吳 碩， 張 興 文， 呂 菁 萍， 王 競

(大連理工大學 環(huán)境學院,遼寧 大連 116024 )

0 引 言

以藥品及個人護理品、溴代阻燃劑和內(nèi)分泌干擾物等為代表的微量有機污染物(organic micropollutants，OMPs)，雖然在環(huán)境中處于低濃度水平，但因具有三致毒性、生長毒性以及生殖毒性等[1-2]，極易對生態(tài)環(huán)境和人類健康造成危脅[3-5]，從而引起了廣泛關注．其中，雙酚A(bisphenol A，BPA)作為一種典型的OMPs，被大規(guī)模應用于工業(yè)生產(chǎn)中．BPA可通過污水溢流、人類活動及地表徑流等途徑進入海洋環(huán)境[6-7]．現(xiàn)階段BPA已在全球海洋環(huán)境中被廣泛檢測到，濃度范圍在10-9～10-6g·L-1[7-9]．毒理學研究顯示，BPA與雌性激素結(jié)構(gòu)類似，是一類典型的內(nèi)分泌干擾物，可對人類的生殖及免疫系統(tǒng)產(chǎn)生毒害作用[10]．

生物降解則是自然環(huán)境中消除BPA的重要途徑．已有研究指出，陸域真菌、陸域細菌等微生物可以實現(xiàn)BPA的生物降解[11-12]．而海洋環(huán)境中普遍存在的各類微生物，也展現(xiàn)出對BPA的生物降解能力：Ying等[13]利用澳大利亞南部海岸海洋底泥微生物菌群，實現(xiàn)BPA的生物降解；Ben Ouada等[14]研究發(fā)現(xiàn)，皮囊藻對BPA存在良好的去除效果，可用作BPA的生物修復劑；Sakai等[15]則使用海水中分離出的純菌Sphingomonassp.菌株BP-7降解BPA．在實際海洋環(huán)境中，大部分的海洋微生物都傾向于附著在海底礁石、動植物殘骸等載體表面，以生物膜形式生長．生物膜則為微生物提供了穩(wěn)定良好的生存環(huán)境，并可以影響微生物的代謝活性[16-17]．因此，相較于游離細菌，以生物膜形式存在的海洋細菌可能顯現(xiàn)出不同的污染物降解特性，進而影響物質(zhì)歸趨．但目前海洋細菌生物膜對海洋環(huán)境中BPA歸趨的影響尚未見報道．

因此，本文選取海洋源假交替單胞菌GCY(Pseudoalteromonassp.，GCY)進行研究，該菌屬廣泛分布于全球海洋環(huán)境中，且菌株GCY在游離狀態(tài)下可以產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)．對該菌株進行掛膜培養(yǎng)，以探究菌株GCY生物膜對BPA的降解特性和降解途徑．

1 材料與方法

1.1 實驗材料

(1)菌株

(2)培養(yǎng)基

菌株活化培養(yǎng)基為2216E培養(yǎng)基，配方為酵母浸粉1 g·L-1、蛋白胨5 g·L-1．降解實驗所用的培養(yǎng)基均為酵母浸粉培養(yǎng)基，配方為酵母浸粉6 g·L-1．實驗所用培養(yǎng)基均以人工海水為溶劑，并調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH至8.0．

(3)載體材料

本實驗采用泡沫炭作為生物膜培養(yǎng)的載體材料．

1.2 實驗方法

1.2.1 生物膜培養(yǎng) 將菌體接種到100 mL無菌2216E培養(yǎng)基內(nèi)，在25 ℃恒溫搖床中以150 r·min-1的轉(zhuǎn)速連續(xù)培養(yǎng)12 h，至菌體達到對數(shù)生長期再離心收菌，用無菌的人工海水沖洗菌餅備用．

生物膜的培養(yǎng)方法參照Li等的方法，并在此基礎上做出改進[19-21]．將泡沫炭裁剪成1 cm×1 cm×2 cm的小立方體，用超純水清洗數(shù)次烘干后滅菌．使用支架固定，放置于100 mL酵母浸粉培養(yǎng)基中，將活化后的菌體接種到泡沫炭上．在恒溫搖床內(nèi)培養(yǎng)96 h，得到生物膜．

1.2.2 BPA降解實驗 為探究附著態(tài)微生物與游離態(tài)微生物對不同污染物降解能力的差異，設置了如下實驗對照組，每組設置3個平行：

(1)生物膜體系

按照前文所述方法培養(yǎng)生物膜后，取出生物膜并用無菌PBS溶液輕輕沖洗后，接種到添加了10 mg·L-1BPA的100 mL酵母浸粉培養(yǎng)基中．

(2)游離菌體系

游離態(tài)細菌活化后，取與生物膜相同的初始生物量接種到添加了10 mg·L-1BPA的100 mL 酵母浸粉培養(yǎng)基中．

整個降解實驗在25 ℃恒溫搖床(150 r·min-1)中進行，分別在細菌生長的對數(shù)期、穩(wěn)定期取樣，離心(10 000 r·min-1，5 min)后取上清液過0.22 μm濾膜，分別測定兩個體系內(nèi)的污染物濃度．

1.2.3 降解定位與活性物種鑒定 為確定BPA降解發(fā)生的位置，進行了降解定位實驗：參照顧晨[22]的方法，獲取胞內(nèi)、胞周及胞外提取液，并向提取液中分別加入10 mg ·L-1的BPA．避光反應5 h后測定BPA濃度．

1.2.4 ROS及相關酶測定 在降解實驗的同時，于對數(shù)期和穩(wěn)定期進行取樣測定胞外液中ROS生成情況及相關酶活性，測定方法如下：

(1)超氧陰離子自由基

(2)過氧化氫的測定

H2O2的測定使用DPD(N，N-diethyl-p-phenylenediamine)/POD(horseradish peroxidase)法[24]．

(3)羥基自由基

?OH采用苯甲酸液相色譜法進行測定[25]．

(4)L-氨基酸氧化酶(L-amino acid oxidase，LAAO)活性

向胞外液中添加等體積5 g·L-1的亮氨酸溶液，反應30 min后測定體系中H2O2的增量．

(5)鐵載體

鐵載體采用CAS法進行測定．向胞外液樣品中加入等體積的CAS溶液，混勻放置30 min，以酵母浸粉培養(yǎng)基作為空白對照，在630 nm下測定吸光度．

1.2.5 BPA及降解產(chǎn)物測定 BPA使用高效液相色譜法進行測定[26]，采用Elite C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)，流動相A為甲醇，流動相B為超純水，V(A)∶V(B)=80∶20，流動相流速為0.8 mL·min-1，柱溫為40 ℃，紫外檢測器在273 nm波長下進行測定．單個樣品檢測時間為10 min．并使用Origin軟件進行降解動力學擬合，由于生物降解為單反應物反應體系，故通常選擇一級反應動力學模型進行動力學擬合，擬合公式如下：

lnc/c0=-kt

式中：c為污染物在t時刻的濃度，c0為污染物的初始濃度，k為一級反應動力學常數(shù)，t為時間．

降解產(chǎn)物采用液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)進行測定，生物膜體系在降解反應36 h及72 h后，離心取上清液過0.22 μm濾膜．色譜柱使用Xterra MS C18反相柱(5 μm，2.1 mm×100 mm，Waters，Milford，MA)．流動相A為乙腈，流動相B為0.01%的氨水，V(A)∶V(B)=60∶40，流速為0.25 mL·min-1．檢測模式為負模式．質(zhì)譜離子源為電噴霧離子化源(ESI)，以SCAN模式掃描，m/z掃描范圍為80～400．鞘氣為N2，流速為8.0 L·min-1．

2 結(jié)果與討論

2.1 生物膜降解BPA動力學特性

實驗結(jié)果表明，降解過程主要發(fā)生在12～48 h(圖1(a))．游離菌體系在接入降解培養(yǎng)基的前12 h內(nèi)，并未發(fā)生明顯的降解反應，為降解停滯期；而生物膜體系卻在12 h降解了13%的BPA，出現(xiàn)了降解提前的現(xiàn)象．并且在12～48 h，生物膜體系對BPA的降解效果始終優(yōu)于游離菌體系．

對BPA生物降解過程進行動力學擬合，發(fā)現(xiàn)兩體系中的降解過程均符合準一級反應動力學(圖1(b))．生物膜體系與游離菌體系的降解速率常數(shù)分別為0.042 5 h-1和0.037 4 h-1，降解反應的半衰期t1/2分別為16.3 h和18.5 h．這表明生物膜體系相較于游離菌體系，可以更快速地降解BPA．

2.2 BPA生物降解定位與活性物種鑒定

首先通過降解定位實驗，確定生物膜體系與游離菌體系的BPA生物降解位置．兩體系的胞內(nèi)和胞周提取液均無法降解BPA，但胞外液則可以降解BPA(圖2)．生物膜體系胞外液可降解73%的BPA，游離菌體系的胞外液可降解68%的BPA．由此推斷，BPA的降解主要發(fā)生在胞外．

(a)BPA降解曲線

圖2 不同細胞部分對BPA的降解Fig.2 BPA degradation by different cell fractions

圖3 活性物質(zhì)淬滅實驗的相對降解率RFig.3 Relative degradation efficiency R of quenching experiment for reactive substance

2.3 降解過程中ROS及相關酶

生物膜體系的H2O2產(chǎn)量始終高于游離菌體系，這一產(chǎn)量提升的現(xiàn)象在24 h及48 h尤為顯著，分別提升了115%和45%(圖4(a))．這也可以解釋24 h時間點的淬滅實驗中，H2O2主導的降解反應占比提升的現(xiàn)象．菌株GCY生成胞外H2O2的過程由LAAO參與[22]，因此本實驗考察了兩體系的LAAO酶活性(圖4(b))．菌株GCY在生長的各個階段均檢測到LAAO酶活性，且生物膜體系均高于游離菌體系．值得注意的是，在24 h生物膜體系內(nèi)檢測到的LAAO酶活性為游離菌體系的1.85倍，這也解釋了24 h兩體系中H2O2產(chǎn)量差異巨大的原因．

(a)菌株生長各個時期H2O2產(chǎn)量

圖5 菌株GCY的胞外生成情況Fig.5 Extracellular production of strain GCY

研究指出H2O2可與Fe(Ⅱ)或鐵載體絡合的Fe(Ⅱ)發(fā)生類芬頓反應產(chǎn)生?OH并降解污染物[22]．因此，測定了降解過程中的?OH與鐵載體產(chǎn)量的變化(圖6)．在BPA存在的條件下，生物膜體系中的?OH產(chǎn)量最高可達0.55 μmol·L-1，為同時刻游離菌體系的1.3倍．在生物膜體系中檢測到了更明顯的鐵絡合現(xiàn)象．這表明生物膜體系相比于游離菌體系，鐵載體活性更高．這與兩體系中?OH 的生成趨勢相一致．

(a)?OH產(chǎn)量

2.4 降解途徑推測

對生物膜體系降解BPA的中間產(chǎn)物進行鑒定，并推測BPA的生物降解途徑．共檢測出5個BPA中間產(chǎn)物，分別為產(chǎn)物A、B、C、D、E，中間產(chǎn)物的m/z及命名如表1所示．

表1 BPA降解中間產(chǎn)物Tab.1 Intermediates detected in BPA degradation

首先?OH攻擊BPA兩苯環(huán)之間的C—C單鍵，發(fā)生異丙基斷裂，生成對異丙基苯酚自由基(產(chǎn)物A)和苯酚(產(chǎn)物B)，這與Dong等[29]利用高級氧化法去除BPA的反應途徑相一致；產(chǎn)物A通過水合反應及脫氫反應生成對異丙烯基苯酚(產(chǎn)物C)，產(chǎn)物C進一步反應生成對羥基苯丙酮(產(chǎn)物D)，Li等[30]在利用過氧化物自由基去除BPA中也檢測到產(chǎn)物C和產(chǎn)物D的存在；此外，異丙基苯酚自由基能進攻BPA苯環(huán)上羥基的鄰位，生成4，4′-(4-羥基-1，3-苯基)雙(丙-2，2-二基)雙酚，此中間產(chǎn)物斷鍵分解成苯酚和2-(4-羥基苯基)，2-(2-羥基，5-叔丁基)丙烷(產(chǎn)物E)，這一由自由基引發(fā)的反應過程已被報道[31-33]．Lin等[34]對于BPA的降解路徑分析中同樣出現(xiàn)該反應通路及關鍵產(chǎn)物E．綜上，生物膜體系降解BPA的途徑為?OH攻擊異丙基，致使異丙基斷裂并進一步發(fā)生后續(xù)反應．這與已報道的高級氧化法降解BPA的途徑類似，也進一步證明了假交替單胞菌GCY生物膜是通過產(chǎn)生胞外ROS以降解BPA．菌株GCY降解BPA途徑推測見圖7．

圖7 菌株GCY降解BPA途徑推測Fig.7 The proposed biodegradation pathway of BPA by strain GCY

3 結(jié) 語