李亮 史碩 夏希成 王清昌 霍亞兵

摘 ?要：理論聯(lián)系實(shí)際，設(shè)計(jì)一種關(guān)于制備微生物菌肥的創(chuàng)新方法。通過植物與微生物的有效聯(lián)合，探索微生物對(duì)作物的促生效應(yīng)，從而加深學(xué)生對(duì)分子生物學(xué)理論知識(shí)的理解。該課題通過鍛煉學(xué)生對(duì)基本實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)如DNA的提取，葉綠素含量測(cè)定的掌握以及精密儀器如PCR儀器，色譜儀，凝膠成像系統(tǒng)的使用，培養(yǎng)學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)扎實(shí)的科研作風(fēng);通過提出問題-分析問題-解決問題的教學(xué)手段，培養(yǎng)學(xué)生解決科學(xué)問題的邏輯思維能力。該項(xiàng)工作模式為培養(yǎng)具有創(chuàng)新精神和創(chuàng)新能力的新時(shí)代大學(xué)生奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：印度梨形孢;小麥;生物菌肥;發(fā)酵條件;促生效應(yīng)

中圖分類號(hào)：G642 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ? ? ? ?文章編號(hào)：2096-000X（2022）13-0038-04

Abstract： An innovative method of preparing microbial fertilizer was designed by combining theory with practice. Through the effective combination of plants and microorganisms， promotion effect of microorganism on crop have been explored， which deepen students' understanding of the theoretical knowledge of molecular biology. By training students to master basic experimental operation techniques such as DNA extraction and chlorophyll content determination， as well as the use of precision instruments such as PCR instrument， chromatograph and gel imaging system， students' rigorous and solid style of scientific research were cultivated in this project. Through the teaching method of "question raising， problem analyzing and problem solving"， the logical thinking ability of students to solve scientific problems was cultivated. This work made a solid foundation for the cultivation of innovative spirit and innovative ability of college students in the new era.

Keywords： Piriformospora indica; wheat; biological fertilizer; fermentation conditions; promoting effect

科技創(chuàng)新能力是指通過科學(xué)知識(shí)的積累和創(chuàng)新性思維揭示客觀事物的本質(zhì)內(nèi)在聯(lián)系，并在此基礎(chǔ)上產(chǎn)生新穎的、前所未有的思維成果，它是一種開創(chuàng)性的探索未知的心理活動(dòng)，是人類智慧升華的表示[1]。當(dāng)代大學(xué)生科技創(chuàng)新能力的培養(yǎng)是非常重要而且必要的。創(chuàng)新教育中，注重學(xué)生學(xué)習(xí)興趣的激發(fā)、創(chuàng)新精神的培養(yǎng)、潛能的開發(fā)、個(gè)性的發(fā)展和實(shí)踐能力的提高，對(duì)提高學(xué)生綜合素質(zhì)、增加學(xué)生就業(yè)機(jī)會(huì)具有重要意義。

大學(xué)生利用課余時(shí)間進(jìn)行創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)是培養(yǎng)大學(xué)生綜合實(shí)驗(yàn)?zāi)芰Φ牧己脮r(shí)期。按照提出問題，分析問題，解決問題的思維方式，提出目前在農(nóng)業(yè)化肥使用中存在的問題。通過文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)：在過去的幾十年中，傳統(tǒng)化肥的使用極大地促進(jìn)了農(nóng)業(yè)的發(fā)展。但是研究表明，長(zhǎng)期施用化肥對(duì)土壤養(yǎng)分、結(jié)構(gòu)及生態(tài)與環(huán)境等方面均產(chǎn)生諸多不良影響， 甚至對(duì)人體健康產(chǎn)生嚴(yán)重危害[2]。專家指出，開發(fā)增產(chǎn)增收并且環(huán)保無污染的生物菌肥是發(fā)展生態(tài)農(nóng)業(yè)、實(shí)施農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展策略的一項(xiàng)重要措施。但是現(xiàn)有生物肥料的菌種與寄主植物相對(duì)專一，菌種資源不多、數(shù)量偏少、作用也參差不齊，致使實(shí)際生產(chǎn)、推廣難度大[3]。

本課題提出利用根際微生物與作物的共生關(guān)系，研發(fā)一種綠色、安全、無污染的促生型生物肥料，旨在減少因化肥造成的污染，改善土壤結(jié)構(gòu)并彌補(bǔ)現(xiàn)有生物肥料作用寄主植物單一、肥效不穩(wěn)定等缺陷。該實(shí)驗(yàn)所涉及到的微生物材料是內(nèi)生真菌印度梨形孢（Piriformosporaindica）[4]，它可以與多種作物，例如玉米、番茄、大豆、水稻、高粱、小麥等[5-7]建立共生關(guān)系并能促進(jìn)作物的生長(zhǎng)及產(chǎn)量提高。

該實(shí)驗(yàn)的目的是基于菌肥的制備并探究微生物對(duì)作物的促生作用來促進(jìn)大學(xué)生科技創(chuàng)新能力的開發(fā)與培養(yǎng)。通過該實(shí)驗(yàn)課程激發(fā)學(xué)生對(duì)科研的興趣，掌握實(shí)驗(yàn)操作中常用儀器的使用和工作原理，學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)方法的選擇、原理和操作，以及試驗(yàn)資料的收集整理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理和對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析歸納能力。通過該課題的研究，能有效地鍛煉學(xué)生理論聯(lián)系實(shí)踐的能力，有利于提高學(xué)生的研究能力、綜合能力和創(chuàng)新能力。

一、選題階段

4個(gè)學(xué)生組成一個(gè)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃團(tuán)隊(duì)，首先根據(jù)研發(fā)技術(shù)內(nèi)容的關(guān)鍵詞大量搜索文獻(xiàn)，分析該領(lǐng)域存在的問題，針對(duì)問題提出解決方案并進(jìn)行可行性分析，在此基礎(chǔ)上撰寫選題報(bào)告并與指導(dǎo)教師進(jìn)行探討，明確技術(shù)路線，并設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，整個(gè)過程由學(xué)生獨(dú)立完成，指導(dǎo)教師最終審核，將實(shí)驗(yàn)課題定為“新型微生物菌肥研發(fā)”。

二、實(shí)驗(yàn)階段

（一）實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

CM固體培養(yǎng)基、CM培養(yǎng)液、羧甲基纖維素、1×PBS、滑石粉、鹽酸、氫氧化鉀、臺(tái)盼藍(lán)、 乳酸酚、瓊脂糖、溴化乙錠、蛭石、珍珠巖、乙醇、次氯酸鈉、甲烯藍(lán)、DNA試劑盒、恒溫震蕩培養(yǎng)箱、無菌Buckner漏斗、尼龍布（400 nm）、熒光定量PCR儀、磁力攪拌器、離心機(jī)、Bio-rad凝膠電泳成像系統(tǒng)、顯微鏡、高溫高壓蒸汽滅菌鍋等。

（二）實(shí)驗(yàn)步驟

1. 印度梨形孢發(fā)酵條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)溫度梯度組，分別為20℃、23℃和26℃，設(shè)置3個(gè)不同pH值梯度組，分別是6.0、7.0和7.5，取等量印度梨形孢接種到不同條件下的CM[8]液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，觀察并統(tǒng)計(jì)生長(zhǎng)情況。

2. 印度梨形孢菌肥的制備

印度梨形孢接種于CM固體培養(yǎng)基中，接種板在23℃的黑暗環(huán)境中放置30 d后，收集孢子，接種到培養(yǎng)液中，置于溫度為23℃的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)30 d。

用無菌Buckner漏斗和尼龍布（400 nm）過濾培養(yǎng)液中的印度梨形孢，用1×PBS洗滌;在培養(yǎng)液中加入羧甲基纖維素（CMC）和印度梨形孢;取CMC懸浮液[9]與無菌滑石粉均勻混合，即制得印度梨形孢菌肥。

3. 小麥種子萌發(fā)及實(shí)驗(yàn)室施肥

土壤滅菌后（蛭石∶珍珠巖=2∶1質(zhì)量比），將菌肥與土壤分別以1∶1，1∶2，1∶3質(zhì)量配比混合均勻，形成不同比例菌肥實(shí)驗(yàn)設(shè)置，以不施肥為空白對(duì)照。

將置于4℃冰箱中春化的小麥種子經(jīng)乙醇、次氯酸鈉溶液無菌處理后，將種子置于土壤中。

4. 印度梨形孢定殖小麥根形態(tài)學(xué)觀察及真菌18S rDNA擴(kuò)增鑒定。

施加菌肥3 d后，隨機(jī)選取小麥幼苗根系，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)[10]溶液過夜染色后，于顯微鏡下觀察印度梨形孢定殖情況。

另選取小麥根系，使用DNA試劑盒提取DNA，經(jīng)PCR[11]擴(kuò)增后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，利用Image Lab 3.0軟件進(jìn)行分析。

5. 小麥促生效應(yīng)檢測(cè)

待小麥發(fā)芽后，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽種子數(shù)，計(jì)算發(fā)芽率，在播種后第7天統(tǒng)計(jì)小麥根長(zhǎng)、株高;使用乙醇研磨法[12]測(cè)得小麥葉綠素含量;使用浸泡法[13]測(cè)得小麥電導(dǎo)率，并計(jì)算相對(duì)電導(dǎo)率;使用甲烯藍(lán)比色法[14]測(cè)得吸光度，并計(jì)算根系的活躍吸收面積比，作為根系活力指標(biāo)。

（三）結(jié)果與分析

1. 發(fā)酵條件分析

如圖1所示，在溫度為23℃，pH值為7.0條件下印度梨形孢生物量顯著高于對(duì)照，其菌絲致密，孢子濃度大，對(duì)照組產(chǎn)生的菌絲透明且稀疏。通過溫度和pH的梯度實(shí)驗(yàn)，明確印度梨形孢最適生長(zhǎng)溫度為23℃，pH值為7.0。

2. 印度梨形孢共生小麥根形態(tài)學(xué)觀察及真菌18S rDNA擴(kuò)增鑒定

在40×10顯微鏡下可清晰地觀察到該真菌在植物根部定殖有橢圓形的厚垣孢子，如圖2（a）箭頭所示。以提取的DNA為模板，用引物ITS進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用擴(kuò)增的rDNA、ITS進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。電泳圖譜顯示擴(kuò)增出的片段大約200 bp （圖2b），可確定有真菌定殖于小麥根部。

3. 小麥促生效應(yīng)檢測(cè)

小麥發(fā)芽率和生長(zhǎng)參數(shù)統(tǒng)計(jì)：為了明確印度梨形孢對(duì)小麥的促生作用，對(duì)小麥發(fā)芽率和株高進(jìn)行了生物學(xué)統(tǒng)計(jì)。如圖3所示，印度梨形孢對(duì)小麥植株的生長(zhǎng)有顯著性影響，小麥種子種植在不同比例拌菌土壤中，施有菌肥小麥的發(fā)芽率、株高均優(yōu)于對(duì)照，且拌菌比例越高促生效果越明顯。

相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定：當(dāng)植物受到不良環(huán)境因素時(shí)，能傷害原生質(zhì)的結(jié)構(gòu)而引起透性改變，細(xì)胞內(nèi)含物外滲，電導(dǎo)率增大;電導(dǎo)率越大，植物受傷愈重，抗性愈弱，反之抗逆能力越強(qiáng)。在生物脅迫方面，印度梨形孢可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，如圖4（a）所示，拌菌比例為1∶1、1∶2、1∶3的實(shí)驗(yàn)組相較于對(duì)照，相對(duì)電導(dǎo)率均大幅度降低，小麥的抗逆性增強(qiáng)，這有力地說明了印度梨形孢可以誘導(dǎo)植物自身防御機(jī)制增強(qiáng)，提高抗逆能力。

葉綠素含量的測(cè)定：葉綠素是植物葉片進(jìn)行光合作用的主要色素，其含量高底在一定程度上反映了植物的光合作用水平。從圖4（b）可以看出，小麥葉片中的葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總含量均隨著拌菌比例的提高而增加，與對(duì)照相比，有明顯差異。由此得出結(jié)論，印度梨形孢定殖小麥可通過增強(qiáng)葉片的光合作用增加有機(jī)物的積累。

根系活力的測(cè)定：植物根系是活躍的吸收器官和合成器官，根的生長(zhǎng)情況和活力水平直接影響地上部分的營(yíng)養(yǎng)狀況及產(chǎn)量水平，根系活力就是一個(gè)表征植物根系的量，這里以根系的活躍吸收面積百分比作為指標(biāo)。印度梨形孢定殖到作物根部，促使了那些不溶的和凝聚的或者復(fù)雜形式的氮、磷的流動(dòng)，使寄主植物最大限度的運(yùn)用到土壤中已存在的氮、磷元素，提高根系活力。如圖4（c）所示，拌菌比例為1∶1、1∶2的實(shí)驗(yàn)組根系活力較高，而對(duì)照組的根系活力最差。這與不同拌菌比例小麥的生長(zhǎng)參數(shù)和理化性質(zhì)表現(xiàn)相一致。

（四）實(shí)驗(yàn)小結(jié)

通過“新型微生物菌肥研發(fā)”實(shí)驗(yàn)，在教師的指導(dǎo)下，學(xué)生獨(dú)立規(guī)劃和進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，熟練掌握了無菌操作的步驟以及顯微鏡、熒光定量PCR儀、離心機(jī)等精密儀器的使用，學(xué)會(huì)了使用office、origin等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，也鍛煉了學(xué)生們探索規(guī)劃、開拓創(chuàng)新的能力。但由于實(shí)驗(yàn)周期過短，學(xué)生課余時(shí)間不夠豐裕，導(dǎo)致對(duì)本實(shí)驗(yàn)探究不夠深入，具體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還需要進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

三、結(jié)束語

學(xué)生科技創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)是服務(wù)新時(shí)期高校素質(zhì)教育的需要，在實(shí)驗(yàn)過程中，學(xué)生的創(chuàng)新意識(shí)和實(shí)踐能力顯著提高，學(xué)會(huì)將專業(yè)基礎(chǔ)理論知識(shí)靈活運(yùn)用到實(shí)驗(yàn)規(guī)劃及操作中，逐漸具備主動(dòng)學(xué)習(xí)、主動(dòng)思考以及主動(dòng)創(chuàng)新的能力，并清楚認(rèn)識(shí)到合作精神是團(tuán)隊(duì)有序運(yùn)作、實(shí)驗(yàn)有序進(jìn)行的關(guān)鍵。在教師指導(dǎo)下，學(xué)生通過“自主查閱文獻(xiàn)-選題-確定實(shí)驗(yàn)方案-進(jìn)行實(shí)驗(yàn)-不斷摸索、改進(jìn)創(chuàng)新-得出實(shí)驗(yàn)結(jié)論”的流程，提高了科學(xué)實(shí)踐、科技創(chuàng)新的能力。

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