周新歡 鄒 科 楊弋弋 李中欽 任紅娟 馮 磊

WHO 2014年推薦的女性生殖器官腫瘤分類將鱗狀上皮內病變(squamous intraepithelial lesion, SIL)分為低級別鱗狀上皮內病變(low-grade squamous intraepithelial lesion, LSIL)、高級別鱗狀上皮內病變(high-grade squamous intraepithelial lesion, HSIL)2種，前者包括CIN Ⅰ級，后者則包括CIN Ⅱ級、CIN Ⅲ級，即宮頸癌前病變[1]。提高HSIL篩查率，積極防治HSIL是降低宮頸癌病死率的關鍵。但CIN分級需多點活檢，作為SIL的常規(guī)檢查方式存在局限性，可重復性差。當前研究[2-3]致力于尋找與SIL病理分級有關生物標志物，以期通過生物標志物輔助SIL分級，但在生物標志物的選擇上尚未達成共識。人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus, HPV)是宮頸癌致病因素之一，Zappacosta等[4]證實，HPV E6/E7mRNA陽性標本中CINⅡ級患者占89.2%，而在宮頸鱗癌(squamous cell carci-noma, SCC)中HPV E6/E7mRNA陽性率可達100%。自噬相關蛋白-12(autophagy-related protein 12, ATG-12)是ATG-12基因編碼的蛋白，與自噬相關蛋白-5(autophagy-related protein 5, ATG-5)形成復合物參與自噬過程。有研究[5]證實，ATG12參與乳腺癌HER-2靶向治療耐藥的發(fā)生。酪氨酸激酶受體1(tyrosine kinase receptors-1,Tie-1)是絡氨酸激酶受體類型之一，主要參與調節(jié)血管生成、穩(wěn)定微血管、血管重塑及衰退等過程，在多種實體腫瘤中均存在高表達現(xiàn)象[6]?，F(xiàn)階段ATG-12、Tie-1與SIL病理分級的關系尚未完全闡明，其在HSIL臨床篩查上的價值有待探究。鑒于此，本研究在分析宮頸組織HPV E6/E7mRNA表達情況與SIL病理分級的關系基礎上，探究ATG12、Tie-1與SIL病理分級的關系，以期為HSIL的臨床篩查提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2017年1月至2020年12月在南陽市中心醫(yī)院行保存宮頸活檢組織或手術切除宮頸組織228例的患者資料。納入標準：①既往未接受過宮頸病變相關治療者；②高危型HPV陽性者；③臨床資料、病理切片、組織蠟塊齊全。排除標準：①宮頸組織采集前接受過局部抗病毒治療者；②合并宮頸癌以外的惡性腫瘤者；③合并HPV以外的急慢性病毒或細菌感染者；④合并嚴重肝腎功能衰竭、器質性病變者；⑤子宮頸表面有明顯外生性潰瘍性病灶者。最終入選228例，年齡18～70歲，平均(40.11±8.87)歲。參照2014年WHO女性下生殖道腫瘤分類標準[1]分為：慢性炎癥34例、LSIL 20例、HSIL 55例、宮頸鱗狀上皮癌(cervical sqamous cell carcinoma，CSCC)119例，分別納入慢性宮頸炎組、LSIL組、HSIL組、CSCC組。各組患者一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組患者一般資料比較

1.2 方法

1.2.1 宮頸組織HPV E6/E7 mRNA表達情況檢測 應用bDNA法檢測HPV 16型、HPV 18型、HPV 31型、HPV 33型、HPV 35型、HPV 39型、HPV 45型、HPV 51型、HPV 52型、HPV 56型、HPV 58型、HPV 59型、HPV 66型、HPV 68型等14種高危型HPV，參考試劑盒說明書依次裂解細胞、雜交捕獲mRNA、信號放大、底物發(fā)光反應，應用Quanti-VirusTM冷光儀檢測光子數(shù)，計算機自動轉換獲得HPV E6/E7 mRNA拷貝數(shù)，自動判定結果，拷貝數(shù)>0則提示HPV E6/E7 mRNA陽性。

1.2.2 ATG-12、Tie-1表達情況檢測 采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接(immunohistochemical streptravidin-biotin peroxidase, SP)法檢測宮頸組織ATG-12、Tie-1表達情況；取連續(xù)切片的宮頸組織蠟塊，二甲苯脫蠟、梯度乙醇水花、100℃抗原修復后，用3%過氧化氫中和過氧化酶，加anti-ATG-12抗體(1∶1 000稀釋)孵育3～4 h，以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)為陰性對照；滴加PV-6000二抗工作液孵育20～30 min，3,3’-二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色5～10 min，蘇木素染核1 min，鹽酸乙醇藍化，梯度酒精脫水后中性樹膠封片。Tie-1表達情況判斷參照ATG-12。SP染色結果由2位高年資病理科醫(yī)師采用雙盲法閱片，每張切片隨機取3個視野在高倍鏡下(×400)觀察。ATG-12存在于細胞漿及胞膜，均呈棕黃色顆粒，棕黃色染色則為陽性、不著色則為陰性[8]。

2 結果

2.1 宮頸組織中HPV E6/E7 mRNA表達水平比較 慢性宮頸炎組、LSIL組、HSIL組、CSCC組HPV E6/E7 mRNA陽性率比較差異有統(tǒng)計學意義(H=47.768，P<0.001)；HSIL組、CSCC組HPV E6/E7 mRNA陽性率高于慢性宮頸炎組(Hc=9.210、43.550，P<0.017)、LSIL組(Hc=3.664、32.455，P<0.017)，CSCC組HPV E6/E7 mRNA陽性率高于HSIL組(Hc=12.116，P<0.017)。見表2。

表2 各組宮頸組織中HPV E6/E7 mRNA表達水平比較[例(%)]

2.2 各組宮頸組織中ATG-12表達水平比較 慢性宮頸炎組、LSIL組、HSIL組、CSCC組ATG-12陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義(H=73.856，P<0.001)；HSIL組、CSCC組ATG-12陽性率低于慢性宮頸炎組(Hc=14.352、49.833，P均<0.017)，HSIL組、CSCC組ATG-12陽性率低于LSIL組(Hc=8.552、33.461，P<0.017)，CSCC組ATG-12陽性率低于HSIL組(Hc=13.225，P<0.017)。見表3。

表3 各組宮頸組織中ATG-12表達比較[例(%)]

2.3 宮頸組織中Tie-1表達水平比較 慢性宮頸炎組、LSIL組、HSIL組、CSCC組Tie-1陽性率比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=80.975，P<0.01)；HSIL組、CSCC組Tie-1陽性率低于慢性宮頸炎組(Hc=15.227、84.364，P均<0.017)，HSIL組、CSCC組Tie-1陽性率低于LSIL組(Hc=8.012、80.355，P<0.017)，CSCC組Tie-1陽性率低于HSIL組(Hc=24.363，P<0.017)。見表4。

表4 各組宮頸組織中Tie-1表達情況比較[例(%)]

2.4 宮頸組織中HPV E6/E7 mRNA、ATG-12、Tie-1表達對HSIL+的篩查價值 以HSIL+為狀態(tài)變量，分別以HPV E6/E7 mRNA、ATG-12、Tie-1、聯(lián)合篩查標準為檢驗變量繪制ROC曲線，結果顯示，單一HPV E6/E7 mRNA、ATG-12、Tie-1篩查HSIL+時，HPV-E6/E7mRNA的AUC值最小，篩查靈敏度為96.55%，特異度為35.49%；ATG-12陰性、Tie-1陰性篩查HSIL+的AUC值高于HPV E6/E7 mRNA陽性(Z=2.650、2.578，P=0.008、0.009)，但ATG-12陰性、Tie-1陰性篩查HSIL+的AUC值差異無統(tǒng)計學意義(Z=0.121、P=0.903)；聯(lián)合(HPV-E6/E7mRNA陽性基礎上，ATG-12陰性或Tie-1陰性)篩查HSIL+的AUC值上升至0.856，靈敏度、特異度分別為89.66%、81.48%，高于HPV E6/E7 mRNA陽性、ATG-12陰性、Tie-1陰性篩查的AUC值(Z=4.348、3.011、2.842，P均<0.001)。見表5、圖1。

表5 宮頸組織中HPV E6/E7 mRNA、ATG-12、Tie-1表達對HSIL+的篩查價值

圖1 宮頸組織中HPV E6/E7 mRNA、ATG-12、Tie-1表達篩查HSIL+的ROC曲線

3 討論

高危型HPV持續(xù)感染與宮頸癌的發(fā)生密切相關，70%的宮頸癌與HPV 16型、HPV 18型感染有關。通常情況下，一種或多種高危HPV持續(xù)感染、或慢性感染導致的宮頸癌早期病變并無特異性臨床表現(xiàn)[9]。研究[10]證實，高級別的CIN臨床標本中均可見E6、E7蛋白過表達，作為病毒癌基因蛋白，E6蛋白可結合并滅活腫瘤抑制因子P53，從而調控細胞生長周期；而E7蛋白不僅可調控細胞生長周期，導致細胞生命周期延長、細胞結構改變，還能結合并降解抑制蛋白pRb，引起DNA合成障礙、細胞代謝改變，破壞基因組穩(wěn)定性，最終導致細胞無限分裂而癌變。本研究顯示，慢性宮頸炎組、LSIL組中HPV E6/E7 mRNA陽性率分別高達61.76%、70.00%，且HSIL組、CSCC組HPV E6/E7 mRNA陽性率高于慢性宮頸炎組，HSIL組、CSCC組HPV E6/E7 mRNA陽性率高于LSIL組，CSCC組HPV E6/E7 mRNA陽性率高于HSIL組。這與李曉林等[11]的報道結論相符，均提示HPV E6/E7 mRNA陽性率可隨SIL病理分級增加而上升。另Bruno等[12]的研究顯示，93例HPV E6/E7 mRNA檢測陽性婦女經(jīng)為期3年的隨訪，22例確診為CIN Ⅱ+，而在HPV E6/E7 mRNA檢測陰性患者中，僅2例被檢出CIN Ⅱ+，由此認為HPV E6/E7 mRNA陽性的女性具更高的宮頸病變惡性進展風險，HPV E6/E7 mRNA陽性可作為宮頸病變篩查的可靠指標。本研究以HPV E6/E7 mRNA陽性篩查HSIL+的敏感度雖高達96.55%，高于Pruski等[13]報道86.1%，但HPV E6/E7 mRNA陽性篩查HSIL+的特異度不足50%，提示單一HPV E6/E7 mRNA陽性篩查HSIL+存在較高的假陽性風險。

自噬與腦缺血、惡性腫瘤疾病存在密切關聯(lián)，往期關于宮頸病變與自噬的關系研究多集中于自噬相關蛋白Beclin 1，認為自噬下調了CSCC進展，指出自噬與宮頸病變惡性進展存在密切關聯(lián)[14-15]。ATG-12也是自噬相關的分子標志物之一，杜曉薇等[16]的研究證實ATG-12參與腦缺血腦組織的自噬方式調節(jié)，Tan等[17]首次證實miR - 378可能通過靶向ATG-12促進宮頸癌的轉移而發(fā)揮致癌基因作用。本研究比較各組ATG-12表達情況，結果顯示HSIL組、CSCC組ATG-12陽性率低于慢性宮頸炎組，HSIL組、CSCC組ATG-12陽性率顯著低于LSIL組，CSCC組ATG-12陽性率顯著低于HSIL組。由此可見，宮頸組織ATG-12陽性表達率隨SIL病理分級增加而呈一定上升趨勢。這與譚冬梅[18]的報道結論相似，提示ATG-12表達缺失可能與宮頸病變分級有關。ROC曲線也證實，ATG-12陰性篩查HSIL+的AUC達0.780，具良好的篩查效能。Tie-1則是酪氨酸受體家族成員之一，既可表達于內皮細胞，也可表達于上皮來源的腫瘤細胞。秦君君等[19]報道，腫瘤直徑<2 cm、ⅠB2～ⅡA2期、合并淋巴結脈管間質浸潤的CSCC患者宮頸組織中Tie-1陽性表達率顯著更低，并具更短的3年累積生存時間及3年累積無瘤生存時間。本研究則顯示，Tie-1在慢性宮頸炎、LSIL、HSIL、CSCC患者中表現(xiàn)出與ATG-12相似的趨勢，HSIL組、CSCC組Tie-1陽性率顯著低于慢性宮頸炎組；HSIL組、CSCC組Tie-1陽性率低于LSIL組，CSCC組Tie-1陽性率低于HSIL組。ROC曲線分析也顯示Tie-1篩查HSIL+的AUC與ATG-12接近，篩查的敏感度、特異度分別為78.16%、83.33%，與ATG-12在篩查靈敏度上有一定欠缺，存在高漏診風險，影響篩查效能。

基于本研究，考慮單一HPV E6/E7 mRNA、ATG-12或Tie-1篩查HSIL+的優(yōu)劣，本研究進一步聯(lián)合HPV E6/E7 mRNA、ATG-12或Tie-1篩查HSIL+，結果顯示在HPV E6/E7 mRNA陽性基礎上，以ATG-12或Tie-1任意一項陰性為聯(lián)合篩查表現(xiàn)，篩查效能上升并高于任意單一檢驗指標篩查，敏感度、特異度分別為89.66%、81.48%。但本研究為回顧性分析，為滿足研究需求，研究對象僅納入留存有宮頸組織標本的患者，可能導致樣本對象的代表性欠缺，另LSIL組樣本不足30例，均可能導致研究結論具有一定偏倚，擬在下階段研究中收集更具代表性的大樣本量患者資料，補充及完善本研究結論，為宮頸病變惡性進展防治提供更嚴謹?shù)膮⒖家罁?jù)。

綜上所述，宮頸組織HPVE6/E7mRNA陽性表達隨SIL病理分級增加而增加，ATG12、Tie-1陽性表達率則隨病理分級增加而降低，三者均可作為篩查HSIL+的可靠檢驗指標，但在ATG12、Tie-1陽性基礎上，聯(lián)合ATG12陰性或Tie-1陰性為篩查條件可進一步提升篩查效能，值得臨床重視。