楊澤麟，榮 曦，劉 紅

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年病學(xué)內(nèi)分泌代謝科，南寧 530021）

利拉魯肽是一種人胰高糖素樣肽-1（GLP-1）類似物，主要通過刺激胰島素分泌和降低胰高血糖素水平來降低血糖水平，臨床用于治療糖尿病[1]。研究發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽能夠穿越血腦屏障，促進(jìn)神經(jīng)元存活、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)神經(jīng)炎性反應(yīng)和應(yīng)激反應(yīng)，具有很強(qiáng)的抗炎及神經(jīng)保護(hù)作用；并且許多腦內(nèi)神經(jīng)元可分泌GLP-1[2]。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一個(gè)獨(dú)特的細(xì)胞群，它是一種多功能細(xì)胞，它與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的很多其他細(xì)胞相互作用，包括神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞。大量研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞不僅在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中扮演監(jiān)視者和旁觀者的角色，更是影響眾多疾病的決定因素，如阿爾茨海默?。ˋD）、帕金森?。≒D）、多發(fā)性硬化癥（MS）、肥胖癥[3-4]。而這些疾病的發(fā)生均與炎癥反應(yīng)密不可分，小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)慢性炎癥的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色[5]。脂多糖（LPS）是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的組成成分，由脂質(zhì)和多糖構(gòu)成，可以通過和宿主細(xì)胞表面的Toll 樣受體4（TLR4）結(jié)合發(fā)揮作用。當(dāng)LPS 與TLR4 結(jié)合時(shí)，其會(huì)通過銜接蛋白—髓樣分化因子88（MyD88）激活絲氨酸/蘇氨酸激酶這種IL-1 受體相關(guān)激酶（IRAK）。此外，它還會(huì)通過位于IRAK下游的銜接蛋白TRAF6刺激與炎癥反應(yīng)有關(guān)的NF-κB和MAP激酶家族等的活化作用，展現(xiàn)其轉(zhuǎn)錄活性[6]。本研究旨在通過LPS激活原代小膠質(zhì)細(xì)胞，模擬神經(jīng)炎癥反應(yīng)狀態(tài)，探索利拉魯肽發(fā)揮抗炎及神經(jīng)保護(hù)作用的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 DMEM 培養(yǎng)基（Gibco）；胎牛血清（Gibco）；胰蛋白酶（Solarbio）；D-Hanks（Meilunbio）；多聚-L-賴氨酸（Solarbio）；Dnase Ⅰ酶（Solarbio）；LPS（Solarbio）；Liraglutide（MCE）；TAK-242（MCE）；Annexin-V PI 細(xì)胞雙染凋亡檢測(cè)試劑盒（Bestbio）；兔抗IL-1β 單克隆抗體（abcam）；兔抗TNF-α單克隆抗體（abcam）；兔抗TLR4多克隆抗體（Bioss）；兔抗MyD88 多克隆抗體（Bioss）；兔抗TRAF6 多克隆抗體（Bioss）；兔抗GAPDH 單克隆抗體（abcam）；共聚焦顯微鏡（Nikon）。

1.2 原代小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)和提純 取出生1 d SD大鼠（SPF級(jí)），用75%酒精浸泡消毒后斷頭；剪開顱骨，取出腦組織置于預(yù)冷的D-Hanks 液中。剝離腦膜和血管，在冰上充分剪碎腦組織，加入0.25%胰蛋白酶，37 ℃水浴充分消化20 min。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，加入DnaseI酶去除粘性沉淀，1 000 r/min 離心5 min。棄上清后，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶中（培養(yǎng)瓶提前用多聚-L-賴氨酸包被，使用前PBS 沖洗3 遍），在含5%CO2的37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)7～9 d 后，培養(yǎng)瓶中形成混合細(xì)胞層，底部為星形膠質(zhì)細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞和少量少突膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)在星形膠質(zhì)細(xì)胞的頂端。采用手工拍打法分離小膠質(zhì)細(xì)胞，大力拍打培養(yǎng)瓶5～10 min，在顯微鏡下觀察到混合細(xì)胞層的上層細(xì)胞大部分脫落，收集上清，1 000 r/min離心5 min后棄上清，沉淀即為小膠質(zhì)細(xì)胞。用含2%胎牛血清的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，在含5%CO2的37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)[7]。

1.3 免疫熒光法鑒定原代小膠質(zhì)細(xì)胞 待細(xì)胞完全貼壁，棄除培養(yǎng)基，用PBS溶液洗滌2次；加入4%多聚甲醛室溫固定15 min，再洗滌3 次；使用0.25%Triton 破膜，37 ℃保存10 min 后，再洗滌3 次，封閉30 min。加入熒光一抗Iba-1溶液（1∶100），4 ℃孵育過夜；棄除一抗溶液，PBS洗滌3次；加入DAPI原液染核，避光孵育5 min，再洗滌3次；加入抗熒光淬滅劑封片，共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果。用Image J軟件定量分析3 個(gè)隨機(jī)視野中Iba-1 標(biāo)記的細(xì)胞占同一視野中細(xì)胞總數(shù)的百分比，即為小膠質(zhì)細(xì)胞的純度。

1.4 細(xì)胞分組及藥物干預(yù) 將提純后的小膠質(zhì)細(xì)胞隨機(jī)分為5組：空白對(duì)照（N）組、LPS組、利拉魯肽（Li）組、LPS+利拉魯肽（LL）組及LPS+TLR4抑制劑（LT）組。N 組不做任何處理，LPS 組用100 ng/mL LPS 干預(yù)24 h，Li 組用100 nmol/L 利拉魯肽干預(yù)24 h，LL 組用100 ng/mL LPS 干預(yù)24 h+100 nmol/L 利拉魯肽干預(yù)24 h，LT組用100 ng/mL LPS干預(yù)24 h+100 nmol/L TAK-242干預(yù)24 h。

1.5 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率 細(xì)胞用PBS 洗滌1次，加入0.25%胰酶消化，待細(xì)胞變圓且有部分細(xì)胞懸浮，即加入培養(yǎng)基終止消化。收集于EP 管中，1 500 r/min 離心5 min，棄上清。加入4 ℃預(yù)冷的PBS 完全重懸細(xì)胞，1 500 r/min 離心5 min，棄上清。沉淀用Binding Buffer 重懸。加入Propidium Iodide，混勻，室溫下避光反應(yīng)5～15 min,加入Annexin V-FITC。于1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。

1.6 蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blotting）檢測(cè)各蛋白的表達(dá)量 使用蛋白裂解液（按1∶100 加入PMSF）冰上裂解細(xì)胞至少30 min，再次超聲裂解細(xì)胞后，4 ℃、13 000 r/min離心15 min，取上清。BCA法測(cè)定蛋白濃度，加入上樣緩沖液，100 ℃水浴5 min，冷卻后-80 ℃保存。配置分離膠和濃縮膠，將蛋白樣品加入SDS-PAGE 膠，開始電泳。電泳完成后，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，室溫封閉1 h，再用1×TBST 溶液洗膜3 次，每次5 min。分別與IL-1β、TNF-α、TLR4、MyD88、TRAF6 一抗溶液（1∶1 000）孵育過夜，洗脫一抗后與山羊抗兔二抗溶液（1∶5 000）室溫孵育1 h，洗膜5 min×3次。LI-COR Odyssey Infrared Imaging System成像。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用單因素ANOVA 檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小膠質(zhì)細(xì)胞純度鑒定 免疫熒光法染色的小膠質(zhì)細(xì)胞（圖1），小膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)記蛋白為Iba-1，為紅色染色；DAPI染細(xì)胞核，為藍(lán)色染色；合并重疊后細(xì)胞有著色。小膠質(zhì)細(xì)胞純度為（95.59±1.53）%。

圖1 免疫熒光染色結(jié)果（×200）

2.2 流式細(xì)胞儀測(cè)定各組細(xì)胞總凋亡率 與N 組（11.97±1.31）%比較，LPS 組（30.67±0.12）%細(xì)胞總凋亡率升高（P＜0.05）。與LPS 組比較，LL 組（19.58±0.20）%和LT 組（17.51±0.40）%細(xì)胞總凋亡率呈下降趨勢(shì)（P＜0.05），見圖2。

圖2 流式細(xì)胞儀測(cè)定各組細(xì)胞總凋亡率及結(jié)果分析

2.3 各組細(xì)胞IL-1β、TNF-α、TLR4、MyD88、TRAF6蛋白表達(dá)情況 與N組比較，LPS組TLR4、MyD88、TRAF6 和炎癥因子IL-1β、TNF-α 的蛋白相對(duì)表達(dá)量均增加（均P＜0.05）。與LPS 組比較，LL 組和LT組TLR4、MyD88、TRAF6、IL-1β、TNF-α蛋白相對(duì)表達(dá)量均下降（均P＜0.05），見圖3。

圖3 各組細(xì)胞IL-1β、TNF-α、TLR4、MyD88、TRAF6蛋白表達(dá)及結(jié)果分析

3 討論

在缺血性中風(fēng)、多發(fā)性硬化、亨廷頓舞蹈癥等疾病中，小膠質(zhì)細(xì)胞被慢性激活，從而放大神經(jīng)元的死亡[8-9]。另外，高脂飲食會(huì)誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元產(chǎn)生促炎因子，從而導(dǎo)致下丘腦炎癥，這一機(jī)制在誘導(dǎo)肥胖中發(fā)揮核心作用[10]。因此，小膠質(zhì)細(xì)胞激活的具體機(jī)制可能是預(yù)防或治療這些神經(jīng)系統(tǒng)疾病和肥胖癥的關(guān)鍵[11]。

利拉魯肽主要通過模擬天然GLP-1 激活體內(nèi)的GLP-1受體發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽可以降低小膠質(zhì)細(xì)胞活化數(shù)量，從而降低其炎癥反應(yīng)；并通過減少小膠質(zhì)細(xì)胞增生，刺激抗細(xì)胞凋亡途徑，從而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞[12-14]。

IL-1β具有較強(qiáng)的促炎活性，在炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答方面發(fā)揮重要作用；與它類似，TNF-α可以調(diào)節(jié)多種發(fā)育和免疫過程，如炎癥、凋亡、脂質(zhì)代謝[15]。研究表明，LPS 可以誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-6、IL-1β、TNF-α 等炎癥因子，進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生，造成組織損傷[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，GLP-1 類似物利拉魯肽能下調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞促炎因子IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)，說明利拉魯肽能減輕小膠質(zhì)細(xì)胞的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。

TLR4 信號(hào)通路被LPS 激活可以觸發(fā)兩個(gè)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)：第一個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑涉及TIRAP 和MyD88接頭蛋白，第二個(gè)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)則結(jié)合接頭蛋白TRAM 和TRIF[17]。MyD88 是TLR4 信號(hào)通路中的關(guān)鍵接頭蛋白，在傳遞上游信號(hào)和招募下游分子中具有重要作用[18]。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（TRAF）是一類多功能的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，TRAF6 能被MyD88 招募，作為一個(gè)重要的連接分子調(diào)節(jié)TLR4 信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽和TLR4 抑制劑（TAK-242）的干預(yù)均能顯著降低TLR4、MyD88、TRAF6蛋白表達(dá)和細(xì)胞總凋亡率，改善細(xì)胞損傷狀態(tài)，提示利拉魯肽具有TLR4抑制劑類似作用，能顯著降低TLR4信號(hào)通路活性，下調(diào)通路關(guān)鍵因子表達(dá)。綜上，本課題組認(rèn)為利拉魯肽能通過下調(diào)TLR4信號(hào)通路中關(guān)鍵因子表達(dá)抑制LPS 誘導(dǎo)的原代小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，并改善細(xì)胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

本研究以原代小膠質(zhì)細(xì)胞為研究對(duì)象，基于TLR4 信號(hào)通路，探究了GLP-1 類似物利拉魯肽在抗炎及神經(jīng)保護(hù)方面的潛在作用機(jī)制，為GLP-1類似物應(yīng)用于神經(jīng)相關(guān)性疾病提供了理論基礎(chǔ)。但炎癥反應(yīng)受多種受體信號(hào)通路共同支配，是一個(gè)復(fù)雜多樣的過程，本研究?jī)H在細(xì)胞培養(yǎng)水平進(jìn)行基礎(chǔ)研究，證據(jù)尚不充分。未來本課題組將進(jìn)一步聯(lián)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究，繼續(xù)探索GLP-1治療神經(jīng)炎癥的效果及作用機(jī)制。