徐 穎， 張 婷， 王 洋， 楊芙蓮

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

硒是人類飲食中必不可少的營(yíng)養(yǎng)素，成年人每天大約需40～60μg的硒作為膳食補(bǔ)充劑.硒納米顆粒(Selenium nanoparticles,SeNPs)具有低細(xì)胞毒性和較高的生物活性[1,2]，是一種新型的補(bǔ)硒形態(tài)，近年來(lái)其合成和應(yīng)用受到廣泛關(guān)注[3,4].

傳統(tǒng)的合成納米粒子的方法有物理法和化學(xué)法.常見(jiàn)的物理方法包括高溫?zé)崽幚?、微波輻照和激光燒蝕等幾個(gè)重要途徑，但其合成成本很高.在化學(xué)合成中，一些添加劑、還原劑或穩(wěn)定劑如乙醛、硼氫化物、十二硫代酸鹽和許多化學(xué)品被使用.但發(fā)現(xiàn)其制備條件很嚴(yán)格，制備過(guò)程復(fù)雜.在微生物合成過(guò)程中，特別是益生菌生物合成SeNPs被廣泛應(yīng)用，其合成的納米顆粒不易團(tuán)聚、生物活性更高、原料來(lái)源更廣.有報(bào)道指出嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、干酪乳桿菌可以合成SeNPs[5].目前，生物源硒納米顆粒已被發(fā)現(xiàn)對(duì)一些革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌有抑菌活性，在濃度分別為125μg/mL、100μg/mL、100μg/mL、250μg/mL下，對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、類腸球菌等多種病原菌的抑制率達(dá)到99%[6,7].

熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)是一種食源性污染菌，可對(duì)包括牛奶和肉在內(nèi)的冷藏食品造成嚴(yán)重危害[8].熒光假單胞菌分泌的蛋白酶和脂肪酶可以分解乳中的蛋白質(zhì)和脂肪產(chǎn)生小分子的蛋白質(zhì)、肽類、氨基酸以及游離的脂肪酸，導(dǎo)致乳制品出現(xiàn)苦味、凝塊、脂肪上浮等現(xiàn)象，使乳制品品質(zhì)顯著下降，嚴(yán)重影響貨架期[9].在肉制品中，熒光假單胞菌會(huì)分泌蛋白酶導(dǎo)致肉產(chǎn)生黏液，降低了加工肉制品的品質(zhì)和安全性[10].因此，控制熒光假單胞菌的生長(zhǎng)對(duì)提高食品安全性以及延長(zhǎng)食品貨架期具有重要意義.

有研究報(bào)道了添加精油[11,12]、植物提取物[13,14]、細(xì)菌素[15]、生物保鮮劑[16]等物質(zhì)可以抑制熒光假單胞菌的產(chǎn)生.但精油類物質(zhì)制作過(guò)程繁瑣，原料取得不易，無(wú)法大量生產(chǎn)，成本高；細(xì)菌素的分離純化過(guò)程復(fù)雜，有些細(xì)菌素的穩(wěn)定性較差；生物保鮮劑抑制和殺滅微生物的能力有限.基于上述問(wèn)題，研究發(fā)現(xiàn)納米硒粒子作為新型硒源具有更好的生物利用度和化學(xué)穩(wěn)定性，與其他形式硒相比具有更低的毒性.并且納米硒已被證明具有多種生理活性，比如抑菌、抗氧化、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)活性等.

目前，對(duì)生物合成的SeNPs對(duì)熒光假單胞菌的抗菌活性及其可能機(jī)制的研究很少.因此，本文在干酪乳桿菌和嗜酸乳桿菌的作用下，生物轉(zhuǎn)化為納米硒，并對(duì)制備的納米硒進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征.再以熒光假單胞菌的模式菌株和野生型菌株為靶細(xì)菌，研究SeNPs對(duì)其抗菌性能.通過(guò)最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration,MIC)和細(xì)菌生長(zhǎng)曲線來(lái)考察SeNPs對(duì)其抑菌效果.選取模式菌株測(cè)定生物膜形成、生物膜胞外多糖含量來(lái)分析抑菌機(jī)制，為SeNPs應(yīng)用于冷藏食品中提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嗜酸乳桿菌(LactobacillusacidophilusZK-AS 1.2686)、干酪乳桿菌(LactobacilluscaseiZK-AS 1.1482)、熒光假單胞菌模式菌株(PseudomonasfluorescensCICC 21620)、熒光假單胞菌野生型菌株(PseudomonasfluorescensBNCC 194799)由實(shí)驗(yàn)室提供；亞硒酸鈉，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；MRS培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；其它試劑為常見(jiàn)分析純.

1.2 主要儀器

TG20KP高速冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙東旺實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Varioskan Flash全波長(zhǎng)多功能掃描讀數(shù)儀，賽默飛世爾科技有限公司；納米粒度表面電位分析儀，英國(guó)Malvern公司；紫外-可見(jiàn)-近紅外分光光度計(jì)，美國(guó)安捷倫公司；X射線衍射儀，日本理學(xué)Rigaku公司；真空傅里葉紅外光譜儀，德國(guó)布魯克Bruker公司.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株的活化

將凍干管中的乳酸菌用滅菌的MRS液體培養(yǎng)基充分溶解.接種于MRS培養(yǎng)基中，37 ℃，培養(yǎng)24 h，再活化兩代，得到三代菌.放置4 ℃，備用.

1.3.2 納米硒的合成與分離純化

(1)納米硒的合成

將活化后的三代菌，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期.加2 mL的0.17 mg/mL亞硒酸鈉于15 mL的菌液中，37 ℃，培養(yǎng)48 h.

(2)納米硒的分離純化

富硒培養(yǎng)后的菌液，8 000 r/min離心10 min，用無(wú)菌生理鹽水洗滌.無(wú)菌水重懸.加100μL 的100 mg/mL溶菌酶，37 ℃，孵育2 h.超聲破碎(功率100 W，10 min，破2 s停1 s，在冰浴中進(jìn)行).12 000 r/min，離心5 min.含1% SDS的Tris-HCl洗滌3次，得到的沉淀重懸于無(wú)菌水中.加正辛醇，渦旋混勻.4 ℃下，靜置24 h.棄上層，留水相和沉淀.用氯仿、乙醇、無(wú)菌水依次洗滌，離心.沉淀即得到硒納米顆粒.4 ℃保存?zhèn)溆?

1.3.3 硒納米顆粒的表征

(1)納米粒度表面電位分析儀表征

將分離純化的SeNPs重懸于超純水中，在4 ℃儲(chǔ)存下，每隔一周，取樣測(cè)定納米硒的粒徑、分散系數(shù)(PDI)和電位.

(2)紫外分光光度計(jì)全波長(zhǎng)掃描

利用紫外-可見(jiàn)-近紅外分光光度計(jì)來(lái)進(jìn)行全波長(zhǎng)(200～800 nm)掃描.

(3)X 射線衍射儀(XRD)

將提取的SeNPs冷凍干燥，然后研磨成粉末進(jìn)行XRD測(cè)試.

(4)紅外光譜(FT-IR)

將冷凍干燥的樣品與烘干的KBr混合(1∶100)，研磨均勻，壓片.置于傅里葉紅外光譜儀中，光譜掃描(波長(zhǎng)范圍：400～4 000 cm-1).

1.3.4 抑菌活性

(1)最小抑菌濃度測(cè)定

按1%接種量將兩種熒光假單胞菌(即模式菌株和野生型菌株)菌液接種于LB培養(yǎng)基中，30 ℃，160 r/min，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，用0.9%無(wú)菌生理鹽水重懸并調(diào)整菌數(shù)為106CFU/mL，制備成菌懸液.在96孔板上第1列加200μL的6.4 mg/mL硒納米顆粒溶液，第2～8列加入100μL的LB培養(yǎng)基，從第1列吸取100μL的硒納米顆粒溶液加入到第2列，吸打混勻后取100μL加到第3列，依次重復(fù)至第8列再吸出100μL棄掉.第9列以不加硒納米顆粒作為陰性對(duì)照.然后分別在第1～9列中加入100μL的106CFU/mL菌懸液.30 ℃，培養(yǎng)24 h，酶標(biāo)儀測(cè)定OD600.以未見(jiàn)指示菌生長(zhǎng)(即OD600不增高)的最低SeNPs濃度為 MIC.

(2)硒納米顆粒對(duì)熒光假單胞菌生長(zhǎng)曲線的影響

用LB培養(yǎng)基將熒光假單胞菌模式菌和野生型菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，調(diào)整菌濃度為106CFU/mL.每孔先取菌懸液，隨后加入SeNPs溶液使其終質(zhì)量濃度分別為0(CK)、1/16MIC、1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC、MIC和2MIC.對(duì)照組不添加硒納米顆粒的菌懸液，30 ℃，每隔2 h測(cè)定OD600，到24 h結(jié)束，繪制生長(zhǎng)曲線.

1.3.5 對(duì)生物膜的影響

(1)對(duì)生物膜形成的抑制作用

將熒光假單胞菌模式菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，調(diào)整其細(xì)菌濃度為106CFU/mL備用.向96孔板每孔中加入菌懸液.隨后，向上述菌懸液中加入SeNPs溶液使其終質(zhì)量濃度分別為0(CK)、1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC、MIC和2MIC.以無(wú)菌水為對(duì)照，每組3次重復(fù)，30 ℃，24 h.吸去菌液并使用無(wú)菌水將各孔漂洗3～5次.無(wú)菌風(fēng)干燥.結(jié)晶紫染色15 min.無(wú)菌水反復(fù)沖洗.干燥.加入33%冰乙酸溶液(目的：充分溶解生物被膜-結(jié)晶紫復(fù)合物).在595 nm處測(cè)定OD值.按式(1)計(jì)算生物膜抑制率.

(1)

式(1)中：OD1指對(duì)照組的OD值；OD2指實(shí)驗(yàn)組的OD值.

(2)對(duì)生物膜胞外多糖的抑制

采用苯酚硫酸法測(cè)定胞外多糖含量.

①標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

先配制100μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，分別取一定量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用蒸餾水定容，使?jié)舛确謩e為0 mg/mL、0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.1 mg/mL.加入6%的苯酚溶液，充分混勻后滴加濃硫酸，立即搖勻，室溫下靜置30 min.測(cè)OD490 nm.

②胞外多糖含量的測(cè)定

將含有不同濃度硒納米顆粒的菌懸液，離心(10 000 r/min，15 min)，吸取上清，加入上清液3倍體積的無(wú)水乙醇，渦旋.然后室溫靜置過(guò)夜，高速離心，加PBS稀釋沉淀.用蒸餾水作空白，加6%的苯酚溶液于樣品中，再加入濃硫酸，充分混勻，靜置30 min，測(cè)490 nm波長(zhǎng)處吸光度值.

2 結(jié)果與討論

2.1 提取的硒納米顆粒

通過(guò)有機(jī)溶劑-水分配體系(正辛醇-水)提取和純化SeNPs，將得到的SeNPs進(jìn)行冷凍干燥，如圖1所示，其為粉紅色.

圖1 冷凍干燥后的SeNPs

2.2 SeNPs表征

2.2.1 納米硒的穩(wěn)定性分析

圖2顯示了兩株乳酸菌提取的SeNPs在4 ℃儲(chǔ)存條件下，粒徑、PDI和電位隨時(shí)間變化的情況.其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SeNPs保存在4 ℃下，粒徑?jīng)]有發(fā)生明顯的變化，說(shuō)明硒納米顆粒可以穩(wěn)定的保存在4 ℃.Zeta電位可以衡量納米顆粒表面的有效電荷，其值的大小代表粒子的穩(wěn)定性.從圖2可知，電位值隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，其Zeta電位值絕對(duì)值最高達(dá)30 mV左右.分散系數(shù)(PDI)在4 ℃條件下分別增加到0.239、0.267.

(a)干酪乳桿菌

2.2.2 紫外全波長(zhǎng)掃描分析

將SeNPs懸浮于超純水中，用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描(200～800 nm)，結(jié)果顯示富硒干酪乳桿菌提取的SeNPs在240 nm處有明顯的吸收峰(如圖3(a)所示)，而富硒嗜酸乳桿菌提取的硒納米顆粒則在波長(zhǎng)為204 nm處有最大吸收峰(如圖3(b)所示).Lokanadhan等[17]通過(guò)紫外-可見(jiàn)光譜對(duì)PF-SeNPs的形成進(jìn)行了初步確認(rèn)，發(fā)現(xiàn)吸收峰最大值出現(xiàn)在270 nm處，證明了SeNPs的形成.而 Fesharaki等[18]觀察到在218 nm和248 nm處出現(xiàn)特征吸收峰.說(shuō)明也形成硒.

(a)干酪乳桿菌

2.2.3 XRD分析

X射線粉末結(jié)晶學(xué)是一種重要的晶體相識(shí)別技術(shù).由圖4可知，SeNPs的XRD譜圖顯示了更寬的譜圖，沒(méi)有任何確定的布拉格峰.富硒干酪乳桿菌提取SeNPs在2θ為9.60 °和19.26 °處出現(xiàn)了小的峰值，富硒嗜酸乳桿菌提取的硒納米顆粒在8.57 °和18.98 °處有小的峰.結(jié)果表明結(jié)構(gòu)為無(wú)定形、非晶態(tài)的.王麗紅等[19]利用嗜酸乳桿菌LA5轉(zhuǎn)化形成的納米硒，在X射線衍射圖中發(fā)現(xiàn)缺少一個(gè)尖銳的峰，表明生物合成的SeNPs具有非晶結(jié)構(gòu).

(a)干酪乳桿菌

2.2.4 FTIR分析

由紅外光譜圖5可知，富硒干酪乳桿菌和嗜酸乳桿菌提取的硒納米顆粒在3 293/3 297 cm-1波長(zhǎng)處有一個(gè)吸收峰，代表著蛋白質(zhì)、糖類和脂類中的-NH和-OH伸縮振動(dòng)；位于2 932/2 931 cm-1處的特征峰可能是由于飽和脂肪和蛋白、多糖的C-H伸縮振動(dòng)；1 656/1 655 cm-1的特征峰對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶的C=O與C=C的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)，該基團(tuán)與蛋白質(zhì)相關(guān)，對(duì)形成的SeNPs的穩(wěn)定起著關(guān)鍵作用[20]；1 540/1 537 cm-1處的小峰由于蛋白質(zhì)的酰胺Ⅱ帶中肽鍵的C-N和N-H的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)引起；1 452/1 451 cm-1特征峰源于羧基或蛋白質(zhì)和脂質(zhì)中彎曲的CH2/CH3；1 398/1 396 cm-1波段處的峰是蛋白質(zhì)的酰胺Ⅲ帶；1 235/1 236 cm-1為C-H彎曲振動(dòng)；1 066/1 068 cm-1與多糖的-OH伸縮振動(dòng)或C-O、C-OH鍵有關(guān).FTIR結(jié)果表明：從2株菌中提取的硒納米顆粒表面可能包含有蛋白質(zhì)、脂類和糖類等物質(zhì).這與本實(shí)驗(yàn)室先前的研究一致[21].不同官能團(tuán)的存在，可能是負(fù)責(zé)還原和穩(wěn)定SeNPs[22].

(a)干酪乳桿菌

2.3 抑菌活性

2.3.1 MIC

采用微量二倍稀釋法測(cè)定SeNPs對(duì)熒光假單胞菌的最小抑菌濃度(MIC).由圖6可知，富硒干酪乳桿菌提取的SeNPs對(duì)熒光假單胞菌模式菌株的最小抑菌濃度為0.1 mg/mL，野生型菌株的MIC則為0.2 mg/mL.而富硒嗜酸乳桿菌提取的硒納米顆粒對(duì)模式菌株和野生型菌株的MIC都為0.2 mg/mL.

(a)熒光假單胞菌模式菌株

2.3.2 時(shí)間-抑菌曲線

圖7為SeNPs對(duì)兩株熒光假單胞菌的抑菌曲線，進(jìn)一步體現(xiàn)了SeNPs對(duì)熒光假單胞菌的抑菌能力.在24 h 內(nèi)空白對(duì)照組熒光假單胞菌生長(zhǎng)狀況良好，而實(shí)驗(yàn)組在0～2 h，有輕微的抑制作用，2 h后OD值增長(zhǎng)較快，到12 h左右，作用趨于平緩.濃度越大，OD值逐漸減小，抑制效果增強(qiáng).隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，熒光假單胞菌的生長(zhǎng)完全受到抑制，表明SeNPs有較強(qiáng)的抑菌能力，并具有良好的抑菌穩(wěn)定性.

(a)干酪乳桿菌對(duì)熒光假單胞菌模式菌抑菌曲線

2.4 生物膜影響

2.4.1 生物膜形成量

近年來(lái)，具有抗生物膜活性的綠色合成納米粒子越來(lái)越受到人們青睞.生物膜的形成使微生物腐敗變質(zhì)，并給食品加工業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失.研究表明，假單胞菌屬可分泌大量胞外多糖形成生物被膜[23,24].

圖8表明不同濃度的SeNPs對(duì)熒光假單胞菌模式菌株生物膜產(chǎn)生的抑制活性.加入不同濃度的SeNPs后，細(xì)菌的生物膜形成量開(kāi)始減少.隨著SeNPs的增大，在595 nm處的吸光度逐漸減小，而抑制率呈增長(zhǎng)趨勢(shì).與未添加硒納米顆粒組相比較，差異顯著(p<0.05).Nalan等[25]研究了不同濃度的生物源SeNPs對(duì)銅綠假單胞菌的生物膜抑制活性.在添加不同濃度的SeNPs后，生物膜的形成開(kāi)始下降，當(dāng)濃度增加到2 mg/mL時(shí)，對(duì)生物膜表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制作用.

(a)干酪乳桿菌

2.4.2 胞外多糖

胞外多糖是構(gòu)成生物膜的重要成分，因此研究了不同濃度SeNPs作用下，對(duì)熒光假單胞菌模式菌胞外多糖產(chǎn)生的影響.多糖濃度-吸光度線性關(guān)系為：y=12.539x+0.0629 9(R2=0.999 6).由圖9可知，SeNPs可抑制生物膜胞外多糖，在1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC、MIC和2MIC作用下，從干酪乳桿菌提取的SeNPs對(duì)熒光假單胞菌模式菌株的抑制率增加了15.89±0.41%，嗜酸乳桿菌提取的SeNPs抑制率從21.37±0.27% 增加到34.54±0.59%.這表明，SeNPs能顯著抑制熒光假單胞菌模式菌生物膜中胞外多糖的分泌.

關(guān)于硒納米顆粒的抗菌作用機(jī)制的研究還很少.一般來(lái)說(shuō)，硒納米顆粒可能遵循以下三種機(jī)制：細(xì)胞壁和細(xì)胞膜損傷；細(xì)胞內(nèi)滲透損傷；氧化應(yīng)激[26].本研究中SeNPs的添加減少了生物膜的含量，減弱菌體的活力，降低胞外分泌物的產(chǎn)生，從而實(shí)現(xiàn)抗熒光假單胞菌被膜形成的作用，最終抑制菌體的生長(zhǎng).后續(xù)將通過(guò)對(duì)菌體形態(tài)的觀察，深入探究SeNPs對(duì)熒光假單胞菌模式菌株細(xì)胞膜的影響.測(cè)定丙二醛含量、ROS含量以及常見(jiàn)的三種抗氧化酶(GSH-Px、SOD和CAT)來(lái)闡明氧化應(yīng)激的具體作用.從基因表達(dá)水平上，進(jìn)一步研究其抑菌機(jī)理，為抑制冷藏食品中的嗜冷菌提供新思路，減少食品腐敗變質(zhì).

3 結(jié)論

本研究利用兩株乳酸菌生物合成SeNPs.對(duì)提取的SeNPs表征，發(fā)現(xiàn)所合成的SeNPs具有高度的穩(wěn)定性、負(fù)電荷性、非晶性和納米尺寸.此外，SeNPs對(duì)熒光假單胞菌模式菌株和野生型菌株表現(xiàn)出良好的抗菌活性.通過(guò)對(duì)熒光假單胞菌模式菌株的生物膜形成量和胞外多糖的測(cè)試，表明生物合成SeNPs的使用對(duì)模式菌株的生物膜結(jié)構(gòu)有顯著的破壞作用.綜上所述，本研究能夠?yàn)槔洳厥称分械氖壤渚?熒光假單胞菌的防控提供寶貴的參考意見(jiàn)，同時(shí)益生菌合成的納米硒有望成為一種安全、有效的抗菌劑，應(yīng)用于冷藏食品中.