分離群體中具極端抗性的個體，加速了抗性品種的篩選并為下一步育種親本的選擇提供了重要的參考。Fulladolsa 等（2015）利用與PVY 抗性基因Ry和Ry緊密連鎖的分子標記RYSC3 和YES3-3B 從46 個品種和品系中鑒定出19 個抗性株系。我國在馬鈴薯病毒病抗性資源分子育種方面起步較晚且報道較少。趙興濤（2012）利用RYSC3 對國內(nèi)190 個主要育成品種和699 個國外引進育種資源進行快速鑒定，發(fā)現(xiàn)國內(nèi)品種中22 個品種、國外引進資源中202 份資源含有Ry。白磊和郭華春（2017）利用RYSC3 對140 份馬鈴薯資源進行檢測，發(fā)現(xiàn)28 份資源中含有Ry。綜上可知，RYSC3 和YES3-3A 廣泛用于Ry和Ry的檢測。為了進一步驗證這2 個分子標記的準確性和篩選可利用的抗性資源材料，本試驗以云南省農(nóng)業(yè)科學院從美國引進的親本含有Ry或（和）Ry基因的9 個薯條加工型雜交組合為試驗對象，利用RYSC3和YES3-3A 篩選含有Ry和Ry的抗性資源，并通過人工接種PVY 來驗證分子標記預測的準確性，同時結(jié)合田間表現(xiàn)，開展連續(xù)兩年的產(chǎn)量評價，篩選具有PVY 抗性且產(chǎn)量高的材料作為薯條加工型馬鈴薯品種選育的親本材料或候選品種。

1 材料與方法

1.1 材料來源和種植

供試材料為云南省農(nóng)業(yè)科學院引自美國的9 個薯條加工型馬鈴薯雜交組合，這些雜交組合至少有1 個親本含有PVY 抗性基因（表1），共包含852個株系。2018 年3 月26 日，在云南省農(nóng)業(yè)科學院嵩明科研基地溫室內(nèi)，將實生種子播種在育苗盤內(nèi)，4 月24 日移栽到16 cm × 14 cm 的花盆中，期間進行正常的水肥管理。1 個月后采集新鮮的葉片提取DNA，用于后續(xù)抗性基因分子標記的檢測。同年8 月，單株收獲作為后續(xù)人工接種PVY 評價和田間評價的材料。

表1 從美國引進的薯條加工型馬鈴薯雜交組合信息

1.2 分子標記鑒定供試材料的PVY 抗性

采用新型植物基因組DNA 提取試劑盒〔天根生化科技（北京）有限公司〕提取供試樣品基因組DNA，通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 質(zhì)量。檢測抗性基因Ry的分子標記采用RYSC3，其引物序列為正向5′ATACACTCATCTAAATTTGATGG 3′，反向5′AGGATATACGGCATCATTTTTCCGA 3′，產(chǎn)物大小為321 bp（Kasai et al.，2000）。檢測抗性基因Ry的分子標記采用YES3-3A，其引物序列為正向5′TAACTCAAGCGGAATAACCC 3′，反向5′AATTCACCTGTTTACATGCTTCTTGTG 3′，產(chǎn)物大小為341 bp（Song &Schwarzfischer，2008）。PCR 擴增體系為15 μL，包括2×PCR 預混試劑7.5 μL，正反向引物各0.3 μmol·L，DNA 模板為10 ng，用雙蒸水補齊至15 μL。PCR 擴增后的產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.3 PVY 接種鑒定驗證供試材料的PVY 抗性

Ry和Ry對所有PVY 株系都具有抗性，為了驗證分子標記檢測結(jié)果的準確性，選取179 份材料進行PVY 人工接種，接種毒株為PVY型，檢測病毒侵染情況。2019 年3 月，在云南省農(nóng)業(yè)科學院嵩明基地溫室內(nèi)種植待接種材料，每份材料播種3 盆，以感病品種底希瑞（Desiree）作為陽性對照。待馬鈴薯幼苗具有4～5 片真葉時，采用人工機械摩擦方法接種。接種緩沖液為0.1 mol·L磷酸緩沖液，pH 為7。采集PVY毒株葉片10～15 g，加入20～30 mL 磷酸緩沖液，在研缽中充分研磨，用紗布過濾研磨的汁液。在待接種材料的第4 片展平的真葉表面撒上金剛砂（600 目），用棉簽蘸取毒株汁液在葉片表面來回涂抹。接種3 周后開始取樣，取接種植株新生葉片3～4 片，放于自封袋中于-80 ℃保存。待所有樣品采集完后，進行DASELISA 血清學檢測。

1.4 供試材料田間產(chǎn)量評價

將檢測含有抗性基因分子標記的材料于2019、2020 年3—10月連續(xù)兩年種植在云南會澤縣駕車鄉(xiāng)鋼廠村（25°52′2.88″N，103°18′12.80″E）進行田間產(chǎn)量評價。每份材料種植5 株，株距30 cm、行距60 cm。種植期間進行正常田間管理。收獲時統(tǒng)計收獲株數(shù)、薯塊數(shù)目，并稱重。利用Excel 進行數(shù)據(jù)整理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子標記鑒定供試材料的PVY 抗性結(jié)果

馬鈴薯PVY 抗性基因Ry連鎖分子標記RYSC3 和Ry連鎖分子標記YES3-3A 的PCR擴增條帶如圖1 所示。由表2 可知，4 個雜交組合后代中163 個株系含有分子標記RYSC3，占比19.13%，分別是A07748（40 個株系，占比48.19%）、A08465（32個株系，占比53.33%）、A11784（30 個株系，占比62.50%）和A12340（61個株系，占比50.00%）；7 個雜交組合后代中330個株系含有分子標記YES3-3A，占比38.73%，分別是A07781（54 個株系，占比43.20%）、A08419（16個株系，占比59.26%）、A08474（44 個株系，占比51.76%）、A11783（47 個株系，占比40.17%）、A11784（25 個株系，占比52.08%）、A12312（94個株系，占比50.81%）和A12340（53 個株系，占比43.44%）。其中A11784 和A12340 后代中共42個株系同時檢測到2 種分子標記。

圖1 雜交組合A12340 后代中不同株系分子標記RYSC3 和YES3-3A 檢測結(jié)果

表2 9 個雜交組合后代中檢出RYSC3、YES3-3A 分子標記的株系數(shù)目及比例

2.2 PVY 接種鑒定與分子標記預測綜合分析

共接種鑒定179 個株系，其中165 個株系含有基因連鎖分子標記，14 個株系不含分子標記（表3）。結(jié)合ELISA 檢測PVY 接種株系的結(jié)果進行綜合分析，9 個雜交組合中陽性預測率（即含有基因連鎖標記的株系中，通過接種鑒定確定具有PVY 抗性株系的概率）為80.00%～100.00%，A11784 的陽性預測率最低，為80.00%，A08419、A08465、A08474 和A12340 的陽性預測率最高，達到100.00%；9 個雜交組合平均陽性預測率為92.73%。陰性預測率（即不含有基因連鎖標記的株系中，通過接種鑒定確定不具有PVY 抗性株系 的概 率）為0～100.00%，A07748、A07781、A08474、A11784 和A12340 后代中經(jīng)檢測不含抗性標記的株系，但接種鑒定表現(xiàn)為抗病，故陰性預測率為0；A08465 和A11783 后代中經(jīng)檢測不含抗性標記的株系，接種鑒定均表現(xiàn)為感病，陰性預測率為100.00%；8 個雜交組合（未取A08419 后代中不含抗性標記的株系進行接種鑒定）平均陰性預測率為28.57%。

表3 9 個雜交組合后代接種鑒定材料及結(jié)果分析

2.3 田間產(chǎn)量評價

對372 份含有抗性基因分子標記的材料進行兩年的產(chǎn)量評價，結(jié)果表明（表4），這些材料平均單株結(jié)薯數(shù)為4.11 ± 2.34 個，變幅為0.25～17.30 個，變異系數(shù)為0.57；平均單株產(chǎn)量為0.31 ± 0.21 kg，變幅為0.01～1.47 kg，變異系數(shù)為0.68。A11783平均單株結(jié)薯數(shù)最多（5.26 ± 2.44 個），A08419平均單株結(jié)薯數(shù)最少（3.28 ± 1.53 個）；A08465（0.35 ± 0.29 kg）、A11783（0.35 ± 0.24 kg）和A12340（0.35 ± 0.23 kg）平均單株產(chǎn)量較高，A08474 平均單株產(chǎn)量最低（0.27 ± 0.19 kg）。根據(jù)單株產(chǎn)量及兩年產(chǎn)量的穩(wěn)定性（變異系數(shù)），篩選出10 份產(chǎn)量高、變異系數(shù)小的株系材料作為候選品種或親本材料（表5），即A11784-7、A12340-6、A12340-7、A11784-37、A12312-53、A12340-41、A08474-58、A11783-108、A12312-55和A11784-29。

表4 9 個雜交組合后代單株結(jié)薯數(shù)和產(chǎn)量

表5 篩選獲得的10 份薯條加工型馬鈴薯材料產(chǎn)量相關指標

3 討論與結(jié)論

利用分子標記篩選具有PVY 抗性的馬鈴薯資源，可以在馬鈴薯品種選育的早期快速篩選到攜帶PVY 抗性基因的雜交組合后代，為抗病育種提供優(yōu)良的材料。本試驗以引自美國的薯條加工型馬鈴薯雜交組合后代為試材，并結(jié)合其親本PVY 抗性基因信息，通過對抗性基因連鎖的分子標記篩選，在品種選育早期選擇含有PVY 抗性的后代進一步篩選。研究結(jié)果表明，結(jié)合親本譜系信息，分子標記篩選的效率更高（Slater et al.，2014），如雜交組合A11784 和A12340，其雙親含有2 種抗性基因Ry和Ry，所以在其42 個后代株系中檢測到2種分子標記。

PVY 抗性由單個顯性基因控制（Fulladolsa et al.，2015），且基因位于著絲粒遠端（H?m?l?inen et al.，1998；Song &Schwarzfischer，2008）。由于檢測的雜交組合為同源四倍體，染色單體分離過程更加復雜，如基因與著絲粒之間發(fā)生交叉（Elison et al.，2020）。因此，檢測的雜交組合A11784 后代 中RYSC3+∶RYSC3-和A07781、A11783、A12340 后代中YES3-3A+∶YES3-3A-的分離比偏離1∶1（表2）。理想的分子標記應該與目的性狀精準匹配，但是目前植物育種中所使用的大部分分子標記都不理想（Park et al.，2018）。RYSC3 和YES3-3A 是檢測PVY 抗性基因Ry和Ry常用的分子標記，本試驗檢測的9 個雜交組合中有4 個組合分子標記篩選攜帶抗PVY 基因，與人工接種鑒定結(jié)果100%吻合，其余5 個組合出現(xiàn)不同比例假陽性預測結(jié)果（表3），可能是由于基因與分子標記發(fā)生了重組，而71.43%未攜帶標記的株系表現(xiàn)出抗病性狀即假陰性。Ottoman 等（2009）的研究結(jié)果表明，接種后取樣時間對檢測結(jié)果影響比較大，接種后20 d 取樣檢測，僅46%的樣本兩種檢測結(jié)果相對應，即含有抗性基因分子標記的樣本ELISA 檢測呈陰性，而不含有抗性基因分子標記的樣本ELISA 檢測呈陽性；接種后40 d 取樣檢測，86%的樣本在兩種檢測中表現(xiàn)一致。本試驗的取樣時間為接種后3 周（即21 d），因此，可能取樣時間偏早導致分子標記鑒定結(jié)果與人工接種后ELISA 鑒定結(jié)果偏差稍大。除此之外，本試驗對感病的判定標準較為嚴格，3 個重復中有1 個重復檢測出感病即判定該樣本不抗病，因此盡管Ry和Ry對所有PVY 株系都具有抗性，但仍有攜帶抗性標記的個體檢測出感病。本試驗共接種鑒定179個株系，其中含有分子標記的樣本（165 個）是不含有分子標記樣本數(shù)目（14 個）的近12 倍，且人工接種鑒定結(jié)果與分子標記結(jié)果一致的比例達到92.73%，即153 個樣本含有分子標記，同時也確實表現(xiàn)出抗病性，符合本試驗的設想，即可以通過分子標記篩選抗PVY 的材料。

產(chǎn)量評價中，9 個雜交組合后代的平均單株結(jié)薯數(shù)偏少，為3.28～5.26 個，平均單株產(chǎn)量偏低，為0.27～0.35 kg，且不同年份間產(chǎn)量變化比較大，平均變異系數(shù)分別為0.57 和0.68。究其原因主要為美國資源材料偏早熟且晚疫病抗性比較差，而云南大春生產(chǎn)季晚疫病高發(fā)，盡管田間管理時對晚疫病嚴格防控，但是部分株系仍在未達到最佳產(chǎn)量前死亡而導致減產(chǎn)或絕收。本試驗從372 個株系中篩選出10 份產(chǎn)量較高、抗性較好的資源材料，可為抗PVY 和薯條加工型馬鈴薯新品種選育提供優(yōu)良的親本材料。