邱冠凱,倪大虎,韓忠民,王婧瑩,方軍

(1.中國科學(xué)院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，黑龍江 哈爾濱 150081; 2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，安徽 合肥 230031)

0 引 言

鐵作為植物生長發(fā)育過程中最重要的微量元素之一，其參與了植物的多種細(xì)胞活動。鐵參與多種氧化還原反應(yīng)，尤其是在光合作用和呼吸作用的電子傳遞鏈中起到關(guān)鍵性的作用。鐵在土壤中的溶解度很低，溶解的鐵離子主要以三價的形式存在，并隨著pH值的升高溶解度顯著降低。因此，植物體對土壤中對于鐵離子的利用率很低[1]，尤其在堿性土壤中容易產(chǎn)生缺鐵脅迫，缺鐵會直接對植物體的生長發(fā)育、農(nóng)作物的產(chǎn)量與質(zhì)量造成影響[2]。在鐵元素嚴(yán)重缺乏或者高pH土壤地區(qū)種植水稻，就會面臨缺鐵脅迫。因此，研究水稻在堿性條件下對鐵元素吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)分子機(jī)制，可以為改善水稻在堿性土壤中的缺鐵脅迫耐受性提供理論基礎(chǔ)[3]。

1 植物的鐵吸收機(jī)制

植物體對于鐵元素的吸收主要通過兩種不同的途徑[1]。雙子葉植物以及非禾本科植物均采用機(jī)理Ⅰ(strategyⅠ)，該途徑吸收的鐵離子為二價鐵離子。而對多數(shù)禾本科植物而言，主要通過機(jī)理Ⅱ(strategyⅡ)吸收三價鐵離子。通過機(jī)理Ⅰ吸收鐵的植物體，分泌次生代謝產(chǎn)物尼克酰胺(Nicotianamine,NA)，這種次生代謝產(chǎn)物可以直接與土壤中的二價鐵離子結(jié)合，植物體通過自身的一些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將其運(yùn)輸?shù)礁考?xì)胞內(nèi)[4]。通過機(jī)理Ⅱ吸收鐵的植物體，其根部細(xì)胞分泌的次生代謝產(chǎn)物麥根酸(Mugineic acids,MAs)直接結(jié)合土壤中的三價鐵離子，再由植物體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)[4]。水稻吸收鐵元素同時并存這兩種吸收方式[5]。

1.1 鐵吸收機(jī)理Ⅰ

某些植物包括部分非禾本科植物和雙子葉植物吸收鐵離子時采用機(jī)理Ⅰ。這些植物的根部在吸收鐵離子的過程中具有極強(qiáng)的還原能力，可將一些重要的還原劑排出體外以還原土壤中的三價鐵離子[3]，增強(qiáng)根部對于鐵離子的吸收效果(圖1)。采用機(jī)理Ⅰ的植物在缺鐵環(huán)境下，通過向土壤中釋放正電荷酸化土壤，增加土壤中二價鐵離子的濃度，再由鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將其轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)[6]。

圖1 高等植物鐵吸收機(jī)制

轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白IRT(The iron-regulated transporter)能夠?qū)⒍r鐵離子從根部附近的土壤中轉(zhuǎn)運(yùn)至植物體細(xì)胞內(nèi)[7]。有研究發(fā)現(xiàn)水稻中存在兩個IRT基因(OsIRT1和OsIRT2)，它們編碼ZIP(Zinc-regulated transporter，IRT-like protein)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族。擬南芥中相應(yīng)缺鐵信號基因AtIRT1，不僅在植株的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起到重要的作用，還與植物體的光合作用有關(guān)。irt1敲除突變體呈現(xiàn)出葉片黃化的表型，生長發(fā)育受到了嚴(yán)重的影響[8]。研究發(fā)現(xiàn)，水稻體內(nèi)有多種Fe2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，包括OsIRT1、OsIRT2、OsNRAMP1和OsNRAMP5[4,9-10]。OsIRT1就是二價鐵離子的重要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[4]，在缺鐵條件下，三種基因OsIRT1、OsIRT2和OsNRAMP1表達(dá)量升高，而OsNRAMP5表達(dá)量基本不變，對鐵吸收的調(diào)控作用相對較小[10-11]。

1.2 鐵吸收機(jī)理Ⅱ

作為禾本科植物主要的鐵吸收方式，機(jī)理Ⅱ與機(jī)理Ⅰ大不相同，采用機(jī)理Ⅱ的植物體能夠合成MAs并釋放到根際土壤中[12]。MAs首先結(jié)合土壤周圍的三價鐵離子，形成Fe(Ⅲ)-MA，再由 YS1(Yellow stripe 1)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)送至細(xì)胞內(nèi)[13]。

S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)是MAs合成過程中的重要前體(圖2)。MAs的合成通過以下三種酶完成：尼克酰胺合成酶NAS、尼克酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶NAAT和脫氧麥根酸合成酶DMAS[14-16]。由NAS將三分子的SAM結(jié)合成一個分子的NA，NA可以被NAAT、DMAS還原酶作用合成2-DMA。囊泡中所合成的MAs主要在根部細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，也正是因為這些囊泡在晝夜間收縮，所以MAs可能是在囊泡中合成并進(jìn)行儲存。水稻中雖然存在類似的囊泡活動，但相比于大麥合成的MAs要減少許多[17]。DMA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在缺鐵情況下可被誘導(dǎo)表達(dá)，通過誘導(dǎo)表達(dá)OsTOM1可增加水稻對缺鐵的耐受性[18]，OsTOM1在水稻葉根中都有所表達(dá)，它還參與鐵離子的轉(zhuǎn)運(yùn)過程。OsTOM2是OsTOM1的同源基因，在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)并參與轉(zhuǎn)運(yùn)水稻中的DMA[19]。DMA可以直接與Fe3+結(jié)合形成Fe(Ⅲ)-DMA復(fù)合物，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白YS/YSL(Yellow stripe-like)，將其直接運(yùn)輸至植物體根部細(xì)胞內(nèi)[13]。該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白首先是在玉米和大麥中發(fā)現(xiàn)，之后在水稻中克隆出18個相關(guān)的同源基因[20]。OsYSL15編碼三價鐵離子與DMA螯合物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[21]。OsYSL16雖然也編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它主要是在根表皮中表達(dá)[22-23]。水稻在缺鐵條件下，OsNAS1和OsNAS2的表達(dá)量升高。缺鐵條件下OsNAS3的表達(dá)量卻很低，但在過量鐵的環(huán)境下卻能夠強(qiáng)烈表達(dá)OsNAS3。OsNAS3主要在根中表達(dá)，在維管束、表皮及外表皮細(xì)胞中也有所表達(dá)[24]。osnas3敲除突變體在鐵過量條件下表現(xiàn)出生長不良、干重降低、葉片黃化嚴(yán)重及鐵在葉片中的積累量增多等現(xiàn)象[25]。在鐵過剩條件下，OsNAS3能夠合成NA以緩解鐵的過剩所帶來的不利影響。而在正常鐵含量條件下，OsNAS1和OsNAS2合成NA可增強(qiáng)鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)[26]。

圖2 禾本科植物中甲硫氨酸循環(huán)及麥根酸類物質(zhì)的合成過程[28]

在正常生理環(huán)境下，水稻通過機(jī)理I方式吸收鐵元素，并在吸收過程中發(fā)生強(qiáng)烈的氧化還原反應(yīng)。而在缺鐵環(huán)境條件下會通過機(jī)理Ⅱ吸收鐵元素，吸收進(jìn)入植物體內(nèi)的鐵元素從始至終都以螯合物的形式存在，并且不會發(fā)生氧化還原反應(yīng)[27]。

2 水稻鐵離子吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制

2.1 IDEF和HRZ調(diào)控鐵離子的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)

轉(zhuǎn)錄因子OsIDEF1作為水稻在缺鐵環(huán)境下表達(dá)的重要基因[29-31]，能夠識別下游順式作用元件IDE1(Iron deficiency responsive cis-actingelements 1)，該順式作用元件的核心序列為5′-CATGC-3′。OsIDEF1可以與多種二價金屬離子進(jìn)行結(jié)合，如二價鐵離子、錳離子等[32]，并能夠在缺鐵的條件下發(fā)揮信號傳導(dǎo)的作用[33]。OsIDEF1作為最上游的轉(zhuǎn)錄因子，能夠正向調(diào)控多種鐵運(yùn)輸相關(guān)載體基因的表達(dá)，如OsYSL15、OsYSL2和OsIRT1等。過表達(dá)OsIDEF1能夠增加水稻的缺鐵耐受性并增加其耐鹽堿性。參與多種泛素蛋白酶降解的CSN6(COP9 signalosome 6)在鐵缺乏早期含量下降，以確保OsIDEF1的快速積累，從而上調(diào)鐵吸收相關(guān)基因，幫助水稻克服缺鐵協(xié)迫[34]。OsIDEF1能夠誘導(dǎo)OsIBP1.1和OsIBP1.2的表達(dá)，而OsIBP1.1再調(diào)控OsYSL2的表達(dá)影響水稻對于鐵離子的吸收[35]。轉(zhuǎn)錄因子OsIDEF2能夠識別順式作用元件IDE2，該順式作用元件的核心序列為5′-CA(A/C)G(T/C)(T/C/A)(T/C/A)-3′。研究發(fā)現(xiàn)，OsIDEF2在維持水稻植物體鐵平衡中起到至關(guān)重要的作用[30]。

HRZ(Hemerythrin motif-containing really interesting new gene and zinc-finger protein)作為一種含有血紅蛋白結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白，能夠負(fù)向調(diào)控植物體對于鐵離子的吸收[36]。HRZ可直接與金屬離子鐵和鋅發(fā)生結(jié)合。含有HRZ的RNAi植株對缺鐵具有較強(qiáng)的耐受性，并能夠在植株和種子中積累更多的鐵離子[37]。OsHRZ1和OsHRZ2同樣作為泛素連接酶，能夠直接作用于鐵信號傳導(dǎo)的相關(guān)蛋白。OsHRZ1能夠直接泛素化OsPRI1、OsPRI2和OsPRI3[38-39]。OsPRI(Psitive regulator of iron homeostasis)是一類bHLH轉(zhuǎn)錄因子，水稻中的OsPRI1、OsPRI2和OsPRI3與擬南芥中的bHLH105和bHLH115為同源基因。ospri1基因敲除突變體對鐵缺乏敏感性增加，而ospri2和ospri3基因敲除突變體中的鐵無法從根部轉(zhuǎn)運(yùn)至地上部，其過表達(dá)植株能夠促進(jìn)植物體鐵的積累并上調(diào)缺鐵應(yīng)答基因。OsPRI1、OsPRI2和OsPRI3均能夠結(jié)合OsIRO2和OsIRO3的啟動子。其中，OsPRI2和OsPRI3通過結(jié)合靶基因啟動子還能夠激活OsYSL2的表達(dá)[39]。因此，OsHRZ1能夠通過泛素化OsPRI1、OsPRI2和OsPRI3進(jìn)而調(diào)控OsIRO2和OsIRO3轉(zhuǎn)錄，依次生成級聯(lián)反應(yīng)來參與植物對于鐵離子的吸收。

2.2 bHLH轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控鐵離子的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)

目前，在水稻中發(fā)現(xiàn)與鐵離子吸收相關(guān)的bHLH(basic helix-loop-helix)轉(zhuǎn)錄因子，包括OsIRO2[40-42]、OsIRO3[43]和OsbHLH133[44]等。其中，OsIRO2在缺鐵條件下被誘導(dǎo)表達(dá)并且促進(jìn)鐵離子的吸收，而OsIRO3和OsbHLH133的表達(dá)卻是抑制鐵離子的吸收。順式作用元件IDE的核心序列為5′-CACGTGG-3′，在缺鐵條件下被上游轉(zhuǎn)錄因子OsIRO2所識別。缺鐵條件下，該基因在根部和地上部的表達(dá)量升高[42]。對直接參與鐵吸收機(jī)理Ⅱ的相關(guān)基因的啟動子區(qū)域中均發(fā)現(xiàn)了順式作用元件IDE，這也說明OsIRO2能夠參與水稻中MAs的合成，并調(diào)控下游基因的表達(dá)[42]。在缺鐵條件下，過表達(dá)OsIRO3使得植物體地上部鐵離子的積累量變少，而與鐵離子吸收直接相關(guān)的基因表達(dá)量卻發(fā)生下調(diào)，由此可見，OsIRO3是水稻對于鐵離子吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的負(fù)調(diào)控因子[43]。OsbHLH156在鐵吸收機(jī)理II中起到關(guān)鍵性作用，該基因主要在根中表達(dá)，在缺鐵條件下該基因功能降低，導(dǎo)致水稻呈現(xiàn)黃化表型。OsbHLH156能夠與轉(zhuǎn)錄因子OsIRO2協(xié)同作用來增強(qiáng)水稻對于缺鐵的耐受力[45-46]。通過對缺鐵響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄變化與DNA甲基化變化關(guān)聯(lián)分析，研究人員進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在缺鐵條件下，調(diào)控鐵響應(yīng)基因的鐵信號通路核心轉(zhuǎn)錄因子OsbHLH156和OsIRO2甲基化發(fā)生了顯著的變化[47]。

缺鐵時，植物通過bHLHIVc家族成員(bHLH34,bHLH104,bHLH105,bHLH115)激活下游轉(zhuǎn)錄因子FIT和bHLHIb(bHLH38,bHLH39,bHLH100,bHLH101)的表達(dá)，后者形成蛋白復(fù)合物促進(jìn)鐵吸收基因如IRT1和FRO2的表達(dá)，從而促進(jìn)鐵吸收。鐵充足或過量時，植物能抑制FIT和bHLHIb轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而阻止鐵過量攝入以避免遭受鐵毒害。缺鐵條件下，bHLH IVc蛋白激活下游轉(zhuǎn)錄因子bHLH156和bHLHIb，進(jìn)而促進(jìn)鐵吸收基因如IRT1和FRO2的表達(dá)以增加鐵吸收。隨著植物體內(nèi)鐵的增多，bHLH11蛋白也不斷積累，并在bHLH IVc蛋白的幫助下進(jìn)入細(xì)胞核，通過招募轉(zhuǎn)錄抑制因子[48]，從而減少植物體對于鐵的吸收。

在植物體中，研究者發(fā)現(xiàn)一種特異表達(dá)的小肽IRON MAN(IMA)，其可以激活缺鐵響應(yīng)基因(bHLHIb、IRT1和FRO2)的表達(dá)[49]。在擬南芥中，通過篩選與IMA的互作蛋白，發(fā)現(xiàn)其可以與BST蛋白相互作用。IMA的C端含有一個保守的BID(BTS interaction domain)結(jié)構(gòu)域，其負(fù)責(zé)與BTS蛋白互作。作為一個E3連接酶，BTS可以通過泛素化途徑降解IMA。在鐵充足情況下，BTS促進(jìn)bHLH105/bHLH115降解，阻止了鐵吸收基因的表達(dá)，減少了鐵吸收，從而避免植物遭受鐵毒害；在鐵匱乏情況下，IMA被誘導(dǎo)后與BTS互作，從而阻止了bHLH105/bHLH115的降解，而被釋放的bHLH105/bHLH115則激活缺鐵響應(yīng)基因，促進(jìn)鐵吸收，以滿足植物的鐵需求[50]。OsIMA1和OsIMA2在缺鐵條件下受轉(zhuǎn)錄因子OsIDEF1、OsbHLH058、OsbHLH059以及兩個基因自身的正向調(diào)控，而受HRZ泛素連接酶的負(fù)向調(diào)控。過表達(dá)OsIMA1和OsIMA2可以使水稻在正常條件下呈現(xiàn)缺鐵表型，而下調(diào)兩種基因只會產(chǎn)生輕微的影響[51]。

2.3 IRT和NRAMP參與游離態(tài)二價鐵離子的轉(zhuǎn)運(yùn)

水稻除了通過兩種不同的途徑來吸收鐵元素外，還能夠直接利用鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將Fe2+直接轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，這樣的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括OsIRT1[52-53]、OsIRT2[3]、OsNRAMP1[54]和OsNRAMP5[10-11]。其中對于Fe2+的轉(zhuǎn)運(yùn)起到關(guān)鍵性作用的為OsIRT1、OsIRT2，缺鐵環(huán)境可使兩種基因表達(dá)量升高[3]。在水稻中，過表達(dá)OsIRT1使其對缺鐵脅迫的耐受性增加。OsIRT2是OsIRT1的同源基因，具有73%的相似度，也在水稻的根部表達(dá)。NRAMP家族成員同樣也作為水稻吸收鐵元素不可或缺的一部分，OsNRAMP1和OsNRAMP5作為7個家族成員中最重要的兩個參與其Fe2+的轉(zhuǎn)運(yùn)，其中的OsNRAMP1同樣也可以參與Cd2+的轉(zhuǎn)運(yùn)[54]。在缺鐵環(huán)境條件下OsNRAMP1的表達(dá)量顯著升高，而OsNRAMP5的表達(dá)量沒有明顯的變化[55]。OsNRAMP5的主要功能是轉(zhuǎn)運(yùn)Cd2+、Mn2+兩種金屬元素[11,56]。OsVIT2是一個液泡膜定位的二價鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在葉鞘的束內(nèi)輸導(dǎo)組織和籽粒糊粉層中表達(dá)，作用是負(fù)責(zé)將鐵隔離到這些組織的液泡中。敲除OsVIT2后產(chǎn)量不受影響，但會增加鐵從節(jié)到種子以及從糊粉層到胚乳的分配，從而提高了精米中鐵的累積[57]。木薯中過量表達(dá)擬南芥液泡鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OsVIT1，在溫室條件下可以使木薯塊根中鐵增加3～4倍[58]。田間試驗中，在木薯中共表達(dá)突變的擬南芥鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白IRT1和蛋白FER1，其鐵含量比非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏蔫F水平高7～18倍，鋅水平高3～10倍，而生長參數(shù)和塊根產(chǎn)量不受轉(zhuǎn)基因強(qiáng)化的影響[59]。

2.4 YSL家族在鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用

目前，水稻中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)18個YSL家族成員能夠參與鐵離子的轉(zhuǎn)運(yùn)[60-62](圖3)。二價鐵離子的螯合物就是通過OsYSL2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將其轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)部。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OsYSL2除了能夠轉(zhuǎn)運(yùn)鐵元素外，還能夠轉(zhuǎn)運(yùn)錳元素。研究發(fā)現(xiàn)OsYSL2除了在根部表達(dá)，外還在植物體其他部位表達(dá)，該基因除了參與植物體鐵元素的吸收外，還同樣參與鐵元素在植物體內(nèi)的運(yùn)輸[62]。OsYSL15[61]、OsYSL16[23]通過機(jī)理II吸收三價鐵離子和麥根酸螯合物時起到關(guān)鍵性作用。在缺鐵的環(huán)境條件下，OsYSL15表達(dá)量顯著升高。osysl15基因敲除突變體呈現(xiàn)發(fā)黃枯萎的表型，并且在其植物體中各個部位鐵含量均顯著降低[62]。OsYSL15在大麥中的同源基因HvYSL1專一性運(yùn)輸Fe3+，在水稻中過表達(dá)HvYSL1可增加其耐受性[32]。

圖3 鐵離子從根際土壤進(jìn)入水稻根部細(xì)胞過程

3 展望

當(dāng)前關(guān)于水稻吸收鐵離子的分子機(jī)制的一部分已被闡明(圖4)，但仍然能有許多領(lǐng)域需要研究。水稻中最上游的兩個基因OsIDEF1和OsHRZ1被認(rèn)為最有可能是鐵的感受器，但到目前為止卻沒有直接證據(jù)證明，而且目前仍然沒有將水稻中鐵的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)分子機(jī)制運(yùn)用到實際生產(chǎn)中。鐵離子在細(xì)胞器中的運(yùn)輸方式相關(guān)研究很少，如鐵離子在葉綠體和線粒體的電子傳遞中是如何發(fā)揮作用的。解析鐵離子在信號傳導(dǎo)過程中的分子機(jī)制，將更有利于對其進(jìn)行應(yīng)用。此外，影響植物體鐵元素吸收的因素并不局限于這些調(diào)控機(jī)制。例如，植物體分泌的香豆素可以直接影響到植物根際的微生物群落結(jié)構(gòu)[63-64]，從而活化土壤鐵營養(yǎng)，促進(jìn)植物鐵吸收等[65]。所以，亟需更深入且從不同角度探究水稻的鐵吸收機(jī)制，以應(yīng)用在遺傳育種與品種改良中。

圖4 缺鐵響應(yīng)信號通路