張達(dá)娟，畢相東，張樹林，戴偉，王雪瑩

(天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384)

隨著工業(yè)進(jìn)程的加快和人們生活水平的提高，化石燃料的大量使用導(dǎo)致大氣中CO2含量持續(xù)增加。海洋作為CO2重要的匯，以每小時(shí)100萬t以上的速率從大氣中吸收CO2[1]，經(jīng)過一系列反應(yīng)使海水H+濃度增加、pH降低，從而引起海水酸化。工業(yè)革命前，全球海洋的平均pH為8.2，目前已降至8.1，至21世紀(jì)末預(yù)計(jì)將再降低0.25個(gè)pH單位，pH每降低1個(gè)單位，海水中H+濃度會升高10倍[2]，海水pH若降低0.25個(gè)單位，H+濃度將比工業(yè)革命前增加125%，依賴于海洋環(huán)境的浮游生物將受到一定的影響[3]，甚至通過食物鏈放大影響。

海水酸化對不同浮游植物的影響還受其他環(huán)境因子的影響，如海水溫度升高[9-11]、紫外線增強(qiáng)[8,12-13]和金屬離子濃度改變等。其中，F(xiàn)e作為重要的金屬離子，一直作為研究重點(diǎn)，伴隨酸化發(fā)生，海水pH降低，其中游離Fe離子濃度會相應(yīng)增加[14]，F(xiàn)e(Ⅱ)的穩(wěn)定性提高，F(xiàn)e(Ⅲ)溶解度發(fā)生改變[15]，其生物可利用度會增加[16]。大量“鐵假說”試驗(yàn)表明，在太平洋東北部高營養(yǎng)鹽、低葉綠素a海域中投放Fe，會促進(jìn)浮游植物的生長，提高其生物量[17]，海水酸化通過影響浮游植物對Fe離子的吸收利用而間接影響其生長[18]。近岸海域Fe離子濃度較大洋高，一般為十幾到幾十納摩爾每升水平[19]，對浮游植物的影響更為復(fù)雜。本研究中，為進(jìn)一步探討酸化和Fe離子對浮游植物的影響，選擇近海常見浮游植物中肋骨條藻Skeletonemacostatum作為受試種類，通過測定其葉綠素?zé)晒鈪?shù)，闡明CO2酸化和Fe離子對中肋骨條藻細(xì)胞光化學(xué)活性的影響，以期為評估海水酸化背景下中肋骨條藻的生理生態(tài)響應(yīng)特征提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

中肋骨條藻購于上海光語生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藻種的培養(yǎng) 選用f/2培養(yǎng)基[20]，培養(yǎng)溫度(22±2)℃，光照強(qiáng)度為(80±10)μmol/(m2·s)，光暗比為12L∶12D。

1.2.2 酸化海水的制備

人工海水的制備:為避免自然海水中Fe離子對試驗(yàn)結(jié)果的影響，本研究中所用海水為人工海水[21]，除FeCl3·6H2O有變外其他成分保持不變。

酸化海水的制備:試驗(yàn)設(shè)1個(gè)對照組和1個(gè)處理組，均為人工海水配制的不含F(xiàn)e離子的f/2培養(yǎng)基，分別向?qū)φ战M和處理組中通入CO2含量為0.038%(2013年全球大氣CO2含量平均水平，NOAA/ESRL)和0.08%(2100年大氣平均CO2含量預(yù)測水平[22])的混合氣體(購自天津安利達(dá)氣體有限公司)。氣體流量用流量計(jì)控制在300 mL/min，利用pH計(jì)監(jiān)測培養(yǎng)基中pH變化情況，待到pH穩(wěn)定后酸化海水制備完成。不同CO2含量的混合氣體中氧氣含量均為21.00%，氮?dú)夂糠謩e為78.96%和78.92%。

1.2.3 Fe(Ⅲ)濃度(均為質(zhì)量濃度，下同)的設(shè)定 配制FeCl3·6H2O母液，在酸化處理后，取一定量的FeCl3·6H2O母液，使不同酸化組內(nèi)均包含1.5、2.0、3.0、4.0 μg/L 4個(gè)Fe(Ⅲ)濃度。

1.2.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)開始前3 d，將中肋骨條藻轉(zhuǎn)移至不含F(xiàn)e(Ⅲ)的培養(yǎng)基中暫養(yǎng)，使吸附在藻細(xì)胞上的Fe(Ⅲ)消耗代謝完畢。每個(gè)CO2水平設(shè)4個(gè)Fe(Ⅲ)濃度組，每組設(shè)3個(gè)平行。試驗(yàn)用培養(yǎng)液制備完成后接種中肋骨條藻，各組初始密度均為5×105cells/mL。接種后，對藻液持續(xù)通入相應(yīng)混合氣體直至試驗(yàn)結(jié)束，氣體流量為300 mL/min。試驗(yàn)共進(jìn)行6 d，每隔24 h取樣一次，用于測定各組細(xì)胞密度及相關(guān)葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動力學(xué)參數(shù)。

1.2.5 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定 用葉綠素?zé)晒夥治鰞x(Phyto-PAM, Walz, 德國)測定中肋骨條藻葉綠素?zé)晒鈪?shù):初始熒光(F0)、最大熒光(Fm)、穩(wěn)態(tài)熒光(Fs)、光適應(yīng)下最大熒光(Fm′)和最大電子傳遞速率(rETR),具體操作參考張媛媛等[23]的方法，然后根據(jù)下式計(jì)算最大光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)、實(shí)際光能轉(zhuǎn)化效率(ΦPSⅡ)和有效光能轉(zhuǎn)化效率(Yield)：

Fv/Fm=(Fm-F0)/Fm，

(1)

ΦPSⅡ=(Fm′-Fs)/Fm′，

(2)

Fv′=Fm′-F0′，

(3)

Yield=Fv′/Fm′，

(4)

F0′=1/(1/F0-1/Fm+1/Fm′)。

(5)

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示。采用 SPSS 19.0軟件進(jìn)行雙因素方差分析(two-way ANOVA)，分析海水酸化和不同F(xiàn)e(Ⅲ)濃度對中肋骨條藻各葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響，若存在CO2含量和Fe(Ⅲ)的交互作用，則對相同CO2含量水平下不同F(xiàn)e(Ⅲ)濃度組進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)和多重比較(Tukey)。利用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)分析相同F(xiàn)e(Ⅲ)濃度條件下不同酸化處理之間的差異性。顯著性水平設(shè)為0.05,極顯著水平設(shè)為0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 海水酸化和Fe(Ⅲ)對中肋骨條藻生長的影響

從圖1可見:CO2含量、Fe(Ⅲ)濃度及二者的交互作用均對中肋骨條藻細(xì)胞密度有顯著性影響(P<0.05)；CO2含量為0.038%時(shí)，各Fe(Ⅲ)濃度組藻細(xì)胞密度自第4天開始顯著升高(P<0.05)，至培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，1.5、2.0 μg/L Fe(Ⅲ)處理組藻細(xì)胞密度分別為12.09×105、15.06×105cells/mL，顯著高于3.0、4.0 μg/L Fe(Ⅲ)處理組(P<0.05);CO2含量為0.08%時(shí)，不同濃度的Fe(Ⅲ)對中肋骨條藻生長自培養(yǎng)第1天開始就具有顯著性影響(P<0.05)，F(xiàn)e(Ⅲ)濃度分別為3.0、4.0 μg/L時(shí)，其生長速度較快，至培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，中肋骨條藻細(xì)胞密度分別為14.48×105、12.89×105cells/mL，顯著高于1.5、2.0 μg/L Fe(Ⅲ)處理組(P<0.01)，但與CO2含量為0.038%時(shí)1.5、2.0 μg/L Fe(Ⅲ)處理組的細(xì)胞密度基本持平。

標(biāo)有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)。

獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)表明，當(dāng)Fe(Ⅲ)濃度分別為1.5、2.0 μg/L時(shí)，0.038% CO2組中藻細(xì)胞密度顯著高于0.08% CO2組(P<0.05)，但當(dāng)Fe(Ⅲ)濃度分別為3.0、4.0 μg/L時(shí)，0.038% CO2組中藻細(xì)胞密度則顯著低于0.08% CO2組(P<0.05)。

2.2 海水酸化和Fe(Ⅲ)對葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

海水CO2含量、Fe(Ⅲ)濃度及二者的交互作用均在培養(yǎng)的第1天開始對中肋骨條藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)產(chǎn)生極顯著影響(P<0.01)，并持續(xù)至試驗(yàn)結(jié)束(表1)。CO2含量為0.038%時(shí)，不同F(xiàn)e(Ⅲ)濃度處理組中肋骨條藻Fv/Fm、ΦPSⅡ、Yield和rETR變化趨勢基本相同，從第4天開始，不同濃度的Fe(Ⅲ)對葉綠素?zé)晒鈪?shù)均產(chǎn)生顯著的促進(jìn)作用(P<0.05)(表2)；CO2含量為0.08%時(shí)，濃度為1.5、2.0 μg/L的Fe(Ⅲ)對中肋骨條藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)均產(chǎn)生顯著的抑制作用(P<0.05)，且抑制作用在培養(yǎng)第1天時(shí)就開始出現(xiàn)，而濃度為3.0、4.0 μg/L的Fe(Ⅲ)則具有顯著的促進(jìn)作用(P<0.05)(表3)。

表1 海水酸化和不同F(xiàn)e(Ⅲ)濃度對中肋骨條藻光合系統(tǒng)Ⅱ各指標(biāo)影響的雙因素分析

相同F(xiàn)e(Ⅲ)濃度下，海水酸化(0.08% CO2)對中肋骨條藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響存在一定差異。當(dāng)Fe(Ⅲ)濃度分別為1.5、2.0 μg/L時(shí)，海水酸化總體上對中肋骨條藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)均存在顯著的抑制作用(P<0.05)，用1.5 μg/L Fe(Ⅲ)處理至培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，酸化組的Fv/Fm、ΦPSⅡ、Yield和rETR比0.038% CO2組分別降低46.6.%、61.4%、49.2%和60.0%；當(dāng)Fe(Ⅲ)濃度分別為3.0、4.0 μg/L時(shí)，海水酸化對中肋骨條藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)略有促進(jìn)作用，用4.0 μg/L Fe(Ⅲ)處理至培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，酸化組中Yield和rETR分別比0.038% CO2組高1.3%和2.1%，但無顯著性差異(P>0.05)(表2、表3)。

表2 0.038% CO2處理組Fe(Ⅲ)濃度對中肋骨條藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

表3 0.08% CO2處理組Fe(Ⅲ)濃度對中肋骨條藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

3 討論

3.1 海水酸化對中肋骨條藻生長的影響

3.2 Fe(Ⅲ)對中肋骨條藻生長的影響

Fe離子是浮游植物生命過程中必需的微量營養(yǎng)元素，是其生長的重要限制因子之一。Fe離子濃度過低，會使光合作用傳遞鏈中所有含F(xiàn)e離子的細(xì)胞色素含量下降，藻類PSⅡ的光合作用效率及能量轉(zhuǎn)化效率顯著下降[29]。在缺Fe離子條件下，三角褐指藻的Fv/Fm顯著降低，而重新加入Fe離子24 h后，F(xiàn)v/Fm恢復(fù)到原來水平[30]；Fe離子濃度為10-9～10-6mol/L時(shí)，隨著Fe離子濃度的增加，對尖刺菱形藻Pseudonitzschiapungens光合放氧和葉綠素合成起到促進(jìn)作用[31]。本研究中，在CO2含量為0.038%的條件下，不同濃度的Fe(Ⅲ)從第4天開始對中肋骨條藻的各葉綠素?zé)晒鈪?shù)產(chǎn)生顯著的促進(jìn)作用；海水酸化(CO2含量0.08%)后，1.5、2.0 μg/L Fe(Ⅲ)對中肋骨條藻各葉綠素?zé)晒鈪?shù)自第1天開始產(chǎn)生顯著的抑制作用，并持續(xù)至培養(yǎng)結(jié)束，而Fe(Ⅲ)濃度為3.0、4.0 μg/L的組中肋骨條藻相應(yīng)葉綠素?zé)晒鈪?shù)指標(biāo)水平與CO2含量0.038%時(shí)低濃度Fe(Ⅲ)(1.5、2.0 μg/L)組相當(dāng)，F(xiàn)e(Ⅲ)對其光合作用的影響快于對生長的影響，推測是浮游植物首先通過光合作用準(zhǔn)備足夠的物質(zhì)和能量，而后生長才能進(jìn)行。而在CO2含量為0.08%的酸化條件下，低濃度Fe(Ⅲ)抑制其正常的光合反應(yīng)過程，這可能是由于酸化條件下浮游植物對Fe離子的吸收率降低[18]、細(xì)胞膜氧化還原特性及相關(guān)酶活性改變[8]引起的，而高濃度Fe(Ⅲ)則可通過增大捕光色素復(fù)合體的面積來促進(jìn)光吸收，進(jìn)而提高光合作用速率及生長。

浮游植物通過光能來同化無機(jī)碳的過程是海洋物質(zhì)循環(huán)和能量流動的重要基礎(chǔ)，它們把溶解態(tài)CO2轉(zhuǎn)化為顆粒態(tài)，是“生物泵”的一個(gè)重要生物學(xué)過程。海洋從大氣中吸收CO2的量依賴于生物泵，也依賴于酸化所產(chǎn)生的效應(yīng)。海水酸化和其他環(huán)境因子對浮游植物的影響與其種類特性、細(xì)胞大小及對環(huán)境適應(yīng)能力有關(guān)，海洋酸化對浮游植物生理過程影響的差異必然會引起浮游植物群落結(jié)構(gòu)變化。

4 結(jié)論

1)CO2含量為0.038%條件下，較低Fe(Ⅲ)濃度可以顯著促進(jìn)中肋骨條藻生長，海水酸化(CO2含量0.08%)后，需要較高Fe(Ⅲ)濃度才能保持相似增長水平。

2)CO2含量為0.038%條件下，中肋骨條藻細(xì)胞PSⅡ光化學(xué)活性隨Fe(Ⅲ)濃度升高而增加；海水酸化(CO20.08%)后，僅Fe(Ⅲ)濃度為3.0、4.0 μg/L時(shí)對光化學(xué)活性表現(xiàn)出促進(jìn)作用，并與0.038% CO2含量下相當(dāng)；相同F(xiàn)e(Ⅲ)濃度下，酸化會引起藻細(xì)胞PSⅡ光化學(xué)活性降低。