簡潔 蔣家俊 陳璐瑩 劉小華 李婉宜 許燕 周琳琳

（1. 貴陽市疾病預(yù)防控制中心檢驗科，貴州 貴陽 550000；2. 四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，四川 成都 610000）

2020 年初湖北武漢新冠疫情阻擊戰(zhàn)勝利之后，我國新型冠狀病毒肺炎（COVID?19）疫情防控工作步入常態(tài)化，多地相繼出現(xiàn)散發(fā)、聚集或多點散發(fā)聚集疫情?，F(xiàn)場和分子流行病學(xué)調(diào)查分析顯示，引起這些疫情的新型冠狀病毒（SARS?CoV?2）均由境外輸入[1]。截至2022 年1 月12 日，全球范圍內(nèi)由新型冠狀病毒（SARSCoV-2）感染導(dǎo)致的肺炎確診病例（新冠病例）共計314385600 例，死亡病例高達(dá)5524795 例，我國累計確診病例134636 例，現(xiàn)有確診病例6737例，累計死亡病例5699 例，新型冠狀病毒肺炎依舊是全國及全球范圍內(nèi)的主要公共衛(wèi)生問題。

有研究報道，SARS?CoV?2 在體外存活時間會受到氣候、光照、溫度、濕度、病毒載量、物表材質(zhì)等多種因素的影響[2]。疫情初期，中國疾控中心病毒所首次從武漢華南海鮮市場的兩批次共585 份環(huán)境樣本中，檢測到 33 份新型冠狀病毒核酸陽性樣本，并成功從核酸陽性的環(huán)境標(biāo)本中分離到病毒，證實環(huán)境樣本中存在COVID – 19。另外有研究報道，在4℃的環(huán)境下，SARS-CoV-2可以存活至少14 天[3,4]。

《新型冠狀病毒肺炎防控方案》（第8 版）要求對進(jìn)口冷鏈?zhǔn)称芳捌浼庸?、運輸、存儲、銷售場所環(huán)境，進(jìn)口高風(fēng)險非冷鏈集裝箱貨物進(jìn)行抽

樣核酸檢測，還需對設(shè)有發(fā)熱門診的醫(yī)療機(jī)構(gòu)的環(huán)境定期開展核酸檢測。貴陽市自2020 年2 月22 日本地新冠病例清零后，截至目前無新增本土病例。但是在環(huán)境監(jiān)測過程中，共出現(xiàn)過2 次新冠病毒核酸RT-PCR 陽性。然而，環(huán)境樣本很難通過流行病學(xué)調(diào)查追蹤溯源，并且會受到疫苗接種污染的影響，無法溯源會大大影響疫情的防控，故對環(huán)境樣本進(jìn)行SARS-CoV-2 全基因組測序顯得尤為重要。因此，我們對2 起事件共5 份標(biāo)本進(jìn)行了SARS-CoV-2 全基因組測序，以探索全基因組測序在檢測環(huán)境標(biāo)本中SARS-CoV-2 的應(yīng)用，另一方面，也從分子流行病學(xué)角度為我市新冠肺炎疫情的溯源和防控工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

在貴陽市開展環(huán)境核酸監(jiān)測過程中，截止2021 年11 月共發(fā)現(xiàn)2 次新冠病毒核酸RT-PCR陽性，樣本均送至市疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行復(fù)核，復(fù)核結(jié)果也為SARS-CoV-2 核酸陽性。為了及時追蹤病毒來源，為疫情防控提供科學(xué)依據(jù)，我們共選取了5 份病毒核酸載量相對較高的樣本進(jìn)行了SARS-CoV-2 全基因組測序。

1.2 核酸提取與SARS-CoV-2 核酸檢測

采用核酸提取及純化試劑盒（上海伯杰，磁珠法），取標(biāo)本200μL 于對應(yīng)孔內(nèi)，使用全自動磁珠核酸提取儀（上海伯杰）進(jìn)行核酸提取。利用新冠病毒核酸檢測試劑（上海伯杰）對所獲得的核酸進(jìn)行SARS-CoV-2 RT-PCR 檢測。

1.3 全基因組文庫構(gòu)建和測定

以提取的病毒 RNA 作為模板，使用ULSEN超高靈敏度新冠病毒全基因組捕獲試劑盒（低載量）（北京微未來）、Nextera XT Library Preparation Kit（Illumina，美國）、Nextera XT Index Kit（Illumina，美國）進(jìn)行文庫構(gòu)建。（1）使用ULSEN超高靈敏度新冠病毒全基因組捕獲試劑盒（低載量）（北京微未來）對SARS-CoV-2 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及全基因組擴(kuò)增，再對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行濃縮、純化；（2）使用 Nextera XT Library Preparation Kit（Illumina，美國）和Nextera XT Index Kit（Illumina，美國）進(jìn)行雙鏈DNA 片段化和文庫構(gòu)建、純化及均一化；（3）采用Illumina Miseq 二代測序系統(tǒng)、Micro Miseq 芯片及配套試劑（Illumina，美國）對構(gòu)建的文庫進(jìn)行全基因組測序。

1.4 全基因組序列拼接與比對

使用fastp 0.20.1 對測序原始下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行剪切，之后以NCBI 中的SARS?CoV?2 Wuhan-Hu-1（Genbank: NC_045512.2）基因組作為參考序列，使用bowtie 2 軟件對剪切后的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行序列拼接，再用Picard 軟件刪除重復(fù)序列，最后使用samtools v1.11 和VarScan v2.4.0 軟件識別宿主內(nèi)的變異位點和獲得樣本中病毒的基因組序列。

使用 Nextclade 在線分析平臺（https：//clades.nextstrain.org/）和Pangolin 在線分型平臺（https：//pangolin.cog?uk.io/）進(jìn)行基因組序列比對和分型。

2 結(jié)果

2.1 樣本信息

2 起事件共5 份樣本。具體信息見表1。

表1 貴陽市SARS-CoV-2 核酸陽性環(huán)境樣本信息

2.2 樣本全基因組測序信息

5 份樣本是在不同的時間進(jìn)行的全基因組測序，1、2、3 號為同一批次，4 號和5 號為同一批次。以SARS-CoV-2 武漢株（NC_045512.2）為參考基因組，樣本基因組覆蓋度及平均測序深度詳見表2。1、2、3 號的基因組覆蓋度均小于50%，且2 號和3 號的測序平均深度均較小，特別是3號樣本，其測序平均深度為8X。盡管1 號測序平均深度為718X，但其基因組覆蓋度僅為40.21%，提示樣本存在核酸降解。4 號和5 號的測序平均深度分別為894X 和598X，其基因組覆蓋度分別為95.39%和93.87%，提示本次測序獲得了大部分的基因序列。

表2 SARS-CoV-2 全基因組測序信息

2.3 樣本中SARS-CoV-2 分型

對所得的5 條序列進(jìn)行基因型分析，基于Pango 命名法，只有4 號及5 號能夠判斷基因型，均屬于B.1.617.2.33（Lineage AY.33）進(jìn)化分支，屬于Delta 變異株。此進(jìn)化分支最早在2020 年12月12 日出現(xiàn)，目前主要在丹麥、德國、瑞典、比利時和美國流行。而Nextclade 分型法，對測序質(zhì)量要求更高，所獲得的5 條序列均無法用該方法進(jìn)行分型。由于測序質(zhì)量較差，即使通過特征變異位點也無法對1、2、3 號樣本進(jìn)行分型。

表3 SARS-CoV-2 基因型

3 討論

新型冠狀病毒肺炎的主要傳播途徑為經(jīng)呼吸道飛沫和接觸傳播，接觸病毒污染的物品也可造成感染，在相對封閉的環(huán)境中長時間暴露于高濃度氣溶膠情況下存在經(jīng)氣溶膠傳播的可能[5]。故對重點場所環(huán)境物表進(jìn)行新冠病毒核酸檢測，能夠及時發(fā)現(xiàn)、處置、管控零星病例及小規(guī)模聚集性疫情，防止疫情擴(kuò)散，保護(hù)群眾健康。此外，經(jīng)過數(shù)次疫情處置和溯源工作經(jīng)驗的積累，堅持“人物同防”成為我國常態(tài)化階段外防輸入的重要舉措[1]。

自COVID-19 在全球爆發(fā)以來，基因組測序技術(shù)以特異性高、檢測速度快和低成本的優(yōu)勢，在疫情防控、防治等方面起到重要作用[6]。全基因組測序分析不僅有助于了解新型冠狀病毒的變異情況、有更加深刻的認(rèn)識病毒基因序列，還可以提高對新型冠狀病毒的檢出復(fù)核效能和病毒傳播的追蹤分析準(zhǔn)確性[7]。任麗麗等[8]利用 Illumina NGS 的測序平臺，對2019 年12 月18 日武漢市的5 例肺炎患者肺泡灌洗液( BAL) 臨床標(biāo)本進(jìn)行實驗研究，確認(rèn)為新發(fā)現(xiàn)的病原體，即2019-nCoV。王佶等[9]利用全基因組測序，表明2020 年12 月的大連新冠疫情是一起由SARS?CoV?2 污染的進(jìn)口冷鏈產(chǎn)品感染碼頭工人導(dǎo)致的本土疫情，在傳播過程中至少形成了3 個病毒代際和3 個相對獨立的傳播鏈。

在本研究中，由于第1 起事件中的樣本質(zhì)量差，無法獲得有效的序列進(jìn)行比對和分型，故無法進(jìn)行溯源，但是在吸取第1 次全基因組測序的經(jīng)驗后，我們在對第2 起事件中的2 個環(huán)境涂抹物進(jìn)行全基因組測序時，進(jìn)行了條件優(yōu)化，在文庫構(gòu)建前再一次進(jìn)行了濃縮及純化。所以盡管前3 份標(biāo)本的Ct 值與后2 份標(biāo)本的Ct 值差異不明顯，但是第二次測序的結(jié)果不僅能夠?qū)Σ《具M(jìn)行分型，還能追溯病毒的潛在來源，從分子流行病學(xué)角度為我市新冠肺炎疫情的溯源和防控工作提供科學(xué)依據(jù)。

此外，由于疫苗的大規(guī)模接種，在接種環(huán)節(jié)中注射器排空氣體，以及安瓿瓶和注射器內(nèi)疫苗殘留物的揮發(fā)，均可能產(chǎn)生含有大量長鏈核酸片斷的氣溶膠，污染周圍環(huán)境，導(dǎo)致在環(huán)境監(jiān)測過程中出現(xiàn)陽性結(jié)果。通過全基因組測序，我們能夠判定對病毒進(jìn)行分型和溯源，避免由于疫苗接種引起的環(huán)境陽性造成人員恐慌，浪費人力物力，同時也能夠及時發(fā)現(xiàn)毒株的傳播，及時為疫情的防控提供有力的判定依據(jù)。