伍 穎 王詩媛 胡彩姣 朱 筱 郭 萌 呂建祎 劉 欣李長龍 霍學云 陳振文 杜小燕**

（1）首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，北京 100069；2）首都醫(yī)科大學北京宣武醫(yī)院，北京 100053）

長爪沙鼠（Meriones unguiculatus），被廣泛地應用于腦神經、寄生蟲病、微生物、生殖、內分泌、營養(yǎng)、代謝、腫瘤、癲癇、聽覺和焦慮等諸多研究領域，被稱為“多功能”實驗動物。

溶酶體半胱氨酸蛋白酶內源性抑制劑Cystatin C（CysC 或CST3）屬于半胱氨酸蛋白酶抑制劑2型胱抑素超家族［1］，由位于第20 號染色體短臂（20pl1.21）的CST3基因編碼，在多種組織中表達［2］。CysC 具有調節(jié)細胞增殖［3-4］、分化［5］、遷移［6］、神經保護［7］等多種生理功能。研究顯示，CysC 的表達水平在阿爾茨海默病、肌萎縮側索硬化［8］、帕金森?。≒D）［9］等神經退行性疾病和腦缺血［7］中發(fā)生不同程度的改變，例如CysC通過減少淀粉樣蛋白β原纖維的沉積在阿爾茨海默病中表現(xiàn)出神經保護作用［10］。然而，CysC對神經行為的影響作用很大程度上仍然未知。

CysC 在大腦的平滑肌細胞、星形膠質細胞、小膠質細胞和血管內皮細胞中均有表達［11］。越來越多的證據(jù)表明，CysC 通過減少神經元細胞損傷發(fā)揮腦保護功能。CysC 可作為組織蛋白酶抑制劑減少腦缺血后的海馬神經元損傷［12］，還可以通過內體途徑預防唐氏綜合癥小鼠模型的神經元丟失和行為缺陷［13］。研究發(fā)現(xiàn)，調節(jié)血管性癡呆大鼠損傷區(qū)血管形成［14］或減輕腦內皮細胞的氧化損傷和炎癥水平［15］等保護血管細胞免受損傷也是改善神經行為的重要途徑。最近的報道提示，CysC 外泌體對饑餓誘導下的CysC 敲除（CysC-KO）皮質平滑肌細胞和皮質神經元有保護作用［16］。此外，CysC還與PD小鼠和細胞模型中的血管生成以及通過血管內皮生長因子（VEGF）誘導血管生成從而提高神經-血管單元中的神經元自噬有關［17］。本課題組此前也發(fā)現(xiàn)CysC可能通過VEGFA參與血管生成過程［18］。但在缺氧、炎癥等病理條件下CysC對內皮細胞和神經元的作用尚不清楚，推測CysC 的神經保護作用可能是通過提高內皮細胞和神經元細胞的活力來實現(xiàn)。

長爪沙鼠作為實驗動物廣泛應用于多個研究領域［19］，是公認的腦缺血理想模型動物之一［20］。在認知行為研究中，Varty等［21］發(fā)現(xiàn)長爪沙鼠可用于測試具有潛在作用的抗焦慮藥和抗抑郁藥。另有研究表明，長爪沙鼠是利用強迫游泳試驗（FST）評估抗抑郁化合物的理想動物［22］。通過7 種行為學測試長爪沙鼠基本行為特征的結果也證明，該動物可作為焦慮和恐懼領域的大腦行為研究工具［19］。本課題組前期利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術成功建立了CysC 敲除（CysC-KO）長爪沙鼠，并發(fā)現(xiàn)CysC 缺失加劇了腦缺血模型長爪沙鼠缺血后腦損傷，提示CysC 可能參與腦缺血后血管和神經細胞的修復［23］。本研究通過評估CysC-KO 長爪沙鼠的神經行為建立抑郁模型以及觀察CysC 在模擬病理條件下對HUVEC和N2a細胞活力的影響，以及闡明CysC在神經行為異常發(fā)生中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本研究共使用29 只清潔級長爪沙鼠，分別為15只野生型（8只雄性，7只雌性）和8只CysC-KO純合子（5 只雄性，3 只雌性）進行行為學測試；野生型和CysC-KO 純合子各3 只（3 月齡，雄性2只，雌性1 只）進行qPCR 檢測。動物飼養(yǎng)于干凈的半透明塑料籠中，每籠不超過5 只，溫度為（25±1）℃，濕度為55%～65%。環(huán)境安靜，動物自由采食。動物實驗經首都醫(yī)科大學科學與倫理委員會批準（許可編號AEEI-2017-032）。

1.2 qPCR

采用Trizol法（Invitrogen，USA）提取組織總RNA，天根KR106-01 FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒（北京天根）進行逆轉錄，使用FastQuant RT 試劑盒（北京天根） 根據(jù)試劑盒說明進行qPCR。根據(jù)自行克隆的長爪沙鼠的CysC序列，采用Primer Premier 5.0 設計PCR 引物。正向引物序列：5'-CACGTGTACCAAGACCCAGC-3'，反向引物 序 列： 5'-TTTCGACAAGGTCATTGTGCC-3'。qPCR 由Bio-rad CFX96 系統(tǒng)按照前期運行程序進行［24］。

1.3 曠場實驗（open field test，OPT）

50 cm×50 cm×30 cm（長×寬×高）的方向箱體為曠場。在曠場中央劃分一個邊長16 cm的正方形作為中央?yún)^(qū)，其余為邊緣區(qū)。動物放置于中央?yún)^(qū)域后，觀察記錄5 min。通過計算機視頻跟蹤系統(tǒng)（Ethovision XT）記錄動物的運動速度、中央?yún)^(qū)運動時間、邊緣區(qū)運動時間、進入中央?yún)^(qū)次數(shù)。

1.4 糖水偏好測試（sugar preference test，SPT）

糖水偏好測試（SPT）按照前期描述進行［19］。簡言之，將動物單獨飼養(yǎng)，并在測試前訓練24 h。在剝奪水和食物15 h后，每個單獨的籠子同時提供稱重的蔗糖溶液（1%）和水各1 瓶。測試持續(xù)10 h，5 h 后交換瓶子位置。蔗糖偏好度定義為：糖水偏愛=糖水消耗/總液體消耗×100%［19］。

1.5 社交交互（social interaction，SI）

社交交互（也稱為三箱社交）用于評估動物的自閉行為、社交能力和溝通能力。本文應用的箱體大小和實驗條件與前期研究完全相同，該條件已被證實適用于長爪沙鼠行為評估［19］。

1.6 明暗箱（dark/light box）

明暗箱是通過測試動物的暗特性（趨于黑箱）和探索特征（趨于白箱）來研究自發(fā)探索行為。在明暗箱（45 cm×27 cm×27 cm）中，暗箱占2/3，明箱占1/3。盒子被燈光覆蓋和照亮。兩個盒子之間的隔板有一個7.5 cm×7.5 cm 的門供動物通過。將動物置于白箱上方，并在設備上方安裝攝像系統(tǒng)，記錄5 min 內動物通過明/暗箱的次數(shù)和在明/暗箱內停留的時間。

1.7 新物體識別（novel object recognition，NOR）

新物體識別根據(jù)嚙齒動物的易感性評估其記憶能力。粉色球作為熟悉物體（FO），白色高爾夫球被作為新物體（NO）。實驗在22 cm×22 cm×25 cm丙烯酸箱中進行。第一天為適應階段，沙鼠在箱體中自由探索10 min。第二天為獲得性階段，沙鼠在5 min內自由探索兩個相同的FO。1～24 h后為測試階段，其中一個FO 被NO 取代，動物自由探索這兩個物體5 min，并進行錄像。記錄和分析FO 或NO 的探索時間。偏好指數(shù)（PI）根據(jù)以下公式計算：PI=NO/(NO+FO)×100%。

1.8 細胞培養(yǎng)

人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）用RPMI-1640（Vistech，VM-2101BM）培養(yǎng)基、人動脈平滑肌細胞（HASMC）和小鼠神經母細胞瘤細胞（N2a）用DMEM（Vistech，VM-1101BM）培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基中含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素鏈霉素。所有細胞均培養(yǎng)于37℃，5%CO2加濕培養(yǎng)箱中。

1.9 缺氧&饑餓（H&S） 和氧葡萄糖剝奪（OGD）處理

將對數(shù)期的HUVEC或N2a細胞定量到1×107/L，隨后輕輕吹打混勻，取200 μl 加入96 孔板（細胞濃度2000/孔）。細胞在培養(yǎng)箱中生長貼壁4 h 后，分別用含有CysC（Solarbio，P00229）或CysC 抑制劑（Abgent，P01034）（200 μg/L） 或等體積PBS 的完全培養(yǎng)基處理細胞，然后將96 孔板置于混合氣體（85%N2/10%CO2/5%O2）的低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。對于N2a，接種貼壁培養(yǎng)4 h 后，用含CysC 或CysC 抑制劑（50 μg/L）或等體積PBS的無血清（用于H&S）或無葡萄糖（用于OGD）培養(yǎng)基替換正常培養(yǎng)基24 h，然后將板放入缺氧培養(yǎng)箱中2 h，MTT法檢測細胞活力。

1.10 炎癥刺激

將HUVEC和N2a細胞接種于96孔板（細胞濃度2000/孔），置于培養(yǎng)箱生長貼壁4 h。然后將培養(yǎng)基改為含有TNF-α或LPS（100 mg/L）的完全培養(yǎng)基。同時，分別加入濃度為200 μg/L 的CysC 或CysC 抑制劑，以PBS 作為對照。培養(yǎng)24 h 后，MTT法檢測細胞活力。

1.11 MTT法

用于測定細胞活力。HUVEC 或N2a 細胞在處理結束時，向每個孔中添加MTT 培養(yǎng)基溶液，反應4 h 后，除去液體并用DMSO 溶解細胞20 min，使用Multiskan MK3 微孔板讀數(shù)器（Thermo Fisher Scientific，USA） 在490 nm 處測量吸光度（A）值。將HASMC（4×106個/L）接種在96孔板中，然后用梯度濃度（100 μg/L、200 μg/L、400 μg/L、800 μg/L）的CysC及其抑制劑處理12 h。在處理結束時，按照上述步驟測量A值。

1.12 統(tǒng)計

所有統(tǒng)計分析均使用SPSS Statistic 16.0 進行。通過參數(shù)獨立樣本t檢驗和單因素方差分析分析數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)顯示為平均值±SEM，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CysC缺失對沙鼠行為的影響

本研究首先使用qPCR檢測CysC-KO長爪沙鼠不同組織中CysC 的表達水平。qPCR 檢測結果顯示，CysC-/-長爪沙鼠腦、肝、胃、腎和胰腺等器官組織中CysC mRNA 水平顯著低于野生型（圖1），提示CRISPR/Cas9 方法成功構建CysC-/-長爪沙鼠。

為了探究敲除CysC對長爪沙鼠行為學的影響，在CysC-KO野生型（WT）和純合子（CysC-/-）長爪沙鼠青年（3～5月齡）、中年（10～12月齡）和老年（30～32月齡）階段分別進行了一系列測試。首先用曠場實驗檢測動物的運動、探索行為，研究發(fā)現(xiàn)老年CysC-/-長爪沙鼠在曠場中央?yún)^(qū)活動時間和進入中央?yún)^(qū)的頻率顯著低于WT（圖2a，b），說明CysC 敲除長爪沙鼠在老年期間表現(xiàn)出探索欲望降低和抑郁樣行為。接著用蔗糖偏好測試評估了實驗動物的抑郁樣行為，結果顯示，各年齡段CysC-/-組的蔗糖偏好（%）均低于對照組（WT），尤其中年階段差異顯著（圖2c）。此外，還利用新物體識別實驗檢測了長爪沙鼠的學習、探索和記憶能力，得到與糖水偏好實驗相同的趨勢，即CysC-/-組長爪沙鼠對新物體的偏好度有所降低（圖2d）。這些結果表明，CysC-KO 可誘導長爪沙鼠出現(xiàn)抑郁樣行為，提示CysC參與神經行為異常的發(fā)生。

社交行為障礙出現(xiàn)在許多精神退行性疾病中，例如抑郁癥、自閉癥和精神分裂癥。使用三箱社交評估青年、中年和老年WT和CysC-/-長爪沙鼠的社交行為。在社會新奇實驗中：相對于WT，青年時期的CysC-/-長爪沙鼠在陌生鼠箱停留時間和與陌生鼠接觸的時間均顯著降低；而中年時期的CysC-/-長爪沙鼠在進入陌生鼠箱中的次數(shù)和進入陌生鼠箱中停留的時間顯著低于WT；老年時期，CysC-/-長爪沙鼠進入陌生鼠箱中的次數(shù)仍顯著低于WT（圖2e～g）。還進行了明暗箱實驗的測試，數(shù)據(jù)表明不同年齡階段的WT和CysC-/-長爪沙鼠在明暗箱中的各項指標沒有顯著差異（附件圖S1）。

2.2 H&S或炎癥條件下CysC對HUVEC的保護作用

Fig.1 CysC mRNA expression level is decreased in different tissues of gerbilsComperred with the wild type (Control), the mRNA level in CysC knockout homozygous (CysC-/-) gerbils’ brain (a), spleen (b), testis (c) and pancreas (d) were dramatically downregulated when quantified by qPCR. Those results demostrated that CysC was successfully knocked out in different tissues of CysC-/-gerbils.Statistical analysis was performed by t-test,n=3,*P<0.05.

Fig.2 CysC knockout induces depression-like behavior in gerbils at different agesBehavioral tests were performed in wild-type(WT,n=15)and homozygous(CysC-/-,n=8)gerbils aged 3-5 months(young),10-12 months(middle)and 30-32 months(old),respectively.In the open field test(OFT),the frequency(a)and time(b)of WT&CysC-/-gerbil entering into the central area were detected.The frequency and time of CysC-/- gerbil entering into the central area were significantly lower than WT in old gerbil. In the sucrose preference test (SPT), the sucrose preference of middle CysC-/- gerbils was significantly lower than that of WT (c). In the novel object recognition test,the preference index(PI%)to new object of young CysC-/-gerbils was significantly lower than WT(d).In the social novelty preference test,the frequency into strange animal chamber(e),the time spent on strange animal chamber(f),and the time with strange animal(g)of CysC-/-gerbils were significantly lower than that of WT in different periods.Statistical analysis was performed by t-test,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.

為了探索CysC-KO 神經行為異常的原因，檢測了CysC對血管細胞和神經細胞的影響。用CysC或其抑制劑處理HUVEC 后MTT 檢測的結果表明，外源CysC 可有效促進HUVEC 增殖（圖3a），而CysC抑制劑顯著抑制HUVEC增殖（圖3b）。基于這一結果，本文探討了CysC 在病理條件下（H&S或炎癥刺激）對HUVEC細胞活性的影響。在H&S或TNF-α 條件下用外源CysC 或其抑制劑處理HUVEC 后發(fā)現(xiàn)，H&S 或TNF-α 顯著抑制HUVEC活力，而外源CysC 可以解除該抑制作用（圖3c，d）。上述結果表明，CysC可顯著降低由H&S或炎癥處理引起的內皮細胞損傷。

Fig.3 Protective effect of CysC to HUVECCysC (200 μg/L) (a) improved, or CysC inhibitor (200 μg/L) (b) decreased proliferation of HUVEC. HUVEC was treated by H&S condition (c) or TNF-α (100 mg/L) for 24 h (d), and CysC showed protective effect whereas CysC inhibitor displayed converse effect. Cell activity of HUVEC was measured by MTT assay.A490 are means±SD,with statistical analysis by t-test or one way ANOVA.*P<0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

2.3 CysC提高氧糖剝奪或炎癥條件下神經元細胞的細胞活力

Fig.4 Protective effect of CysC to N2aN2a cells were treated with PBS,CysC(50μg/L)and CysC inhibitor(50μg/L)respectively for 36 h under OGD(a)or H&S(b)2 h treatment,or 6 hstimulating with LPS (100 mg/L) (c). CysC harbored significant protection on N2a cell viability tested by MTT assay. A490 are means±SD, with statistical analysis by one way ANOVA.*P<0.05,**P＜0.01.

缺氧、營養(yǎng)缺乏和炎癥是多種行為異常疾病中神經元細胞的常見病理狀態(tài)。因此，本文研究了在H&S、OGD或LPS誘導下CysC對N2a細胞活力的影響。結果表明在H&S 環(huán)境下，N2a 的增殖顯著減少，而CysC可逆轉由H&S引起的增殖抑制，但CysC 抑制劑無效（圖4a）。在OGD 條件下也觀察到類似結果（圖4b）。由圖4c可知，正常培養(yǎng)條件下CysC 可顯著增加N2a 細胞的增殖能力，在LPS模擬的炎癥環(huán)境下，CysC 可以恢復LPS 對N2a 的生長抑制；相反，CysC 抑制劑則會加重損傷（圖4c）。因此，可以認為CysC在病理狀態(tài)下對N2a細胞具有保護作用。

2.4 CysC不影響HASMCs的增殖

平滑肌細胞是血管的另一種重要組成。為了探索CysC 的腦保護作用是否與平滑肌細胞相關，用不同濃度梯度的CysC 及其抑制劑處理HASMC。結果表明，CysC（圖5a）或CysC 抑制劑（圖5b）對HASMC的生長沒有劑量依賴性影響。因此，推測CysC 對腦組織的保護功能主要靶向神經元和血管內皮細胞。

Fig.5 CysC has no effect on smooth muscle cellsAfter treating with 100 μg/L, 200 μg/L, 400 μg/L and 800 μg/L of CysC (a) for 24 h or CysC inhibitor (b) for 24 h, the proliferation level of HASMCs was detected by MTT assay. The result showed that there was no statistical difference between all dosage groups of CysC or CysC inhibitor.A490 are means±SD,with statistical analysis by one way ANOVA.

3 討論

抑郁癥是一種全球范圍內常見的神經障礙疾病。WHO 的統(tǒng)計顯示，截至2021 年5 月全球約有2.8 億人罹患抑郁癥，已成為全世界主要的致殘、致死疾病之一［25］。多項研究表明，CysC的表達與抑郁癥有關。在中國，血清CysC 水平與老年抑郁癥風險增加有關［26］。荷蘭一項關于抑郁癥和焦慮癥的研究顯示，血清CysC 水平與男性重度抑郁癥有關［27］。Minev等［28］研究比較了腎病患者治療后腎功能與抑郁癥之間的關系，發(fā)現(xiàn)血清中具有高水平CysC 的患者在腎病治療后患抑郁癥的可能性增加。然而，到目前為止還沒有用動物模型證實CysC與抑郁癥有關的報道。

抑郁癥動物模型主要通過應激、手術、藥物誘發(fā)、遺傳修飾等方法制備［29］；用于制備模型的動物包括大鼠、小鼠、非人靈長類動物等［30］。本團隊在前期研究中通過7種行為學測試描述了長爪沙鼠基本行為特征，證明該動物可以作為焦慮和恐懼領域的大腦行為研究工具［19］，是神經行為學研究的理想實驗動物［19］。近期有研究表明，通過剝奪與褪黑素抑制相關的藍光后，長爪沙鼠腦組織和血清中5-羥色胺水平顯著降低，并且表現(xiàn)出抑郁樣行為［31］，提示長爪沙鼠可能對誘導抑郁因素敏感。本研究評估了前期成功建立的CysC 敲除長爪沙鼠的神經行為變化，發(fā)現(xiàn)CysC 缺乏導致長爪沙鼠不同月齡階段出現(xiàn)抑郁樣行為，包括蔗糖偏好顯著降低、社會行為減少等。本研究首次描述了CysC 缺乏會明顯影響動物的社交行為和焦慮行為，用長爪沙鼠CysC敲除動物模型證明CysC與抑郁癥之間的關系，同時也提示CysC 可能是抑郁癥研究的一個有價值的靶標。

為了探索CysC-KO 神經行為異常的原因，檢測了CysC 對血管細胞和神經細胞的影響?；趧游锖团R床兩個層次的研究表明，神經元丟失是抑郁癥病理變化中的重要特征，抑郁癥發(fā)生與大腦中海馬與前額葉皮質中神經元的萎縮和神經細胞缺失相關［32］。CysC 在神經系統(tǒng)疾病中具有廣泛的功能。CysC 可通過激活AMPK-mTOR 通路從而誘導神經元保護性的自噬流增加［33］；Dutta 等［34］的研究結果表明，CysC 耗竭顯著降低受損大鼠多巴胺神經元培養(yǎng)液對小膠質細胞的極化作用和神經毒性。本研究發(fā)現(xiàn)，CysC 顯著增加缺氧和缺乏營養(yǎng)供應的病理環(huán)境以及LPS模擬的炎癥刺激下N2a細胞的活力，這可能直接證明CysC 是病理環(huán)境中促進神經元生長和保護神經細胞的重要因子。

多個研究表明，包括冠心病、卒中、血管性癡呆在內的腦微血管疾病與抑郁癥的高發(fā)顯著相關［35］，而越來越多的研究發(fā)現(xiàn)CysC與血管疾病有關，動脈粥樣硬化患者中CysC 可以通過減少自噬來減少細胞死亡［36］，血清CysC水平可能在兔球囊損傷腹主動脈的血管重塑中起重要作用［37］。因此，推測CysC 也可能通過血管細胞在抑郁癥中發(fā)揮作用。本研究的結果顯示，CysC 可以增加HUVEC的增殖能力，并抵抗由TNF-α、缺氧和饑餓引起的增殖抑制，但對HASMCs 沒有影響。這些結果證實CysC 的神經保護作用可能通過靶向血管內皮細胞來實現(xiàn)。

本研究仍存在一些局限性。首先，嘗試用免疫熒光或免疫組化方法在CysC-KO 大腦中明確CysC-KO 長爪沙鼠的大腦哪些區(qū)域與相應抑郁表型密切相關。由于缺乏針對長爪沙鼠CysC 的商品化抗體，本課題組自行開發(fā)了CysC 長爪沙鼠抗體并在免疫印跡（Western blot）中獲得滿意結果［23］，但很遺憾該抗體在CysC-/-和CysC+/+動物中均呈陰性（數(shù)據(jù)未顯示），下一步將設計寡核苷酸探針，利用FISH 技術實現(xiàn)這一目的。其次，本研究僅證實CysC 對內皮細胞和神經元細胞的保護作用，CysC-KO 對大腦的何種損傷會導致行為改變及其潛在的分子機制尚不清楚。此外，內皮細胞和神經細胞是否可以通過旁分泌CysC 或某些介質如外泌體［38］間接相互作用也需進一步闡明。這些問題將在以后的研究中進一步探索。

4 結論

綜上所述，本研究表明長爪沙鼠中CysC-KO可引起抑郁樣行為，可作為抑郁癥研究的動物模型。并且結果表明，CysC 對腦組織的保護功能主要靶向神經元細胞和血管內皮細胞，而對血管平滑肌細胞無明顯影響。

附件PIBB_20220115_Doc_S1.pdf 見本文網絡版（http://www.pibb.ac.cn或http://www.cnki.net）。