徐東杰，王家鄉(xiāng)，李 鵬，謝 洋，皮勁松，吳 艷

（1.長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，武漢 430064）

非洲鴕鳥（Struthio camelus），屬鴕形目鴕鳥科鳥類，是目前現(xiàn)存鳥類中體型最大的、惟一的二趾鳥類，原生活于阿拉伯沙漠和非洲稀樹林地帶、沙漠草地［1，2］。鴕鳥全身都是寶，鴕鳥肉中蛋白質(zhì)、鈣、鐵和鋅的含量遠(yuǎn)比牛肉高［3］，具有特別高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值［4］。鴕鳥的皮美觀柔軟、舒服耐用、透氣性能好，是目前世界上鴕鳥養(yǎng)殖的重要產(chǎn)品［5］。鴕鳥皮加工后也可用于中高檔服飾產(chǎn)業(yè)［6］。鴕鳥蛋用途多，不僅能夠食用［7］，還能夠做成裝飾品［8］。

大腸桿菌為兩端鈍圓的革蘭氏陰性短桿菌，大多數(shù)大腸桿菌有鞭毛，可以運(yùn)動，無莢膜、無芽孢。大腸桿菌是引起禽類患病最常見的病原菌［9］。根據(jù)致病特點(diǎn)可將致腸道疾病的大腸桿菌分為6類：腸產(chǎn)毒性大腸桿菌（ETEC）、腸侵襲性大腸桿菌（EIEC）、腸致病性大腸桿菌（EPEC）、腸出血性大腸桿菌（EHEC）、腸黏附性大腸桿菌（EAEC）和彌散黏附性大腸桿菌（DAEC）［10］。從流行病學(xué)上來說，大腸桿菌具有流行范圍廣、傳播速度快等特點(diǎn)，可引起禽類全身各種疾病。該細(xì)菌既能水平傳播也能垂直傳播，水平傳播可通過消化道、呼吸道、交配等途徑，垂直傳播則是通過種蛋污染［11］。從臨床診斷學(xué)來看，致病性大腸桿菌主要臨床表現(xiàn)為全身性的急性敗血癥、氣囊病、卵黃性腹膜炎、輸卵管炎、腸炎等多種癥狀。單獨(dú)感染致病性大腸桿菌時(shí)根據(jù)致病菌的毒力大小、禽本身健康狀態(tài)，發(fā)病率、死亡率都有所差別，毒力強(qiáng)則發(fā)病率、死亡率高［12］。從病理學(xué)上來說，通常感染大腸桿菌病后實(shí)質(zhì)器官會有出血點(diǎn)并變腫，肝臟顏色轉(zhuǎn)為土黃色或綠色，同時(shí)伴有腹膜炎、腸炎等各種炎癥。大腸桿菌可與其他病原菌混合感染而加重病情，致使禽大腸桿菌病不能得到有效防控，給禽養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［13］。

本研究通過微生物鑒定方法從鴕鳥糞便中分離出大腸桿菌菌株并進(jìn)行鏡檢，將分離9株大腸桿菌與其他文獻(xiàn)中致病性大腸桿菌的生化特性對比，利用生化特性鑒定大腸桿菌，對大腸桿菌病原學(xué)分類研究具有一定參考價(jià)值，為下一步研討大腸桿菌生物學(xué)特性奠定好前期基礎(chǔ)，為尋找致病性大腸桿菌做準(zhǔn)備，為大腸桿菌疾病的診斷、醫(yī)治提供理論依據(jù)，以減少養(yǎng)禽業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)樣本采集長江大學(xué)鴕鳥研究所中9羽（5只雌性、4只雄性）日齡、體況相近的非洲鴕鳥的糞便作為研究對象。

1.1.2 試劑與儀器恒溫振蕩培養(yǎng)箱、酒精燈，常州億通分析儀器制造有限公司；光學(xué)顯微鏡BH-2，日本奧林巴斯公司；移液槍、培養(yǎng)皿、接種環(huán)、載玻片，江蘇順和教學(xué)儀器有限公司；低溫冰箱，海爾集團(tuán)；電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；手提式壓力滅菌鍋，上海東亞壓力容器制造有限公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海博尋實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；瓊脂、葡萄糖、蔗糖、乳糖、棉子糖、鼠李糖、阿拉伯糖、麥芽糖、甘露醇、明膠、山梨醇、尿素、吲哚、枸櫞酸鹽、硫化氫、VP、MR，AR級，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 主要溶液和培養(yǎng)基

1）麥康凱瓊脂配制。將17 g蛋白胨、3 g?胨、5 g膽鹽和5 g氯化鈉溶解于400 mL去離子水中，pH 7.2。將17 g瓊脂加入600 mL去離子水中，使其加熱并熔解。將2種液體混合，分裝瓶內(nèi)，并121℃高壓滅菌15 min，冷卻后備用。當(dāng)需要使用時(shí)，需先加熱熔化瓊脂，加入10 g乳糖，冷卻至50℃左右時(shí)，加入10 mL結(jié)晶紫水溶液和0.5%中性紅水溶液5 mL，搖勻后傾注平板。

2）糖發(fā)酵管配制。用電子天平稱取5 g牛肉膏、10 g蛋白胨、2g磷酸氫二鈉、3 g氯化鈉，將稱取物與12 mL 0.2%滇麝香草酚藍(lán)溶液置于1 000 mL的錐形瓶，定容，pH 7.4，按0.5%加入葡萄糖，分裝至小試管內(nèi)，121℃高壓滅菌15 min。其他糖類發(fā)酵管均可按上述成分配好后分裝每瓶100 mL，121℃高壓滅菌15 min。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集利用滅菌后的牙簽和平皿收集新鮮糞便，取9只鴕鳥的糞便后分別用標(biāo)簽標(biāo)記1～9。稱重：稱取1 g糞便；分裝：浸入裝有無菌水的試管；稀釋：將試管底部利用振蕩機(jī)振蕩5 min；沉淀：將試管分別插入試管架，靜置5 min；備用：用吸管取上清液分裝到無菌試管。

1.2.2 細(xì)菌的分離培養(yǎng)在超凈工作臺上，將疑似有大腸桿菌的菌液劃線接種于麥康凱培養(yǎng)基上，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)24 h，挑取紅色或粉紅色的菌落繼續(xù)在麥康凱培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)，重復(fù)3～5次，得到純培養(yǎng)后的大腸桿菌菌落，并觀察其生長形態(tài)。

1.2.3 糖酵解試驗(yàn)制作葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、鼠李糖、棉子糖等鑒定大腸桿菌所需的生化鑒定管，用接種針在酒精燈上灼燒后挑取純化后的單個(gè)菌落接種，接種后用塞子封住管口，并放入恒溫培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24 h，觀察并記錄每根生化鑒定管發(fā)酵結(jié)果。

1.2.4 吲哚試驗(yàn)挑取麥康凱培養(yǎng)基上生長的單個(gè)菌落培養(yǎng)在鄧亨氏蛋白胨水溶液中，置于恒溫箱中37℃培養(yǎng)24～48 h，培養(yǎng)完成后于培養(yǎng)液中加入2～3 mL二甲苯溶液，搖勻后靜置3 min，加入2 mL Ehrlich試劑，5 min后觀察溶液顏色。

1.2.5 VP試驗(yàn)將被檢菌接種于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，置于恒溫箱中37℃培養(yǎng)48～72 h、培養(yǎng)液2.5 mL先加入5℃α萘酚（2-na-phthol）純乙醇溶液0.6 mL，再加40%氫氧化鉀水溶液0.2 mL，搖動2～5 min，室溫靜置或36℃恒溫箱10 min后觀察溶液顏色。

1.2.6 MR試驗(yàn)將被檢菌接種于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，置于恒溫箱中37℃培養(yǎng)48 h，取出后加入甲基紅試劑2～5滴，觀察溶液顏色變化情況。

1.2.7 枸櫞酸鹽試驗(yàn)將被檢菌接種并劃線于枸櫞酸鈉瓊脂斜面，置于恒溫箱中37℃培養(yǎng)48 h，觀察菌生長情況或培養(yǎng)基顏色。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與純化

從表1可以看出，2、4、7、9號稀糞分離出菌株比3、5、6、8號干糞分離出的菌株生長顏色更鮮艷、菌落直徑更大，且1號菌株與其他稀糞分離出的菌株顏色不同呈灰白色。2～9號菌株大腸桿菌在麥康凱培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，純培養(yǎng)3次后生長肉眼可見為圓形、濕潤、邊緣整齊、紅色的點(diǎn)狀菌落，從1號干糞分離出的菌株接種在麥康凱培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，菌落顏色為白色、透明、濕潤的圓形菌落，除顏色外形態(tài)特征均與典型大腸桿菌菌落相似，且3次純培養(yǎng)生長后依舊為白色菌落（圖1）。9株細(xì)菌革蘭氏染色后均為陰性，均為大小不一、兩端鈍圓的短小桿菌（圖2），9株菌株初步鑒定為大腸桿菌［14］。

表1 樣品菌在麥康凱培養(yǎng)基前3次純培養(yǎng)生長情況

圖1 細(xì)菌在麥康凱培養(yǎng)基上的生長情況

圖2 革蘭染色鏡檢結(jié)果（1 000×）

2.2 生化鑒定

從表2可以看出，9株分離菌株均能發(fā)酵葡萄糖、甘露醇、阿拉伯糖、山梨醇、麥芽糖、鼠李糖，6株菌株能分解蔗糖、棉子糖，所有菌株均不能利用枸櫞酸鹽，所有菌株VP試驗(yàn)均為陰性，所有菌株MR試驗(yàn)和吲哚試驗(yàn)均為陽性。從表3可以看出，1號稀糞的菌株不能發(fā)酵乳糖，2、4、7、9號稀糞分離出的菌株發(fā)酵乳糖速度遲緩，3、5、6、8號干糞分離的菌發(fā)酵乳糖速度迅速［15，16］。大腸桿菌分解乳糖主要依賴于β-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶透性酶。當(dāng)兩種酶同時(shí)存在，大腸桿菌才能分解乳糖，而出現(xiàn)遲發(fā)酵或不發(fā)酵乳糖的情況則可能是缺乏其中任何一種酶［17］，9株被檢菌株均為大腸桿菌［18，19］。

表2 大腸桿菌生化鑒定結(jié)果

表3 大腸桿菌乳糖發(fā)酵情況

3 小結(jié)與討論

鴕鳥作為目前世界上最大的走禽，其生長迅速、繁殖力強(qiáng)、抗病性強(qiáng)，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前，中國已有很多人工飼養(yǎng)的鴕鳥養(yǎng)殖場，但對鴕鳥的疾病與防治相關(guān)的研究并不全面。

大腸桿菌是引起禽類疾病的最常見的病原菌。作為腸道內(nèi)常在菌，致病性大腸桿菌會對寄主造成損害，對寄主的存活、生長及發(fā)育產(chǎn)生重大影響。大腸桿菌為兩端鈍圓的革蘭氏陰性短桿菌，有鞭毛，可運(yùn)動，無莢膜、無芽孢。大腸桿菌能夠分解蔗糖、麥芽糖、鼠李糖、葡萄糖等碳水化合物。大腸桿菌菌株能快速發(fā)酵乳糖，但也有少數(shù)菌株不發(fā)酵或延遲發(fā)酵乳糖［17］。

本試驗(yàn)以非洲鴕鳥糞便為研究對象，對分離、鑒定出的大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，并與其他禽類大腸桿菌的形態(tài)特征對比。通過革蘭氏染色以及顯微鏡下的形態(tài)學(xué)觀察，為兩端鈍圓的革蘭氏陰性桿菌，初步確定為大腸桿菌，而后通過生化鑒定，確定了所分離的菌株為大腸桿菌。本試驗(yàn)中從1號稀糞中分離的菌株對乳糖不發(fā)酵，因此在鑒定大腸桿菌時(shí)要考慮到不發(fā)酵或發(fā)酵遲緩的菌株存在的可能性，避免因考慮生化特性不全面而引起實(shí)驗(yàn)室診斷的誤診［20］，這種菌仍可能存在致病能力，應(yīng)重視遲發(fā)酵或不發(fā)酵乳糖型大腸桿菌的研究。