王男，姚玉芳，張福波，苗娜，徐鑫，楊潮萍

1 滄州市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 滄州 061000；2 滄州市中心醫(yī)院中醫(yī)科

帕金森病（PD）是一種進(jìn)展緩慢的神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為靜止性震顫、步態(tài)異常及認(rèn)知功能障礙（CD）等。據(jù)報(bào)道，有25%～30%的PD 患者并發(fā)CD，其中10%～20%的患者隨病情加重進(jìn)展為癡呆［1-2］。外泌體中含多種蛋白質(zhì)和核酸，其作為細(xì)胞間信息傳遞的媒介，介導(dǎo)了PD 發(fā)病和進(jìn)展過程［3］。miR-425-5p 作為微小RNA（miRNA）家族中一員，已被報(bào)道與PD相關(guān)炎癥、神經(jīng)元凋亡等有關(guān)［4］，此外還與阿爾茨海默病中tau 磷酸化和神經(jīng)元凋亡密切相關(guān)［5］。本研究通過分析miR-425-5p 與PD 并發(fā)CD 的關(guān)系，旨在為PD并發(fā)CD的預(yù)防和治療提供幫助。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)《中國帕金森病的診斷標(biāo)準(zhǔn)（2016版）》［6］確診為PD；年齡55～80歲；配合研究相關(guān)檢查項(xiàng)目；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴腦血管疾病、阿爾茨海默病及腦部創(chuàng)傷史；嚴(yán)重實(shí)質(zhì)臟器功能異常；精神疾病、血液系統(tǒng)疾病或惡性腫瘤；伴視力、聽力或語言表達(dá)障礙等。選取2019年4月—2021 年8 月在滄州市中心醫(yī)院就診的PD 患者129 例，其中男73 例、女56 例，年齡55～73（63.75±3.85）歲，體質(zhì)量指數(shù)（BMI）為（25.09 ± 3.13）kg/m2；合并糖尿病史24 例，吸煙43 例，飲酒44 例；學(xué)歷高中及以下54 例，大專及以上75 例；收縮壓（SBP）為（137.47±18.03）mmHg，舒張壓（DBP）為（84.02±9.83）mmHg；Hoehn-Yahr（H-Y）分期早期45例、中期69例、晚期15例。本研究經(jīng)滄州市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書。

1.2 CD 診斷標(biāo)準(zhǔn) 于PD 患者就診當(dāng)天，使用MoCA 量表評(píng)價(jià)其認(rèn)知功能，該量表包含7 個(gè)維度，分別為命名、注意、語言、抽象、視空間與執(zhí)行、延遲記憶、定向，總分30分（受試者受教育年限≤12年者，總分加1 分）。總分0～9 分為重度，10～20 分為中度，21～26分為輕度，27～30分為正常。

1.3 血清外泌體中miR-425-5p 檢測(cè) 抽取PD 患者外周靜脈血10 mL，用ExoQuick 外泌體快速提取試劑盒（美國SBI 公司）提取血清中的外泌體，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測(cè)miR-425-5p 水平。用TRIzol 試劑提取外泌體中總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其純度，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TAKARA 公司）將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用CFX96型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40 個(gè)循環(huán)。引物序列：miR-425-5p上游：5＇-GGGGAGTTAGGATTAGGTC-3＇，下游5＇-TGCGTGTCGTGGAGTC-3＇；內(nèi) 參U6 上 游5＇-CTCGCTTCGGGCAGCACA-3＇；下 游5＇-AACGCTCTCACGAATTTGCGT-3＇。引物序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)。用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-425-5p 的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)判斷計(jì)量資料是否服從正態(tài)分布，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以xˉ±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。用Pearson 相關(guān)分析miR-425-5p 與MoCA 量表評(píng)分的關(guān)系；用受試者工作特征（ROC）曲線評(píng)價(jià)miR-425-5p 判斷PD 并發(fā)CD 的價(jià)值；用Logistic 回歸分析miR-425-5p 與PD 并發(fā)CD 的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PD患者并發(fā)CD的情況 129例PD患者中，并發(fā)CD 47例，其中輕度41例、中度6例。

2.2 CD與非CD患者臨床資料比較 CD患者男25例、女22 例，年齡（63.81 ± 3.65）歲，BMI（24.85 ±3.14）kg/m2，有糖尿病史10例、吸煙史18例、飲酒史21例，學(xué)歷高中及以下27例、大專及以上20例，SBP（145.04 ± 19.21）mmHg、DBP（84.77 ± 8.13）mmHg，H-Y 分期早期4 例、中期32 例、晚期11 例；非CD 患者男25 例、女22 例，年齡（63.72 ± 3.99）歲，BMI（25.27±3.14）kg/m2，有糖尿病史14例、吸煙史25 例、飲酒史23 例，學(xué)歷高中及以下27 例、大專及以 上55 例，SBP（133.12 ± 15.86）mmHg、DBP（83.59±10.70）mmHg，H-Y 分期早期41例、中期37例、晚期4例。CD患者高中及以下學(xué)歷占比、SBP和H-Y 中晚期占比均高于非CD 患者（P均＜0.05），二者年齡、性別、BMI、糖尿病史、吸煙史、飲酒史、DBP水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。

2.3 CD 與非CD 患者外泌體miR-425-5p 水平比較 CD患者外泌體miR-425-5p表達(dá)量為0.66±0.10，低于非CD患者的0.84±0.13（t=8.379，P＜0.01）。

2.4 PD 患者miR-425-5p 與MoCA 量表評(píng)分的相關(guān)性 miR-425-5p 與MoCA 量表中語言、抽象、視空間與執(zhí)行、延遲記憶和總分均呈正相關(guān)（r分別為0.339、0.489、0.347、0.555、0.541，P均＜0.01）。

2.5 miR-425-5p 對(duì)PD 并發(fā)CD 的診斷效能 miR-425-5p 診斷PD 并發(fā)CD 的ROC 曲線下面積為0.876（95%CI為0.810～0.943），最佳截?cái)嘀禐?.71，靈敏度和特異度分別為82.98%和87.80%。

2.6 miR-425-5p與PD并發(fā)CD的關(guān)系 將PD是否并 發(fā)CD 作 為 因 變 量，將 飲 酒 史（χ2=3.677，P=0.055）、學(xué)歷、SBP、H-Y 分期、miR-425-5p 作為自變量（變量賦值：飲酒史無=0，有=1；學(xué)歷高中及以下=0，大專及以上=1；SBP≤155 mmHg=0，＞155 mmHg=1；H-Y 分期早期=1，中期=2，晚期=3；miR-425-5p≤0.71=0，＞0.71=1；并 發(fā)CD 否=0，是=1），納 入Logistic 回歸分析，結(jié)果顯示，大專及以上學(xué)歷、miR-425-5p＞0.71 是PD 并發(fā)CD 的獨(dú)立保護(hù)因素，SBP＞155 mmHg 是PD 并發(fā)CD 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05或＜0.01）。見表1。

表1 PD并發(fā)CD影響因素的Logistic回歸分析結(jié)果

3 討論

PD 發(fā)病人群主要是老年人，隨著中國人口老齡化加重，PD 發(fā)病率將進(jìn)一步升高，PD 并發(fā)CD 的患者數(shù)量勢(shì)必會(huì)隨之增長。目前，對(duì)于PD 并發(fā)CD 患者多采用藥物治療，如卡巴拉汀和左旋多巴片等，可在一定程度上提高患者的認(rèn)知功能和生活能力，但部分患者治療獲益甚微，預(yù)后不佳［7-8］。若在PD 并發(fā)CD 早期及時(shí)給予干預(yù)，可有效抑制病情進(jìn)展，提高患者生活質(zhì)量。目前，臨床尚缺乏診斷效能高的指標(biāo)用于早期識(shí)別PD 并發(fā)CD，本文通過研究miR-425-5p 與PD 并發(fā)CD 的關(guān)系，以期為PD 并發(fā)CD 的早期預(yù)防和治療提供幫助。

既往研究顯示，miR-425-5p 與惡性腫瘤如結(jié)直腸癌［9］、卵巢癌［10］、非小細(xì)胞肺癌［11］及肝細(xì)胞肝癌［12］等的發(fā)病和進(jìn)展有關(guān)。新近研究發(fā)現(xiàn)，miR-425-5p過表達(dá)可通過抑制炎癥和氧化應(yīng)激來減弱魚藤酮誘導(dǎo)的PD 大鼠模型的神經(jīng)元凋亡、Th 陽性細(xì)胞丟失和小膠質(zhì)細(xì)胞活化［4］。此外，在阿爾茨海默病樣細(xì)胞模型中，miR-425-5p 還可靶向熱休克蛋白B8，促進(jìn)細(xì)胞中的tau 磷酸化和神經(jīng)元凋亡［5］。HU 等［13］報(bào)道，miR-425 缺乏可促進(jìn)PD 小鼠模型的神經(jīng)元壞死性凋亡和多巴胺能神經(jīng)變性。miR-425-5p可靶向沉默信息調(diào)節(jié)因子1/核因子-κB 信號(hào)通路抑制缺血性卒中小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)和血腦屏障損傷［14］。小膠質(zhì)細(xì)胞在PD 發(fā)病進(jìn)展過程中扮演著雙重角色，靜息態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，可釋放促炎因子，加重炎癥反應(yīng)；活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可釋放抗炎因子，修復(fù)并保護(hù)神經(jīng)元。本研究結(jié)果顯示，CD 患者miR-425-5p水平低于非CD患者，提示PD并發(fā)CD后miR-425-5p 水平降低。Pearson 相關(guān)分析結(jié)果顯示，miR-425-5p 與MoCA 量表中語言、抽象、視空間與執(zhí)行、延遲記憶和總分均呈正相關(guān)關(guān)系，表明miR-425-5p 可能通過影響PD 患者負(fù)責(zé)語言、抽象、視空間與執(zhí)行和延遲記憶相關(guān)腦部區(qū)域功能參與CD 發(fā)病。ROC 曲線分析結(jié)果顯示，miR-425-5p 判斷PD 并發(fā)CD 的ROC 曲線下面積為0.876，提示miR-425-5p 對(duì)PD并發(fā)CD有一定的判斷價(jià)值，可輔助臨床決策。

本研究Logistic 回歸分析結(jié)果顯示，miR-425-5p＞0.71 是PD 并發(fā)CD 的獨(dú)立保護(hù)因素，推測(cè)其原因是外泌體中miR-425-5p水平與腦部氧化應(yīng)激、tau磷酸化和神經(jīng)元凋亡等有關(guān)，其水平可反映PD患者的腦部結(jié)構(gòu)和功能的病變情況。既往研究結(jié)果顯示，年齡和受教育程度與PD 患者并發(fā)CD 有關(guān)［15-16］。本研究結(jié)果顯示，大專及以上學(xué)歷是PD 并發(fā)CD 的獨(dú)立保護(hù)因素，與既往研究結(jié)果相符。本研究未將年齡納入Logistic 回歸分析，其原因在于：一是PD 發(fā)病人群主要為老年人，為保證收集到足夠多的PD患者進(jìn)行研究，對(duì)年齡做了一定限制；二是為避免影響miR-425-5p分析結(jié)果，年齡作為混雜因素，易影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性；三是本研究中受試者對(duì)象年齡分布較為緊密，差異不顯著。SHAH 等［17］研究發(fā)現(xiàn)，SBP 水平與腦血流關(guān)系密切，較高的SBP 可誘發(fā)腦結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)而破壞腦組織；隨著SBP 升高，腦內(nèi)β淀粉樣蛋白沉積增加，導(dǎo)致CD 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加。本研究結(jié)果顯示，SBP＞155 mmHg 是PD 并發(fā)CD 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，表明SBP 升高增加了PD 并發(fā)CD 的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，提示應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注高SBP 的PD 患者，避免其并發(fā)CD。

綜上所述，血清外泌體來源的miR-425-5p 水平低與PD 并發(fā)CD 有關(guān)。本研究上存在一定局限性，一是受試對(duì)象均來自于同一家醫(yī)院，且樣本量有限，樣本選擇上可能存在一定偏倚，后續(xù)將開展多中心、大樣本研究；二是本研究受試對(duì)象均為首次確診的PD 患者，對(duì)于已接受治療的PD 患者，miR-425-5p 是否可用于并發(fā)CD 的判斷還未可知，有待進(jìn)一步深入研究。