韓秉君，牟美睿，楊鳳霞，田雪力，張克強(qiáng)

（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所，天津 300191）

近年來，抗生素抗性基因（Antibiotic resistance genes，ARGs）作為一類新型環(huán)境污染物而備受關(guān)注，ARGs通過水平轉(zhuǎn)移和垂直傳播方式從人和動物體進(jìn)入環(huán)境。目前，我國畜禽源抗性基因污染形勢十分嚴(yán)峻。抗生素在動物體內(nèi)不能完全由吸收代謝途徑降解，60%～90%以原藥形態(tài)隨糞尿進(jìn)入環(huán)境[1]，誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥菌及抗性基因，對受納環(huán)境和人類健康構(gòu)成潛在威脅[2-3]。畜禽養(yǎng)殖業(yè)中抗生素的長期過量使用，加速了養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs 的產(chǎn)生和傳播，糞便、廢水回用農(nóng)田土壤，氣溶膠向大氣自然擴(kuò)散等活動，都增加了ARGs 由動物源向環(huán)境的輸入。世界衛(wèi)生組織（WHO）已將ARGs作為21世紀(jì)威脅人類健康的重大挑戰(zhàn)之一，并在全球范圍對控制ARGs進(jìn)行戰(zhàn)略部署[4-5]。因此，闡釋ARGs在畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中的多介質(zhì)遷移以及農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的行為歸趨和影響因素，對遏制日益嚴(yán)峻的畜禽源細(xì)菌耐藥性問題具有重要意義。

雖然畜禽環(huán)境中的ARGs 污染已被廣泛提及，但相關(guān)研究成果仍缺乏系統(tǒng)性，故加強(qiáng)畜禽源ARGs 的來源分布、傳播途徑和處理工藝的研究，有利于全面評估養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs 的生態(tài)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)為畜禽養(yǎng)殖環(huán)境的保護(hù)和動物產(chǎn)品質(zhì)量安全的保證提供理論和科學(xué)依據(jù)。本文針對畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs 的污染問題，結(jié)合國內(nèi)外的最新文獻(xiàn)報(bào)道，對不同畜種、不同國家（地區(qū)）養(yǎng)殖場內(nèi)ARGs 的分布規(guī)律及不同環(huán)境介質(zhì)中ARGs 的遷移擴(kuò)散進(jìn)行了綜述，對比了雞、豬和牛等主要養(yǎng)殖畜種間ARGs 豐度的差異，分析了地域性污染特征，并論述糞便堆肥和廢水處理等主要糞污資源化利用途徑對ARGs 的去除效果及處理過程中ARGs 的消長規(guī)律，最后對畜禽源ARGs 的污染防控進(jìn)行了展望。

1 畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性基因的產(chǎn)生及來源

ARGs 在畜禽糞污（糞便和廢水）、周邊環(huán)境（土壤、水體和空氣）等不同環(huán)境介質(zhì)中普遍存在[6-7]，其借助質(zhì)粒、整合子和轉(zhuǎn)座子等可移動性遺傳元件（Mobile genetic elements，MGEs）通過接合、轉(zhuǎn)座、轉(zhuǎn)化等方式在微生物中持續(xù)傳播并廣泛擴(kuò)散[8]。畜禽源細(xì)菌中ARGs 的不斷檢出，引起人們對抗生素使用與ARGs 產(chǎn)生之間關(guān)聯(lián)性的重視[9]。我國于2020 年7 月1 日起，禁止企業(yè)在商品飼料中添加用于促動物生長的抗生素，但此前抗生素長期使用造成的細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生與傳播仍是全球疾病防控面臨的重大問題[10-11]。迄今為止，在畜禽糞便、養(yǎng)殖廢水等不同介質(zhì)中發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的ARGs已包含近40種四環(huán)素類抗性基因、10余種高風(fēng)險(xiǎn)β-內(nèi)酰胺類抗性基因、3種磺胺類抗性基因以及多種喹諾酮類抗性基因[12]，且四環(huán)素抗性基因和磺胺類抗性基因的檢出率和含量水平較高，其在養(yǎng)殖環(huán)境中的污染較為嚴(yán)重[6]，這與廣譜獸用四環(huán)素和磺胺類抗生素藥物的普遍使用密切相關(guān)[13]。養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs 主要來源于抗生素亞致死劑量誘導(dǎo)微生物發(fā)生基因新突變（細(xì)菌內(nèi)在抗性）或者在抗生素等因素脅迫下經(jīng)ARGs 水平轉(zhuǎn)移（獲得性抗性）。其中，動物腸道微生物通過隨機(jī)突變或者表達(dá)其體內(nèi)潛在抗性基因等途徑而獲得抗生素抗性，即腸道細(xì)菌固有的抗性是養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs 普遍存在的原因之一。然而，一般細(xì)菌的自發(fā)突變率僅為10-6～10-8且非常不穩(wěn)定，通過突變來獲得多種抗生素的多重耐藥性幾率更低[14]。相比之下，通過微生物體內(nèi)MGEs（如質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、基因盒等）介導(dǎo)而發(fā)生的ARGs 在細(xì)菌種內(nèi)和種間的轉(zhuǎn)移，對畜禽源ARGs 和耐藥菌廣泛遷移及嚴(yán)重污染的影響更為顯著[15-16]。此外，抗性基因的外源輸入亦是養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs 的重要來源，如通過進(jìn)食將水源和飼料中存在的某些ARGs 直接帶入動物體內(nèi)后，又隨糞便及尿液排泄進(jìn)入環(huán)境。外源輸入的ARGs也會通過垂直傳遞和水平轉(zhuǎn)移的方式在養(yǎng)殖環(huán)境中進(jìn)一步傳播擴(kuò)散。ARGs 污染比較特殊，其不同于其他化學(xué)污染，一旦產(chǎn)生就很難控制和消除。因此，ARGs 在養(yǎng)殖環(huán)境中的持久性殘留和在菌群間的遷移、轉(zhuǎn)化和傳播，比抗生素本身對生態(tài)環(huán)境的危害更大。

2 畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性基因的研究方法

畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性基因的主要研究方法有微生物培養(yǎng)法、PCR（Polymerase chain reaction）技術(shù)和宏基因組測序技術(shù)等。

2.1 微生物培養(yǎng)法

微生物培養(yǎng)法是指通過藥敏試驗(yàn)檢測微生物的抗生素抗性表型來評價(jià)其耐藥性，是研究畜禽源細(xì)菌耐藥性的傳統(tǒng)方法，其主要包括3 種檢測方式：①基于測量最小抑制濃度（MIC）的肉湯稀釋法和平板稀釋法；②基于藥敏紙片測量抑菌圈直徑的K-B 瓊脂擴(kuò)散法；③將稀釋法和擴(kuò)散法相結(jié)合的E-test 試驗(yàn)法?，F(xiàn)在使用最為廣泛的是藥敏檢測K-B 瓊脂擴(kuò)增法（紙片法）[17]，即在已接種待檢菌的瓊脂平板上貼上含有定量抗生素的小紙片，藥物在紙片上向周圍區(qū)域溶解擴(kuò)散而形成遞減濃度梯度，在其范圍內(nèi)抑制待檢細(xì)菌的生長并產(chǎn)生透明的抑菌圈，根據(jù)抑菌圈的大小來判斷微生物對抗生素的耐受水平[18]。傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法在研究可培養(yǎng)細(xì)菌的抗生素抗性方面發(fā)揮了重要作用，但是該方法的缺點(diǎn)是漏失了不可培養(yǎng)菌攜帶的抗性基因。近些年，新興的培養(yǎng)組學(xué)結(jié)合了MALDI-TOF 質(zhì)譜和16S rRNA 測序技術(shù)，利用不同條件培養(yǎng)難培養(yǎng)菌生長并可實(shí)現(xiàn)細(xì)菌等微生物的鑒定。隨著新興培養(yǎng)組學(xué)的發(fā)展，新型培養(yǎng)技術(shù)逐漸涌現(xiàn)，如膜擴(kuò)散培養(yǎng)技術(shù)、微流控培養(yǎng)系統(tǒng)和基于細(xì)胞分選的方法等，并且其中一些已有成功的細(xì)菌培養(yǎng)案例[19]。新興培養(yǎng)組學(xué)相較于PCR 技術(shù)與宏基因組學(xué)，細(xì)菌檢測靈敏度極大提高，檢測閾值可低至每克糞便102個(gè)。同時(shí)，微生物培養(yǎng)的自動化儀器也在不斷發(fā)展，使得微生物培養(yǎng)技術(shù)更為省力便捷。新興技術(shù)能夠一定程度提高微生物分離培養(yǎng)的潛力，理論上可以應(yīng)用于多種分類單元，但其仍有局限性。故對于微生物培養(yǎng)技術(shù)的研究仍要繼續(xù)深入，促進(jìn)技術(shù)方法不斷成熟和進(jìn)步。

2.2 PCR技術(shù)

隨著科技進(jìn)步和分子生物技術(shù)的發(fā)展，研究畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中抗性基因和耐藥菌的方法越來越多，定性PCR 技術(shù)是一種擴(kuò)增特定DNA 片段的分子生物學(xué)技術(shù)，不需要對微生物分離培養(yǎng)，可快速、靈敏、準(zhǔn)確地進(jìn)行直接檢測。針對普通PCR 方法只能檢測環(huán)境中是否存在ARGs 而無法精準(zhǔn)量化的問題，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time quantitative PCR，qPCR）和高通量熒光定量PCR 技術(shù)逐漸發(fā)展起來。qPCR 是PCR 從定性到定量的飛躍，因其重復(fù)性好、穩(wěn)定性強(qiáng)，且具有實(shí)時(shí)性，已被廣泛用于環(huán)境樣品中ARGs 的定量分析，該方法還可以直觀分析抗性基因在環(huán)境中的變化，為探究ARGs 在環(huán)境中分布特征及遷移規(guī)律提供了方法學(xué)上的更多可能[20]。而高通量熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)一步突破了普通qPCR 同步測試數(shù)量少和種類有限的局限性，可同時(shí)對多個(gè)樣品及上百種抗性基因進(jìn)行定量分析，大大提高了檢測效率，在養(yǎng)殖環(huán)境中應(yīng)用也越來越多。ZHU 等[21]應(yīng)用高通量熒光定量PCR技術(shù)在養(yǎng)豬場糞便、堆肥及周圍施用糞肥農(nóng)田土壤中檢測到149 種ARGs，基本涵蓋目前的主要ARGs類型。

2.3 宏基因組測序技術(shù)

宏基因組學(xué)也稱為微生物環(huán)境基因組學(xué)，是對環(huán)境樣品中直接獲得的總DNA（包括全部微小生物遺傳物質(zhì)的總和）進(jìn)行分析的所有研究集合[22]，它不僅是一套研究方法，更是一個(gè)研究領(lǐng)域[23]。利用宏基因組測序技術(shù)檢測畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs 主要分為三步：①宏基因組DNA 的提?。虎跇?gòu)建宏基因組文庫；③宏基因組文庫的分析與篩選。隨著測序技術(shù)和組學(xué)分析技術(shù)的不斷發(fā)展，宏基因組測序在畜禽源ARGs 檢測以及ARGs 生態(tài)健康風(fēng)險(xiǎn)評估方面的應(yīng)用也越來越多。FANG等[24]利用該方法在雞糞及雞糞肥施用土壤中檢測出22 類ARGs 以及46 種由致病菌攜帶和32 種人類致病菌所攜帶的抗性基因。宏基因組測序技術(shù)還可以發(fā)掘畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中存在的新型抗性基因，客觀全面地反映ARGs 的多樣性，確定新的抗性機(jī)制并揭示生態(tài)作用。另外，通過轉(zhuǎn)移基因組的檢測分析，宏基因組測序還可以為研究環(huán)境中畜禽源ARGs 的水平轉(zhuǎn)移提供方法支持[25]。近年來宏基因組學(xué)的發(fā)展，使得養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs 的深入研究更加簡便、高效且具有較高特異性，成本也不斷下降，同時(shí)也增加了人類對養(yǎng)殖環(huán)境中抗性基因污染的了解和認(rèn)知。鑒于環(huán)境中ARGs 具有潛在的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)與健康危害，故運(yùn)用先進(jìn)的ARGs 檢測技術(shù)手段研究其傳播機(jī)制與功能十分必要。

3 畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性基因的污染現(xiàn)狀

3.1 畜種間差異

畜禽養(yǎng)殖業(yè)中各畜種（主要包括雞、牛、豬等）由于具有不同的生理特性、生活習(xí)性以及養(yǎng)殖環(huán)境，其糞污中的ARGs 多樣性和豐度存在顯著差異。研究顯示，雞糞和豬糞中ARGs 濃度平均值顯著高于牛糞[26-27]。鄒威等[28]針對不同畜禽ARGs 的研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)雞場糞便中磺胺類和大環(huán)內(nèi)酯類ARGs 的相對豐度（ARGs copies/16S rRNA copies）高于養(yǎng)豬場糞便，如雞糞中sul2 基因的相對豐度為2.16×10-2～2.26×10-1，高于豬糞中的1.2×10-4～5.56×10-2，該結(jié)果與CHENG 等[29]對我國華東地區(qū)畜禽糞便的調(diào)研結(jié)果一致。MU 等[30]通過定量檢測磺胺類、四環(huán)素類以及大環(huán)內(nèi)酯類ARGs 也印證了這一結(jié)論，各畜種養(yǎng)殖場中ARGs總濃度表現(xiàn)為雞>豬>肉牛。谷艷茹等[31]對天津地區(qū)不同發(fā)育階段豬群的研究發(fā)現(xiàn)，母豬糞污中多數(shù)ARGs 的相對豐度顯著高于仔豬和育肥豬。由此可見，不同種類畜禽糞污中ARGs 的濃度水平存在差異，且處于不同生長發(fā)育階段的畜禽產(chǎn)生的糞污中ARGs濃度也不同。

造成不同畜種間ARGs 水平差異的原因是復(fù)雜的，雞糞中ARGs 的豐度較高，可能是由于雞飼養(yǎng)過程中允許的飼喂抗生素用量高于豬和牛的允許用量[32]。有研究報(bào)道，雞和豬的糞便中發(fā)現(xiàn)的抗生素殘留量通常比肉牛高，我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)雞糞中抗生素殘留量（1 420.8 mg·g-1）明顯高于豬糞[33-34]。此外，養(yǎng)雞場較高的養(yǎng)殖密度也導(dǎo)致其更容易感染傳染病，養(yǎng)殖戶為了預(yù)防和治療疾病，可能會使用超出許可范圍的抗生素。除了抗生素使用量高以外，雞微生物組中ARGs 的高度可轉(zhuǎn)移性也可能有助于ARGs 在雞糞中的傳播。QU 等[35]使用宏基因組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，MGEs是雞盲腸微生物組的主要功能成分，有助于基因水平轉(zhuǎn)移。一般而言，由于較高的繁殖密度和較短的生長周期，養(yǎng)雞和養(yǎng)豬使用的抗生素量遠(yuǎn)高于養(yǎng)牛[33]。同時(shí)，不同農(nóng)場同種動物樣品中ARGs 的多樣性和豐度也存在差異，這可能與飼料條件（飲食結(jié)構(gòu)和抗生素使用劑量）、動物亞型和年齡有關(guān)，如在低劑量水平上應(yīng)用不同抗生素可能導(dǎo)致牛糞中ARGs 類型的顯著變化[36]。進(jìn)一步地，還可以用動物飼料中添加的不同抗生素以及畜種之間的腸道菌群差異來解釋[37-39]。而不同育齡階段ARGs 變化的原因，可能是動物各生長階段的抗生素給藥方式不同。豬的養(yǎng)殖早期階段會使用較高劑量的抗生素，在其生長過程中逐漸降低抗生素使用濃度，故肥育豬糞污ARGs 的豐度和多樣性低于母豬和仔豬[40-41]。

3.2 地域性差異

畜禽養(yǎng)殖業(yè)中ARGs 污染情況在各國間存在差異，這很大程度上受到當(dāng)?shù)乜股厥褂梅煞ㄒ?guī)和實(shí)施情況的影響。近年，歐盟以及一些國家為應(yīng)對抗生素抗性的蔓延，限制了養(yǎng)殖業(yè)中用于預(yù)防疾病的抗生素的用量，同時(shí)對飼料級抗生素也進(jìn)行了限制，尤其是四環(huán)素和多黏菌素的使用[42]。盡管各國均有相關(guān)監(jiān)控和管理部門，但抗生素仍在養(yǎng)殖業(yè)廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致動物和農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中ARGs的增加[43]。尤其是許多低收入和中等收入國家和地區(qū)對抗生素使用監(jiān)管不到位，使得抗生素和ARGs 進(jìn)入到土壤和水體中，給環(huán)境健康和社會安全帶來重大風(fēng)險(xiǎn)[7]。在已報(bào)告ARGs 豐度數(shù)據(jù)的96 個(gè)國家中，我國是最大的抗生素生產(chǎn)者和消費(fèi)國，養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生的糞便中通常有較高的ARGs 豐度[44]。我國自20 世紀(jì)70 年代使用抗生素以來，消費(fèi)量呈持續(xù)增長趨勢，近一半抗生素進(jìn)入了養(yǎng)殖業(yè)，總量達(dá)105 000 t[45]。畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs 污染在全球各國間存在地域性差異，HEUER 等[46-47]的研究發(fā)現(xiàn)德國養(yǎng)豬場糞便中磺胺類ARGs 相對豐度為10-5～10-2；而美國24 個(gè)畜禽養(yǎng)殖場糞便中，sul1 的相對豐度范圍為10-6～10-5，低于德國。ARGs 的豐度變化還取決于各國不同地區(qū)的具體情況，不同地區(qū)畜禽養(yǎng)殖業(yè)ARGs 的污染水平存在較大差異。在美國奶牛場中，中西部和東北部養(yǎng)殖場糞污中ARGs 豐度具有明顯差異。在我國，山東養(yǎng)殖場牛糞中ARGs 的絕對豐度（濃度高達(dá)1011copies·g-1）比陜西高出約100倍[48-49]；河北地區(qū)養(yǎng)豬場和養(yǎng)雞場ARGs 的平均相對豐度分別為4.99×10-2和1.36×10-1，均高于天津市[29]。對某些國家來說，ARGs 豐度主要與抗生素使用量和殘留濃度有關(guān)，但由于影響耐藥菌生長以及ARGs 傳播和削減的區(qū)域物理和化學(xué)條件不同，各地區(qū)ARGs豐度可能出現(xiàn)較大的差異[6]。全球抗生素使用量與ARGs 濃度之間尚無法建立明確的聯(lián)系，如我國山東和美國科羅拉多各自在本國范圍內(nèi)抗生素的使用情況較為相似（分別占全球消費(fèi)量的23%和19%）[48-49]，但對兩地豬場廢水中的四環(huán)素類ARGs豐度進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，山東地區(qū)較科羅拉多高出104 倍，因此，比較國家間ARGs污染情況是十分必要的。

4 典型糞污處理工藝中抗生素抗性基因的影響

4.1 固體糞便堆肥

堆肥作為一種可以有效減少甚至消除畜禽糞便中ARGs 的常見方法（主要有好氧堆肥和厭氧堆肥兩種方式），可以有效殺滅動物糞便中的病原菌，將糞便制成有機(jī)肥[50-51]。而堆肥過程中產(chǎn)生的高溫可以消除耐藥微生物，降低糞便中的抗生素殘留，削減ARGs的濃度水平，實(shí)現(xiàn)糞便無害化處理。QIAN 等[26]的研究顯示，堆肥分別使雞糞和豬糞中ARGs減少了57種和28 種，平均從雞糞中去除了53%的ARGs，堆肥后65%的ARGs豐度不足原來的1/10。吳丹[52]對北京地區(qū)畜禽養(yǎng)殖場糞便好氧堆肥的研究也發(fā)現(xiàn)，ARGs 去除率高達(dá)90.0%～99.9%。另外，厭氧發(fā)酵作為畜禽糞便資源化和肥料化利用的一種重要方式，也能夠有效地削減ARGs 的豐度。錢燕云等[53]的研究顯示，厭氧發(fā)酵過程中tetG、tetL、tetO、tetW、sul1 和sul2 的豐度均有所下降。除了有關(guān)好氧或厭氧堆肥過程中ARGs變化的研究，現(xiàn)階段也有針對好氧-厭氧結(jié)合堆肥中ARGs 去除效果的研究，好氧-厭氧兩相堆肥能夠有效地降低部分ARGs 和潛在致病菌豐度，其中ermB、tetK的相對豐度分別降低了39.7%、72.2%[54]。

堆肥雖然能夠一定程度去除大多數(shù)ARGs，抑制潛在致病菌的繁殖擴(kuò)散，但部分ARGs 和致病菌仍存在增多的現(xiàn)象。如在高溫堆肥過程中，與堆肥初期相比，豬糞中ermF 出現(xiàn)了增加的情況[55]。ZHANG 等[56]也發(fā)現(xiàn)經(jīng)過堆肥處理，一些ARGs 的豐度減少，但也有部分ARGs 豐度增加，因此，現(xiàn)有的堆肥工藝仍有許多問題亟待優(yōu)化。通過控制堆肥的外部因素，如pH、溫度、碳氮比等，可以提高抗生素降解和ARGs去除的效果。好氧和厭氧堆肥去除ARGs 主要是通過提高溫度達(dá)到目的，傳統(tǒng)技術(shù)最高溫度一般在55 ℃[57-58]，但對部分ARGs 的去除效果并不理想。AWASTHI 等[59]發(fā)現(xiàn)在堆肥過程中添加高濃度的黏土可以使去除效果明顯提升，并且其與溫度、pH、二氧化碳濃度以及微生物可利用的營養(yǎng)元素等因素顯著相關(guān)。還有研究人員在傳統(tǒng)好氧堆肥和厭氧消化的原材料中添加零價(jià)鐵、鋸末、稻殼、蘑菇殘?jiān)⒅兴帤堅(jiān)任镔|(zhì)，發(fā)現(xiàn)也有一定增效作用，這可能是由于添加物影響了堆肥過程中微生物種類、營養(yǎng)成分、溫度及水分，但具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究[60-63]。

4.2 廢水處理工藝

畜禽養(yǎng)殖廢水是ARGs 的重要儲庫之一，ARGs隨廢水排入河流或回用于農(nóng)田都可能增加環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。MCKINNEY 等[49]和SMITH 等[64]的研究 表明養(yǎng) 豬場廢水中tetQ、tetM、tetW 和tetO 具有較高的豐度。冀秀玲等[65]檢測了上海地區(qū)養(yǎng)牛場廢水中磺胺類和四環(huán)素類ARGs，發(fā)現(xiàn)含量最高的分別為sulA（108～1010cop?ies·mL-1）和tetW（106～107copies·mL-1）。HE等[3]指出，豬廢水樣品中的ARGs 至少比井水和魚塘水中高31倍。此外，在養(yǎng)殖場周圍的土壤和水環(huán)境中也檢測到高水平的ARGs。養(yǎng)殖場廢水處理對ARGs 的削減具有重要意義，不同處理工藝中ARGs 消長變化不同，且ARGs 轉(zhuǎn)歸規(guī)律尚不明晰，某些ARGs 經(jīng)過處理后甚至有增多現(xiàn)象，研究畜禽養(yǎng)殖廢水中ARGs 在處理過程以及農(nóng)田回用過程中的變化規(guī)律十分必要。厭氧消化是畜禽養(yǎng)殖場中使用廣泛的廢水生物處理工藝，產(chǎn)生的沼氣可以作為生物能源，殘?jiān)ǔＳ米饔袡C(jī)肥料[66-68]。ZHANG 等[69]的研究表明厭氧發(fā)酵降低ARGs 豐度的幅度最高可達(dá)63.9%。SUI 等[68]也指出厭氧發(fā)酵可以大幅降低ARGs 豐度，并且廢水在系統(tǒng)內(nèi)停留時(shí)間越長越有利于ARGs 的去除。厭氧消化和好氧生物處理對tetA、tetW、sul1、sul2 等ARGs 的平均去除率為33.3%～97.6%[70]。廢水處理系統(tǒng)運(yùn)行狀況受季節(jié)變化的影響，CHEN 等[71]研究發(fā)現(xiàn)，夏季ermB、ermF和ermX的去除效果比冬季好。然而，由于處理系統(tǒng)實(shí)際運(yùn)行情況不同，厭氧發(fā)酵工藝也存在使一些ARGs 水平升高的情況。ZHANG 等[69]的研究表明豬場廢水經(jīng)微波+H2O2處理后進(jìn)行厭氧消化，ARGs濃度水平有上升趨勢，其他研究中也出現(xiàn)了厭氧發(fā)酵工藝增加ARGs豐度的結(jié)果[72]。養(yǎng)殖場廢水處理工藝中，氧化塘和人工濕地也很常見，JOY 等[73]的研究結(jié)果中，豬場廢水經(jīng)氧化塘處理40 d 后，ermB 的豐度僅降低了50%～60%。由此可見，現(xiàn)行的養(yǎng)殖廢水處理工藝對抗生素抗性基因的去除效果并不理想，還需研發(fā)能夠消解養(yǎng)豬廢水中ARGs 的新技術(shù)，以降低畜禽源抗性基因的二次污染。此外，出水中高濃度ARGs的存在亦說明豬場廢水的外排是畜禽源抗性基因進(jìn)入環(huán)境中的一個(gè)重要的潛在途徑。

5 畜禽源抗生素抗性基因向各環(huán)境介質(zhì)的遷移擴(kuò)散規(guī)律

畜禽養(yǎng)殖過程中產(chǎn)生的ARGs 并不僅僅存在于養(yǎng)殖場及其周邊環(huán)境，還會通過各種農(nóng)業(yè)活動污染地表水、地下水、農(nóng)田土壤和作物等（圖1）。其中，糞便堆肥還田是畜禽養(yǎng)殖場向周圍環(huán)境輸出ARGs 的主要途徑，ARGs進(jìn)入土壤環(huán)境后會改變天然耐藥水平。許多研究表明，糞便是抗生素和ARGs 的存儲庫，禽畜糞便的施用造成土壤中抗生素抗性基因和相關(guān)耐藥菌群的增加。GU 等[74]對洱海流域的研究結(jié)果表明，施用不同動物糞肥對農(nóng)田土壤中的ARGs 具有不同的影響，施用豬糞后ARGs 豐度比對照土壤增加了36 倍，而施用雞糞和牛糞肥使ARGs 的豐度分別增加了30 倍和11 倍。糞肥中ARGs 對土壤環(huán)境的污染是長期且持續(xù)的，在ZHANG 等[27]的研究中，隨著時(shí)間的推移，施用家禽糞便的土壤中ARGs 的相對豐度雖有下降，但仍明顯高于未施用糞便的土壤中ARGs 水平。更令人擔(dān)憂的是，ARGs 隨糞肥進(jìn)入土壤增加了其對人類的暴露風(fēng)險(xiǎn)，土壤中ARGs 可能會通過內(nèi)生菌進(jìn)入植物體內(nèi)，危害農(nóng)產(chǎn)品安全，最終可能隨著食物鏈進(jìn)入人體。MARTI 等[75]在施用豬糞的土壤與其上生長的蔬菜中都檢測到多種ARGs。同時(shí)，土壤中ARGs還可能隨雨水淋溶和徑流沖刷進(jìn)一步擴(kuò)散到周圍水體環(huán)境中，在更大范圍內(nèi)傳播和富集。

圖1 畜禽源抗生素抗性基因在環(huán)境中的傳播擴(kuò)散Figure 1 Transmission and diffusion of antibiotic resistance genes from livestock and poultry farming

畜禽養(yǎng)殖業(yè)中ARGs 除了隨堆肥進(jìn)入土壤環(huán)境外，還可能通過氣溶膠進(jìn)入周圍大氣環(huán)境中。研究表明動物糞便及其接觸土壤中的ARGs 會通過氣流作用留存于空氣中，并且在處理處置期間，通過堆肥發(fā)酵、蒸發(fā)等方式被氣溶膠化，從而進(jìn)入周圍大氣環(huán)境[76-78]。目前，養(yǎng)殖場大氣環(huán)境中檢出的ARGs 種類繁多，這與養(yǎng)殖業(yè)抗生素使用密切相關(guān)，其中大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類ARGs 檢出率較高[79-80]。這可能是由于四環(huán)素類抗生素作為重要的抗菌藥物，廣泛應(yīng)用在集約化養(yǎng)殖場中用于促進(jìn)動物生長和預(yù)防疾病[81]，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素則因其能有效抑制某些革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，而被用于畜禽細(xì)菌感染性疾病的治療[82]。在養(yǎng)殖環(huán)境的大氣中發(fā)現(xiàn)的四環(huán)素類ARGs已達(dá)10 余種。養(yǎng)豬場氣溶膠中檢出13 種四環(huán)素類ARGs，肉牛養(yǎng)殖場中檢測出6 種四環(huán)素類ARGs[83]。ermA 和ermB 是最常被檢出的大環(huán)內(nèi)酯類ARGs，在養(yǎng)雞場舍內(nèi)氣溶膠中普遍存在[84]。有研究人員從養(yǎng)豬場大氣環(huán)境金黃色葡萄球菌中檢出了ermC，腸球菌和鏈球菌中檢出ermF 和mefA，并發(fā)現(xiàn)部分菌株表現(xiàn)出多重抗藥性[85-86]。大氣環(huán)境中ARGs 種類及豐度受室內(nèi)外環(huán)境條件和養(yǎng)殖情況等多重因素的影響。劉菲等[87]研究發(fā)現(xiàn)，肉雞養(yǎng)殖場舍內(nèi)外ARGs 豐度相差1～4 個(gè)數(shù)量級，雞舍內(nèi)PM2.5中ARGs 豐度明顯高于舍外。MCEACHRAN 等[83]對肉牛養(yǎng)殖場周圍空氣顆粒物的研究發(fā)現(xiàn)，下風(fēng)向氣溶膠中ARGs 豐度顯著高于上風(fēng)向。

養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs 還可能通過野鳥、飛蟲（蜜蜂、果蠅）和土壤動物（蚯蚓、跳蟲、線蟲、螨）等媒介傳播擴(kuò)散。蠅類與動物糞便中微生物群和ARGs/MGEs 的結(jié)果表明，蒼蠅可能在抗生素抗性的流行病學(xué)中發(fā)揮重要作用，監(jiān)測其生命活動可以幫助了解耐藥性的傳播動態(tài)[88]。研究顯示blaNDM在養(yǎng)雞場中能夠通過狗、蒼蠅和野生鳥類等互相傳播，并可能隨鳥類遷徙進(jìn)行長距離遷移[89]。土壤動物在ARGs的傳播中發(fā)揮重要作用，其腸道微生物可能是ARGs 的潛在儲存庫，其遷移活動或者被捕食過程會造成ARGs 的擴(kuò)散。有研究表明，長期施用雞糞增加了蚯蚓腸道中ARGs 豐度，豬糞施用也使得線蟲、跳蟲和捕食性螨中抗生素抗性增強(qiáng)[90-92]。對跳蟲-捕食性螨土壤食物鏈的研究發(fā)現(xiàn)，豬糞來源的ARGs 在土壤生態(tài)系統(tǒng)中會通過營養(yǎng)級傳遞，這說明食物鏈傳遞對土壤中ARGs 的擴(kuò)散具有重要貢獻(xiàn)[91]。但關(guān)于土壤動物在自然食物網(wǎng)和生態(tài)系統(tǒng)中傳播的研究仍然有限，且ARGs 的擴(kuò)散可能受食物網(wǎng)中動物種類及營養(yǎng)關(guān)系的重大影響。因此，針對ARGs 向不同環(huán)境介質(zhì)遷移的復(fù)雜情況，從分子層面對ARGs 的傳播擴(kuò)散機(jī)制進(jìn)行深入分析是十分必要的，并需要對畜禽養(yǎng)殖場糞污進(jìn)入周圍環(huán)境的途徑進(jìn)行管控，從而有效減少ARGs 對受納環(huán)境的污染和對生態(tài)系統(tǒng)的危害。

6 畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性基因的管控策略

解決畜禽源ARGs 污染需在養(yǎng)殖糞污產(chǎn)生、處置、利用等各環(huán)節(jié)進(jìn)行有效管控，提高畜禽養(yǎng)殖業(yè)糞污處理中ARGs 的去除效率，并最大程度地減少排放到周圍受納環(huán)境中ARGs 的數(shù)量，從而降低ARGs 對環(huán)境及人類健康的危害。在源頭控制方面，需進(jìn)一步落實(shí)獸用抗生素管控的法律法規(guī)，加強(qiáng)用藥監(jiān)督，同時(shí)積極開發(fā)并推廣使用抗生素替代品，如抗菌肽、益生菌、益生元等。這些替代品具有大部分或全部的抗生素功能，不易引起細(xì)菌的耐藥性。其中益生元還可通過調(diào)節(jié)代謝和免疫系統(tǒng)建立良好的腸道菌群，抑制病原體并促進(jìn)生長[93-94]。值得注意的是，減少抗生素使用雖然減少了動物體內(nèi)某些抗性細(xì)菌和多重耐藥細(xì)菌的豐度，卻不一定會使ARGs 的豐度降低[95]。攜帶ARGs 的質(zhì)粒頻繁接合會導(dǎo)致不使用抗生素時(shí)質(zhì)粒仍在微生物群落中存在的情況，因此，除停止獸用抗生素使用外，還需要采取相關(guān)措施，如應(yīng)用質(zhì)粒消除等技術(shù)防止耐藥質(zhì)粒接合對ARGs 豐度水平的影響。對于養(yǎng)殖場與養(yǎng)殖戶，要向其普及抗生素污染的相關(guān)知識，使其加強(qiáng)對養(yǎng)殖業(yè)ARGs 污染與擴(kuò)散造成潛在危險(xiǎn)的認(rèn)識。養(yǎng)殖場動物疾病防控工作也十分關(guān)鍵，需要及時(shí)調(diào)整動物飲食以減少疾?。ㄘi的痢疾、牛的瘤胃酸中毒等）的發(fā)生，降低人與動物的接觸頻率，優(yōu)化養(yǎng)殖場廢物收集方法，并為患病畜禽建立隔離區(qū)以控制疾病的傳播。

在過程減量環(huán)節(jié)中，要對ARGs 去除工藝條件進(jìn)一步優(yōu)化，如固體糞便采用效果良好的堆肥處理工藝，以提高ARGs 的去除效率。畜禽養(yǎng)殖業(yè)廢水處理工藝中，在好氧、厭氧等技術(shù)基礎(chǔ)上，還可以考慮加入消毒等方法，以實(shí)現(xiàn)ARGs 最大程度的削減[96-97]。針對養(yǎng)殖業(yè)廢水和廢物最終的處理處置，應(yīng)建立合理可行的法規(guī)和政策，以指導(dǎo)糞肥貯存和廢水處置等實(shí)踐。在末端治理方面，對于養(yǎng)殖環(huán)境ARGs 向各環(huán)境介質(zhì)擴(kuò)散的情況，則要加強(qiáng)對ARGs 分布的具體調(diào)查，以及對土壤、水體和大氣等多種受納環(huán)境中ARGs污染的定量分析和長期監(jiān)測，確認(rèn)ARGs 的污染區(qū)域和水平及其周年變化規(guī)律，建立相關(guān)的ARGs 污染數(shù)據(jù)庫。同時(shí)，加強(qiáng)對ARGs 生態(tài)環(huán)境危害的研究，建立抗生素抗性生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評估體系，盡可能減小ARGs對環(huán)境和人類社會造成的危害。此外，對環(huán)境中畜禽源ARGs 傳播機(jī)制及其驅(qū)動因素的深入研究也十分必要，準(zhǔn)確了解受納環(huán)境不同介質(zhì)間ARGs 的遷移及消長規(guī)律，確定不同作用機(jī)制ARGs 的關(guān)鍵宿主菌群及其傳播主導(dǎo)途徑，有助于闡明ARGs 在各環(huán)境介質(zhì)中的遷移轉(zhuǎn)化，為我國畜禽養(yǎng)殖源ARGs 的污染控制提供參考。

7 結(jié)論與展望

畜禽養(yǎng)殖活動的加劇不僅加速了環(huán)境中畜禽源微生物的進(jìn)化，還導(dǎo)致抗生素抗性基因在不同環(huán)境介質(zhì)中的多方向傳播，甚至通過食物鏈威脅人類健康。目前，關(guān)于畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs 的研究主要集中在糞便、廢水、堆肥和農(nóng)田土壤中的殘留等方面，而對于ARGs 在畜禽糞污利用、處置過程中的組成多樣性演變，及其在受納環(huán)境中的遷移、擴(kuò)散過程則較少關(guān)注。同時(shí)，該領(lǐng)域研究尚缺乏對畜禽養(yǎng)殖場內(nèi)和周圍糞污受納環(huán)境中ARGs 歸趨行為的系統(tǒng)性分析，以及對環(huán)境中ARGs 分子擴(kuò)散機(jī)制的深度剖析。針對以上問題，未來應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)以下幾方面研究：

（1）探明養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs 向受納環(huán)境的遷移與擴(kuò)散機(jī)制，以及與其遷移相關(guān)的宿主微生物種類和進(jìn)化問題。

（2）發(fā)展更加靈敏有效的方法與技術(shù)手段，獲得更準(zhǔn)確的ARGs 定量監(jiān)測數(shù)據(jù)，提供更充足的證據(jù)來闡明養(yǎng)殖過程中ARGs的分子轉(zhuǎn)移機(jī)制。

（3）深入研究ARGs 在養(yǎng)殖環(huán)境中的持久性，對其長期持久存在可能帶來的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行系統(tǒng)性評估，科學(xué)收集數(shù)據(jù)并建立完善的評價(jià)系統(tǒng)。

（4）全球ARGs 數(shù)據(jù)庫的建立和共享是急迫且必要的，了解并借鑒各國和各地區(qū)政策及措施，探索更合理的養(yǎng)殖業(yè)糞污管控方式，更有利于有效控制ARGs在畜禽養(yǎng)殖場內(nèi)的遷移并減少其向周圍環(huán)境介質(zhì)的傳播。