許子強(qiáng)，劉 義

1. 湖北大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院/功能材料綠色制備與應(yīng)用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430062；2. 天津工業(yè)大學(xué) 化學(xué)學(xué)院/分離膜和膜過(guò)程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387

0 引 言

農(nóng)藥（pesticide）是農(nóng)業(yè)上用于防治病蟲(chóng)害及調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)的化學(xué)物質(zhì)，因此也是水果、蔬菜及其他農(nóng)作物中最重要的殘留毒物，是嚴(yán)重及長(zhǎng)期存在的環(huán)境威脅［1，2］?；诓煌幕瘜W(xué)組成，農(nóng)藥可以分為5 類：有機(jī)氯（organochlorine）、有機(jī)磷（organophosphorus）、氨 基甲酸鹽（carbamate）、除 蟲(chóng)菊素（pyrethrin）、擬除蟲(chóng)菊素（pyrethroid）類化合物。有機(jī)磷化合物在過(guò)去的幾十年里被廣泛并持續(xù)地用作殺蟲(chóng)劑、殺蠕蟲(chóng)劑、殺線蟲(chóng)劑、殺真菌劑和除草劑，因此全球使用的農(nóng)藥中占比最高的為有機(jī)磷類，大約為38%［3，4］。有機(jī)磷農(nóng)藥暴露造成的神經(jīng)毒性主要表現(xiàn)在抑制乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）的活性，該典型水解酶對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常工作非常重要［5］。幾乎所有的有機(jī)磷農(nóng)藥都可以通過(guò)對(duì)AChE 的磷酸化來(lái)抑制其活性，使AChE 無(wú)法催化乙酰膽堿的水解，并引發(fā)乙酰膽堿的聚集，導(dǎo)致膽堿毒性［6］。其他類型的農(nóng)藥也會(huì)損傷人體免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致人體激素紊亂以及耐藥性等問(wèn)題［7］。因此，考慮到農(nóng)藥的潛在毒性以及農(nóng)藥的殘留富集性，構(gòu)建面向殘留農(nóng)藥的高靈敏度、高選擇性的定量檢測(cè)方法對(duì)于環(huán)境、食物的安全及人類的健康非常重要。

許多傳統(tǒng)的方法，如氣相色譜（GC）［8］、高效液相色譜（HPLC）［9］及質(zhì)譜（MS）［10］等均在農(nóng)藥的定量檢測(cè)方面有廣泛的應(yīng)用。但這些方法復(fù)雜的操作步驟及高耗時(shí)等問(wèn)題嚴(yán)重影響了其對(duì)農(nóng)藥的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。熒光傳感技術(shù)具有簡(jiǎn)便、快速、低成本以及高通量等特性，在監(jiān)測(cè)殘留農(nóng)藥領(lǐng)域的應(yīng)用吸引了廣泛的關(guān)注［11］。熒光檢測(cè)收集的光學(xué)信號(hào)直接來(lái)源于發(fā)光材料，所以尋找熒光量子產(chǎn)率高及近紅外發(fā)射的發(fā)光材料對(duì)于構(gòu)建面向有機(jī)磷農(nóng)藥的高靈敏診斷平臺(tái)非常重要。有機(jī)熒光染料、熒光蛋白、稀土納米粒子以及半導(dǎo)體量子點(diǎn)具有許多不可避免的缺點(diǎn)，如光漂白、價(jià)格昂貴、穩(wěn)定性較低以及毒性高等，限制了其實(shí)際應(yīng)用［12］。與其他發(fā)光材料比較而言，碳量子點(diǎn)（carbon quantum dots，CDs）具有獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)及光學(xué)性質(zhì)，如優(yōu)異的熒光性能、可調(diào)的發(fā)射波長(zhǎng)、良好的生物相容性及顯著的光穩(wěn)定性。同時(shí)，CDs 表面含有多種官能團(tuán)，如氨基、羧基、羥基及羰基等，為其功能化應(yīng)用提供了基本條件?；谝陨蟽?yōu)點(diǎn)，CDs 在生物傳感、腫瘤治療，尤其是環(huán)境污染監(jiān)測(cè)［13，14］領(lǐng)域得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。

本文首先簡(jiǎn)單介紹了用于殘留農(nóng)藥檢測(cè)的CDs 熒光探針的傳感機(jī)制，然后從基于金屬離子、納米顆粒、天然酶及抗體4 個(gè)角度，結(jié)合具體實(shí)例分析了用于殘留農(nóng)藥檢測(cè)的CDs 熒光探針構(gòu)建策略，并分別討論了每種策略的機(jī)制及優(yōu)缺點(diǎn)，最后對(duì)用于殘留農(nóng)藥檢測(cè)的CDs 熒光檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了總結(jié)及展望。

1 CDs 熒光探針的傳感機(jī)制

CDs 具有良好的水溶性、低毒性及表面易修飾等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建高靈敏度的、檢測(cè)殘留農(nóng)藥的熒光探針。用于殘留農(nóng)藥檢測(cè)的CDs 熒光探針傳感機(jī)制可以分為3 類：

1）CDs 表面的活性基團(tuán)（如合成過(guò)程中形成的羥基、羧基、氨基等）與殘留農(nóng)藥直接作用；

2）通過(guò)熒光“淬滅-恢復(fù)”（“Off-On”）的機(jī)制，將CDs 與發(fā)光團(tuán)、底物或淬滅劑結(jié)合后，再與殘留農(nóng)藥作用；

3）將CDs 與某些特異性配體（如抗體、適配體、多肽及氨基酸）偶聯(lián)，再與殘留農(nóng)藥發(fā)生特異性結(jié)合。

根據(jù)殘留農(nóng)藥濃度與CDs 熒光信號(hào)改變之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，可以構(gòu)建用于目標(biāo)農(nóng)藥檢測(cè)的高效及靈敏的熒光探針。另外，將CDs 優(yōu)異的熒光性質(zhì)與常用的多種傳感機(jī)制（如光誘導(dǎo)的電子轉(zhuǎn)移、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）、分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）、聚集誘導(dǎo)發(fā)光（AIE）及內(nèi)過(guò)濾效應(yīng)（IFE））結(jié)合，或通過(guò)功能化策略，與其他傳感材料（酶及淬滅劑）結(jié)合，還可以監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的淬滅、增敏及比率型響應(yīng)行為。這些技術(shù)的運(yùn)用，使用于殘留農(nóng)藥檢測(cè)的CDs 熒光探針在靈敏度及選擇性方面得到巨大和快速的發(fā)展。

2 CDs 熒光探針

根據(jù)改變CDs 熒光信號(hào)的物質(zhì)的不同，用于殘留農(nóng)藥檢測(cè)的CDs 熒光探針可以分為以下4 類：基于金屬離子、納米顆粒、天然酶及抗體的CDs 熒光探針。

2.1 基于金屬離子的CDs 熒光探針

一些金屬離子可以有效地淬滅CDs 的熒光［15］。當(dāng)農(nóng)藥與金屬離子之間的親和力大于金屬離子與CDs 之間的親和力時(shí)，就可以利用這些金屬離子作為CDs 信號(hào)的淬滅劑，基于金屬離子、CDs 及目標(biāo)農(nóng)藥之間的相互作用，構(gòu)建“Off-On”型的熒光探針。

基于這一原則，Wang 等［16］以硫脲作為碳源、二甘醇作為溶劑合成CDs，再以Cu2+作為CDs 的淬滅劑，利用Cu2+與CDs 表面基團(tuán)及草甘膦之間的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對(duì)草甘膦的增敏型檢測(cè)。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，該方法的線性檢測(cè)范圍為0.03～10 μg/mL，檢出限為16 ng/mL［16］。近年來(lái)，可用于同時(shí)檢測(cè)多種物質(zhì)的多重傳感平臺(tái)吸引了科學(xué)界的廣泛關(guān)注。Chen 等［17］對(duì)檸檬酸及丙烯酰胺的甲酰胺溶液進(jìn)行溶劑熱處理，成功獲取了發(fā)射紅色熒光的CDs。CDs 的熒光可以選擇性地被Hg2+淬滅，而農(nóng)藥福美鋅可以與Hg2+形成更穩(wěn)定的復(fù)合物，使CDs的熒光恢復(fù)，據(jù)此建立了福美鋅的檢測(cè)方法。在該方法中，紅色熒光CDs 的使用可以消除復(fù)雜體系中自發(fā)熒光的背景干擾，增強(qiáng)檢測(cè)的靈敏度，福美鋅的檢 出 限 為0.55 μg/mL。Wang 等［18］則 使 用 辛 硫酸合成了一種硫摻雜的CDs（SCDs），并利用SCDs構(gòu)建了能同時(shí)檢測(cè)Hg2+及甲基硫菌靈（thiophanate methyl，TM）的“Off-On”型熒光探針（圖1），對(duì)甲基硫菌靈的檢出限為7.6 nmol/L，且其他干擾離子及農(nóng)藥的存在均不會(huì)影響探針的響應(yīng)。

圖1 利用CDs 檢測(cè)Hg2+及甲基硫菌靈的示意圖[18]Fig.1 Schematic illustration of the detection of Hg2+and thiophanate methyl by CDs[18]

基于金屬離子淬滅的CDs 熒光探針具有成本低、效率高等優(yōu)點(diǎn)，但其在實(shí)際應(yīng)用中存在如下缺陷：1）在傳感平臺(tái)構(gòu)建之前，農(nóng)藥、金屬離子及CDs之間的相互作用強(qiáng)度不可預(yù)測(cè)；2）農(nóng)藥與金屬離子的相互作用較弱，導(dǎo)致熒光恢復(fù)效率較低，可能使檢測(cè)靈敏度下降；3）金屬離子的使用可能會(huì)產(chǎn)生一些副反應(yīng)，從而影響傳感平臺(tái)的性能。

2.2 基于納米顆粒的CDs 熒光探針

納米顆粒是指尺寸在1～100 nm 之間的一種超小粒子，具有獨(dú)特的光、電、磁及熱的特性。除CDs外，半導(dǎo)體量子點(diǎn)、貴金屬納米顆粒（納米金、納米銀）、貴金屬納米團(tuán)簇均在農(nóng)藥檢領(lǐng)域有深入的研究［19～22］。通過(guò)選擇、組合、利用多種納米顆粒的特征，可以設(shè)計(jì)雜化納米材料，用于構(gòu)建較高檢測(cè)靈敏度、選擇性及實(shí)用性的熒光探針。納米顆粒通常可以作為CDs的熒光淬滅劑、增強(qiáng)劑及比率型傳感的底物。

常規(guī)的納米顆?？梢杂行У卮銣鏑Ds 的熒光，也可以與多種不同的農(nóng)藥相互作用，使CDs 的熒光恢復(fù)。Wang 等［23］發(fā)現(xiàn)羊毛衍生CDs 的熒光可以通過(guò)內(nèi)過(guò)濾效應(yīng)被銀納米顆粒（Ag NPs）淬滅，而草甘膦（glyphosate）可以誘導(dǎo)銀納米顆粒的聚集，使CDs的熒光恢復(fù)，據(jù)此構(gòu)建了對(duì)殘留草甘膦的定量檢測(cè)方法（圖2）。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，草甘膦的線性檢測(cè)范圍為0.025～2.500 μg/mL，檢出限為12 ng/mL。Sajwan 等［24］同樣基于金納米顆粒（Au NPs）對(duì)CDs 的內(nèi)過(guò)濾效應(yīng)，構(gòu)建了一種快速、靈敏且簡(jiǎn)便的檢測(cè)涕滅威的熒光傳感平臺(tái)。隨著CDs 的加入，金納米顆粒在靜電作用力的誘導(dǎo)下發(fā)生聚集，使CDs 的熒光被淬滅；而隨著涕滅威的加入，金納米顆粒通過(guò)Au—N 鍵或Au—S 鍵與涕滅威發(fā)生相互作用，在CDs 與金納米顆粒之間形成一個(gè)插入層，減弱了金納米顆粒的內(nèi)過(guò)濾效應(yīng)，使CDs 熒光恢復(fù)。該方法的線性檢測(cè)范圍為3.8～76.0 μg/L，檢出限為3.02 μg/L。

圖2 基于Ag NPs 對(duì)CDs 的內(nèi)過(guò)濾效應(yīng)的草甘膦熒光檢測(cè)[23]Fig.2 Fluorescent detection of glyphosate based on the IFE of Ag NPs on the CDs[23]

其他納米顆粒也可以作為CDs 傳感系統(tǒng)中的信號(hào)增強(qiáng)劑，獲得較高的熒光檢測(cè)靈敏度。這種信號(hào)增強(qiáng)可能來(lái)源于金屬納米顆粒附近的局域場(chǎng)增強(qiáng)效應(yīng)，即通過(guò)非輻射相互作用或輻射衰減工程介導(dǎo)的等離子體耦合效應(yīng)，這類效應(yīng)統(tǒng)稱為金屬增強(qiáng)熒光（metal-enhanced fluorescence，MEF）效應(yīng)［25］。最近，Jiménez-López 等［26］利用石墨烯量子點(diǎn)（graphene quantum dots，GQDs）以及半胱氨酸包裹的銀納米顆粒構(gòu)建了一種用于草甘膦檢測(cè)的分析平臺(tái)。由于GQDs 與銀納米顆粒表面的等離子耦合作用，導(dǎo)致銀納米顆粒輻射衰減速率以及熒光發(fā)射的增強(qiáng)，而草甘膦的加入能淬滅GQDs-銀納米顆粒復(fù)合系統(tǒng)的熒光，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)草甘膦的靈敏檢測(cè)，檢出限低至9 ng/mL。然而MEF 效應(yīng)的機(jī)制非常復(fù)雜，且目前MEF 效應(yīng)的機(jī)理尚不清晰，限制了基于MEF 及CDs 的熒光探針的設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)。熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）效應(yīng)也是一個(gè)非輻射的能量轉(zhuǎn)移過(guò)程，主要通過(guò)供體/受體分子之間的偶極相互作用，將能量從供體熒光分子傳遞給鄰近的受體分子，使供體熒光強(qiáng)度下降及受體熒光強(qiáng)度增加［12］。研究者［27］利用CdTe 量子點(diǎn)（能量受體）及CDs（能量供體）構(gòu)建了一種基于FRET 效應(yīng)的熒光探針（圖3），可以高靈敏、選擇性地檢測(cè)綠麥隆（chlortoluron）。在實(shí)驗(yàn)中，首先發(fā)生從CDs 到CdTe 量子點(diǎn)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移，使CdTe 量子點(diǎn)熒光增強(qiáng)，同時(shí)CDs 的熒光被淬滅；但由于綠麥隆與CdTe 量子點(diǎn)之間的相互作用力更強(qiáng)，所以隨著綠麥隆的加入，CdTe量子點(diǎn)的熒光被淬滅，而CDs 的熒光隨之增強(qiáng)。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，該探針對(duì)農(nóng)藥的線性檢測(cè)范圍為0.24～85.00 nmol/L，檢出限為0.078 nmol/L，常見(jiàn)的陽(yáng)離子及陰離子不會(huì)對(duì)該農(nóng)藥的檢測(cè)造成干擾。

圖3 綠麥隆對(duì)CdTe-CDs 體系的熒光淬滅[27]Fig.3 Fluorescence quenching of CdTe-CDs system by chlortoluron[27]

2.3 基于天然酶的CDs 熒光探針

天然酶是一種具有獨(dú)特催化功能的特異性蛋白，在體內(nèi)無(wú)毒且環(huán)境友好，可以高效地催化各種生物化學(xué)反應(yīng)［28，29］。酶對(duì)其催化底物具有很強(qiáng)的特異性，因此基于酶的生物傳感器在分析領(lǐng)域吸引了廣泛的關(guān)注［30］。在用于殘留農(nóng)藥檢測(cè)的基于酶的CDs 熒光探針中，有兩種主要的檢測(cè)機(jī)制：1）抑制機(jī)制，即農(nóng)藥通過(guò)阻斷酶的活性位點(diǎn)抑制酶的活性，從而誘發(fā)熒光信號(hào)響應(yīng)；2）催化機(jī)制，即以農(nóng)藥作為酶的底物，影響催化過(guò)程，進(jìn)而影響熒光信號(hào)響應(yīng)。其中，基于酶抑制機(jī)制的CDs 熒光探針在農(nóng)藥的分析檢測(cè)中起到了十分重要的作用。

膽堿酯酶（cholinesterase，ChE）包括乙酰膽堿酯酶（AChE）及丁酰膽堿酯酶（BChE），是有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類農(nóng)藥的監(jiān)測(cè)中使用最廣泛的兩種酶［31］。有機(jī)磷中含有不同比例的C、N、O、S 包圍的磷酸酯鍵，可以通過(guò)親核反應(yīng)進(jìn)攻膽堿酯酶的絲氨酸殘基［7］。磷酸化的膽堿酯酶無(wú)法催化底物的水解以及抑制硫代膽堿的形成，而硫代膽堿可以競(jìng)爭(zhēng)性地與Ellman 試劑、金屬離子及貴金屬納米顆粒相互作用，并直接/間接地調(diào)節(jié)其與CDs 的相互作用。在所有用于殘留農(nóng)藥檢測(cè)的基于CDs 及膽堿酯酶的分析策略中，硫代膽堿調(diào)控的策略在農(nóng)藥檢測(cè)中具有較高的地位。

由于金屬離子（如Cu2+、Au3+）與巰基（—SH）之間具有較強(qiáng)的親和力，因此金屬離子可以與硫代膽堿形成較強(qiáng)的配合物，用于殘留農(nóng)藥檢測(cè)的CDs 熒光探針的構(gòu)建［32，33］。Hou 等［32］基于Cu2+與CDs 的體系構(gòu)建了一種用于敵敵畏（dichlorvos）檢測(cè)的熒光探針（圖4）。首先CDs 的熒光可以被Cu2+選擇性地淬滅；然后，當(dāng)AChE 及硫代乙酰膽堿存在時(shí)，AChE 催化硫代乙酰膽堿水解，形成硫代膽堿，通過(guò)硫代膽堿與Cu2+之間更強(qiáng)的親和力，使CDs 的熒光恢復(fù)。當(dāng)AChE 的抑制劑（敵敵畏）存在時(shí)，AChE無(wú)法催化硫代乙酰膽堿的水解，使CDs 的熒光保持淬滅狀態(tài)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)敵敵畏的定量檢測(cè)。

圖4 基于Cu2+及AChE 的用于敵敵畏檢測(cè)的CDs 熒光探針[32]Fig.4 Fluorescent probe for dichlorvos detection based on Cu2+and AChE[32]

還原性的Ellman 試劑（5，5-二硫代二苯（2-硝基苯甲酸），DTNB）也常用于殘留農(nóng)藥檢測(cè)的CDs熒光探針的構(gòu)建。DTNB 可以作為硫代膽堿的顯色試劑，驗(yàn)證硫代乙酰膽堿的水解產(chǎn)物的形成，從而根據(jù)顏色信息的變化定量計(jì)算殘留農(nóng)藥的濃度［34，35］。根據(jù)這一特性，Li 等［34］基于AChE 對(duì)CDs熒光淬滅的調(diào)控，構(gòu)建了一種無(wú)標(biāo)記的殘留有機(jī)磷農(nóng)藥檢測(cè)的雙模式（熒光、比色）平臺(tái)。AChE 可以催化硫代乙酰膽堿水解形成硫代膽堿，進(jìn)而使DTNB 降解生成黃色的5-硫代-2-硝基苯甲酸（TNBA）。而帶正電的TNBA 可以吸附在CDs 表面，通過(guò)動(dòng)態(tài)淬滅的方式淬滅CDs 的熒光。當(dāng)有機(jī)磷農(nóng)藥存在時(shí)，AchE 的活性被抑制，從而使CDs 的熒光仍然保持。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，該檢測(cè)平臺(tái)對(duì)對(duì)氧磷的檢出限為0.4 ng/mL。然而，AChE 對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的選擇性較差，使該檢測(cè)平臺(tái)在檢測(cè)實(shí)際樣品時(shí)受到了一定的限制。

將CDs 與其他功能性納米材料結(jié)合也是一種構(gòu)建理想探針的有效策略［36］。Chen 等［37］通過(guò)水熱法制備了一種熒光發(fā)射波長(zhǎng)位于490 nm 的CDs 探針，其熒光強(qiáng)度會(huì)被金納米顆粒有效地淬滅。而AChE 催化硫代乙酰膽堿生成的硫代膽堿，會(huì)誘導(dǎo)金納米顆粒的聚集，伴隨著其在520 nm 處吸收峰的下降，并最終使CDs 的熒光恢復(fù)。而農(nóng)藥西維因的存在會(huì)抑制AChE 的活性以及金納米顆粒的聚集，使CDs 熒光保持淬滅的狀態(tài)。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，該方法的線性檢測(cè)范圍為0.20～150.00 μg/mL。Yan 等［38］基于CDs 和MnO2納米片成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的定量檢測(cè)。首先對(duì)3-氨基苯硼酸進(jìn)行水熱處理得到熒光CDs，再用MnO2納米片通過(guò)FRET 效應(yīng)淬滅CDs 的熒光。在BChE 及硫代乙酰膽堿存在時(shí)，酶的水解產(chǎn)物（硫代膽堿）可以高效誘發(fā)MnO2納米片的降解，從而使CDs 熒光恢復(fù)。而有機(jī)磷作為酶的抑制劑，可以阻止硫代膽堿的形成及MnO2納米片的降解，使CDs 的熒光保持淬滅的狀態(tài)。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，該方法可以有效地檢測(cè)對(duì)氧磷，線性檢測(cè)范圍為0.05～5.00 ng/mL，檢出限為0.015 ng/mL。Huang 等［39］構(gòu)建了一種用于殘留農(nóng)藥檢測(cè)的Cu2+及CDs/CdTe 量子點(diǎn)雜化水凝膠的比率型探針（圖5）。其原理為：CdTe 量子點(diǎn)的熒光可以被Cu2+動(dòng)態(tài)淬滅，而CDs 的熒光對(duì)Cu2+無(wú)響應(yīng)，同時(shí)AChE 催化乙酰硫代膽堿水解形成的硫代膽堿（TCh），可以通過(guò)強(qiáng)的Cu—S 鍵與Cu2+結(jié)合，從而使CdTe 量子點(diǎn)的熒光恢復(fù)。當(dāng)酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑（敵敵畏）存在時(shí)，會(huì)抑制硫代膽堿-Cu 復(fù)合物的形成，從而改變CDs 的比率型熒光信號(hào)。這種可攜帶的診斷試劑盒的線性檢測(cè)范圍為1～40 ng/mL，檢出限為0.38 ng/mL。

圖5 用于檢測(cè)敵敵畏的基于Cu2+及CDs/CdTe 的比率型熒光探針[39]Fig.5 Ratiometric fluorescent probe for dichlorvos detection based on Cu2+and CDs/CdTe[39]

除使用單一酶外，也可以采取多種酶聯(lián)用的方法構(gòu)建殘留農(nóng)藥檢測(cè)的CDs 熒光探針。由于膽堿氧化酶（ChOx）的高催化活性及高選擇性，基于ChOx 的多種酶體系在殘留農(nóng)藥檢測(cè)的CDs 熒光探針構(gòu)建方面也有廣泛應(yīng)用［40］。通常情況下，膽堿酯酶可以催化乙酰膽堿水解產(chǎn)生膽堿，作為ChOx 的底物催化產(chǎn)生H2O2及甜菜堿［41］。通過(guò)檢測(cè)H2O2的熒光探針可以監(jiān)測(cè)整個(gè)生物催化過(guò)程。Sahub 等［42］構(gòu)建了一種用于監(jiān)測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥的GQDs/酶的納米檢測(cè)平臺(tái)（圖6）。AChE 及ChOx 的酶聯(lián)反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生一定量的H2O2，H2O2可以有效淬滅GQDs 的熒光，而有機(jī)磷農(nóng)藥又會(huì)使GQDs 的熒光恢復(fù)，且熒光的恢復(fù)與有機(jī)磷農(nóng)藥的濃度相關(guān)。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，GQDs/AChE/ChOx 對(duì)有機(jī)磷的檢出限為0.172 μg/mL。由于單獨(dú)的酶對(duì)相應(yīng)的底物具有較好的特異性，所以多種酶聯(lián)用的檢測(cè)平臺(tái)具有較好的抗干擾能力。但該檢測(cè)策略存在反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)、反應(yīng)條件也更加苛刻的問(wèn)題。

圖6 用于有機(jī)磷農(nóng)藥檢測(cè)的基于GQDs/AChE/ChOx 體系的熒光探針[42]Fig.6 Fluorescent probe for organophosphate pesticide detection based on GQDs/AChE/ChOx system[42]

除了抑制策略之外，利用有機(jī)磷水解酶（organophosphorus hydrolase，OPH）對(duì)農(nóng)藥的催化作用也可以檢測(cè)殘留農(nóng)藥。有機(jī)磷農(nóng)藥可作為OPH 的底物，因此通過(guò)定量分析OPH 催化轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物，對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行定量分析。OPH 是一種酰胺水解酶家族的脯氨酰氨基酸酶［43］，可以催化水解多種農(nóng)藥（如二嗪農(nóng)及甲基對(duì)硫磷）。由于水解反應(yīng)的不可逆性，故該反應(yīng)的催化轉(zhuǎn)化效率較高，但同時(shí)酶催化水解產(chǎn)物的活性也較高，很容易引發(fā)熒光信號(hào)的改變。因此，將OPH 與CDs 結(jié)合在一起，可用于檢測(cè)甲基對(duì)硫磷。甲基對(duì)硫磷的水解產(chǎn)物（p-硝基苯酚）能淬滅CDs 的熒光，可據(jù)此建立殘留甲基對(duì)硫磷的檢測(cè)方法［44］。OPH 對(duì)目標(biāo)農(nóng)藥的特異性識(shí)別和降解功能對(duì)于發(fā)展綠色探針?lè)浅Ｖ匾Ｈ欢?，與AChE 比較，OPH 的催化機(jī)制尚不明確且其催化活性較差，檢測(cè)的靈敏度也低于基于抑制機(jī)制的CDs 熒光探針。

2.4 基于抗體的CDs 熒光探針

抗體免疫球蛋白（immunoglobulin G，IgG）是一種由外源性物質(zhì)（抗原）的刺激產(chǎn)生的具有保護(hù)性功能的蛋白，基于抗體的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合反應(yīng)，廣泛地應(yīng)用于各種疾病的預(yù)防、診斷及治療［45］?？乖c抗體之間的特異性識(shí)別可以作為生物識(shí)別元件，用于生物傳感器件的構(gòu)建［46，47］。通常情況，需要CDs 對(duì)抗體-抗原的免疫反應(yīng)足夠敏感，將免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)變?yōu)闊晒庑盘?hào)的淬滅或增強(qiáng)，通過(guò)“三明治”結(jié)構(gòu)或直接/間接的競(jìng)爭(zhēng)性原則構(gòu)建可靠的免疫熒光探針。對(duì)農(nóng)藥分子進(jìn)行衍生化修飾，可以使其滿足免疫熒光檢測(cè)的需求，但步驟非常繁瑣且低效。因此，直接或間接的競(jìng)爭(zhēng)性策略在設(shè)計(jì)用于殘留農(nóng)藥檢測(cè)的CDs 及抗體的免疫熒光探針中非常有效［48］。Wang 等［49］基于免疫熒光策略構(gòu)建了一種針對(duì)草甘膦（glyphosate，GLY）的熒光檢測(cè)方法（圖7）。他們將環(huán)境友好的CDs 與草甘膦的抗體偶聯(lián)在一起形成IgG-CDs，可以特異性地識(shí)別草甘膦。而IgG-CDs 可以原位地對(duì)植物組織中草甘膦的分布進(jìn)行分析?？紤]到多余的IgG-CDs 可能對(duì)草甘膦的檢測(cè)產(chǎn)生影響，他們進(jìn)一步構(gòu)建了一種基于磁性Fe3O4及草甘膦的抗原磁性微球用于偶聯(lián)多余的IgG-CDs，實(shí)現(xiàn)了對(duì)草甘膦的檢測(cè)，線性檢測(cè)范圍為0.01～80.00 μg/mL，檢出限為8 ng/mL，在實(shí)際樣品（如河水、茶葉及土壤）中的回收率為87.4%～103.7%。

圖7 用于草甘膦檢測(cè)的免疫熒光檢測(cè)[49]Fig.7 The immunofluorescence detection of glyphosate[49]

用于殘留農(nóng)藥檢測(cè)的CDs 及抗體免疫熒光探針具有非常多的優(yōu)越性，但也存在如下缺陷：1）抗體與CDs 的偶聯(lián)效率較低；2）免疫熒光檢測(cè)的耗時(shí)較長(zhǎng)；3）抗體的穩(wěn)定性有待進(jìn)一步提高。這些缺陷限制了它在快速分析領(lǐng)域的應(yīng)用。

3 總結(jié)及展望

全球范圍內(nèi)的農(nóng)藥污染問(wèn)題日益嚴(yán)重，促進(jìn)了殘留農(nóng)藥檢測(cè)技術(shù)的迅速發(fā)展。雖然已有文獻(xiàn)總結(jié)了用于殘留農(nóng)藥檢測(cè)的分析技術(shù)，但基于CDs 熒光的檢測(cè)方法仍有許多發(fā)展空間。CDs 具有非常優(yōu)異的熒光性質(zhì)，突出的生物相容性以及良好的水溶性，是開(kāi)發(fā)高靈敏殘留農(nóng)藥檢測(cè)技術(shù)的理想材料。CDs 作為發(fā)光團(tuán)、識(shí)別原件或催化劑，可以單獨(dú)或與其他材料聯(lián)合用于構(gòu)建檢測(cè)殘留農(nóng)藥的精確探針。通過(guò)調(diào)節(jié)合成方法、條件，可以調(diào)控CDs的性質(zhì)，開(kāi)發(fā)多種多樣的熒光探針。

基于已有的研究，用于殘留農(nóng)藥檢測(cè)的CDs 熒光探針的研究主要面臨如下挑戰(zhàn)：

1）高發(fā)光性能CDs 的開(kāi)發(fā)應(yīng)用仍然較為缺乏。雖然目前許多工作報(bào)道了CDs 具有近紅外發(fā)光、磷光以及上轉(zhuǎn)換熒光的特性，但這些特性很少用于相關(guān)探針的構(gòu)建。近紅外熒光、磷光及上轉(zhuǎn)換熒光CDs 的使用可以有效消除復(fù)雜生物基質(zhì)中的背景干擾，極大地提高其在實(shí)際樣品分析中的準(zhǔn)確性。另外，將CDs 與其他熒光納米材料聯(lián)合使用，構(gòu)建雙發(fā)射的比率型熒光探針，可以提供內(nèi)置校準(zhǔn)功能，減少儀器及環(huán)境因素的系統(tǒng)誤差。

2）CDs 的發(fā)光機(jī)制仍然存在一定的爭(zhēng)議。關(guān)于CDs 發(fā)光機(jī)制的研究有限，在一定程度上限制了CDs 在殘留農(nóng)藥檢測(cè)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。因此，全面、深入地研究CDs 的發(fā)光機(jī)制對(duì)指導(dǎo)CDs 的設(shè)計(jì)合成，提高其檢測(cè)殘留農(nóng)藥的性能具有重要意義。

3）嚴(yán)重依賴大型熒光檢測(cè)設(shè)備。目前，用于殘留農(nóng)藥檢測(cè)的CDs 熒光探針嚴(yán)重依賴大型的熒光檢測(cè)設(shè)備，對(duì)農(nóng)藥的實(shí)時(shí)、原位檢測(cè)造成障礙。因此，需要開(kāi)發(fā)便攜性的微型化熒光檢測(cè)設(shè)備，以方便用于不同領(lǐng)域?qū)嶋H樣品中的殘留農(nóng)藥檢測(cè)。

總之，在未來(lái)的研究中，研究者們需要從不同的傳感機(jī)制和合成策略中提取有益的思路，努力開(kāi)發(fā)現(xiàn)有CDs 的潛力及優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)殘留農(nóng)藥的實(shí)時(shí)、快速、原位、高靈敏檢測(cè)。