劉 麗,聶曉彤,黃 迪,劉兆敏,李 夢
(德州學(xué)院生物物理研究院,山東 德州 253023)
作為我國農(nóng)業(yè)和國民經(jīng)濟的重要基礎(chǔ),生豬養(yǎng)殖一直受到廣泛關(guān)注。目前針對仔豬已展開大量研究,但主要集中于斷奶后仔豬營養(yǎng)、疾病預(yù)防等方面,對哺乳期仔豬的研究相對較少[1]。哺乳期是仔豬生長發(fā)育最快、最易患病死亡的時期[2],對該階段進行研究可為生豬養(yǎng)殖提供理論指導(dǎo)。
乳汁是哺乳期仔豬的主要食物,其成分對仔豬的生長發(fā)育具有重要影響。目前對乳汁的報道主要集中在乳鐵蛋白、免疫蛋白和脂肪酸等生物活性物質(zhì)[3],但此外,乳汁中還含有豐富的微生物[4]。已證實,母仔之間可通過母乳途徑進行微生物垂直傳遞[5],這些微生物構(gòu)成子代腸道微生物的先鋒菌群,在一定程度上決定了子代腸道菌群的形成與發(fā)展[6]。因此,本研究以養(yǎng)殖場常見豬種大白豬和皮特蘭豬為模型,通過高通量測序研究豬乳不同泌乳階段乳汁微生物的變化,為進一步研究仔豬飼料中的益生菌添加提供參考。
選擇山東省新希望六和農(nóng)牧公司兩品種(大白、皮特蘭)具有相似預(yù)產(chǎn)期的健康母豬各8只,于妊娠第113天的上午9:00肌內(nèi)注射氯前列醇(每頭母豬0.2 mg)確保同步生產(chǎn)。分別在第0天(分娩當天)和第7天收集每頭母豬乳汁,按照大白豬初乳、大白豬成熟乳、皮特蘭豬初乳、皮特蘭豬成熟乳分為4組,依次編號為:YC、YM、PC、PM,置于液氮中隨后儲存于 -80 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.1 乳汁樣本總DNA提取每個樣本各取800 μl加入1.5 ml離心管中,于12 000 g離心機離心10 min,棄上清液。使用Easy Pure? Micro Genomic DNA Kit DNA提取試劑盒提取總DNA,采用1 % 瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。
1.2.2 PCR反應(yīng)和高通量測序委托上海美吉生 物醫(yī)藥科技有限公司進行后續(xù)PCR反應(yīng)及上機測序。測序引物為515F:5'-GTGCCAGCMGCCGC GGTAA-3'和806R:5'-GGACTACHVGGGTWTC TAAT-3',測序區(qū)域為V4區(qū),測序平臺是Illumina MiSeq。
1.2.3 生物信息學(xué)分析通過Usearch 11進行97 % OTU聚類,并生成特征表,與Silva數(shù)據(jù)庫比對,得到注釋結(jié)果,利用Mothur軟件和Qime軟件分別進行菌群α多樣性和β多樣性分析。
利用16S rDNA測序技術(shù)對樣本進行序列測定,獲得2390391條高通量序列,長度在221 bp~260 bp之間。OTU聚類結(jié)果表明,所測數(shù)據(jù)片段可以聚類成11 165個OTU,分布于68個門(phylum)、149個綱(class)、405個目(order)、783個科(family)、1 933個屬(genus)和4 329個種(species)(圖1)。
圖1 乳汁微生物運算分類單元維恩分析圖
采用t檢驗計算乳汁微生物豐富度指數(shù)(Chao1)和多樣性指數(shù)(Shannon)。由表1可知,成熟乳微生物群落的Chao1和Shannon指數(shù)較初乳降低,說明隨著時間的增加,乳汁菌群多樣性和豐富度降低。PCoA主坐標分析發(fā)現(xiàn),成熟乳組與初乳組樣本離散程度較大,表明母豬不同泌乳階段乳汁菌群結(jié)構(gòu)差異較大。
表1 樣本Alpha多樣性統(tǒng)計
圖2 各組乳汁微生物PCoA主坐標分析圖
2.3.1 門水平
16S rDNA測序結(jié)果表明,母豬乳汁細菌群落在門水平上以厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和放線菌門為主(表2)。與初乳相比,成熟乳中變形菌門豐度較高,而厚壁菌門和放線菌門豐度較低,擬桿菌門在大白豬乳汁中豐度較低,而在皮特蘭豬乳汁中豐度較高。上述結(jié)果表明母豬乳汁菌群中優(yōu)勢門的種類及豐度隨時間的變化而呈現(xiàn)不同程度的變化。
表2 乳汁成熟度對微生物群落優(yōu)勢門相對豐度的影響
在大白母豬不同泌乳階段,變形菌門相對豐度隨著時間變化而顯著增加(P<0.05,下同),其他菌門變化不顯著;在皮特蘭母豬不同泌乳階段,厚壁菌門相對豐度隨著時間極顯著減少,變形菌門和擬桿菌門相對豐度隨著時間極顯著增加,而放線菌門相對豐度隨著時間顯著減少。該結(jié)果表明母豬乳汁菌群中優(yōu)勢門的種類及豐度隨時間的變化與母豬的品種有關(guān)。
2.3.2 屬水平
表3表明,在母豬乳汁中相對豐度較高的前10個屬中,隨著時間的增加,大白豬乳汁中,叢毛單胞菌屬相對豐度極顯著增加,埃希氏-志賀氏菌屬相對豐度顯著增加,莫拉氏菌屬和擬桿菌屬相對豐度顯著減少,而其他菌屬豐度變化不顯著;皮特蘭豬乳汁中,埃希氏-志賀氏菌屬和叢毛單胞菌屬相對豐度極顯著增加,乳酸桿菌屬和鏈球菌屬相對豐度極顯著減少,羅姆布茨菌屬和嚴格梭菌屬相對豐度顯著減少。在兩品種豬乳中相對豐度隨時間顯著增加的優(yōu)勢屬均具有埃希氏-志賀氏菌屬和叢毛單胞菌屬,而顯著減少的優(yōu)勢屬各有不同。
表3 乳汁成熟度對微生物群落優(yōu)勢屬相對豐度的影響
本研究采用16S rDNA測序技術(shù)對大白豬和皮特蘭豬乳汁進行測序,通過OTU聚類分析、α多樣性分析和β多樣性分析發(fā)現(xiàn),母豬初乳微生物豐富度和多樣性均高于成熟乳,且不同泌乳階段菌群結(jié)構(gòu)差異較大,這可能與初乳中擁有更多的營養(yǎng)因子和生物活性物質(zhì)有關(guān),這些物質(zhì)促進了初乳中微生物的生長發(fā)育。
通過對菌群組成進行分析,本研究發(fā)現(xiàn),乳汁中細菌分屬68個門,其中厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門為母豬乳汁優(yōu)勢菌門,這與Jiang[7]對牦牛乳的研究結(jié)果基本一致。豬品種和泌乳階段顯著影響乳汁中優(yōu)勢菌群相對豐度的變化。Drago[8]等通過構(gòu)建微生物網(wǎng)絡(luò)證明乳汁中的微生物群處于動態(tài)發(fā)展中,這與本研究結(jié)果一致,而不同品種母豬飲食的差異等因素可導(dǎo)致這種影響的發(fā)生。
大量研究表明母乳中存在潛在致病菌,其對仔豬健康產(chǎn)生深遠影響。仔豬體內(nèi)右旋天冬氨酸會增加埃希氏-志賀氏菌屬豐度而誘發(fā)腸道炎癥[9]。Lopez-Serrano等[10]從仔豬體內(nèi)分離出具有致病性的莫拉氏菌株,該菌株可導(dǎo)致仔豬呼吸道疾病的發(fā)生[11]。此外,鏈球菌屬也可致仔豬發(fā)生呼吸道疾病[12]。近年來研究發(fā)現(xiàn)擬桿菌可引起斷奶期仔豬腹瀉的發(fā)生[13]。本研究雖通過高通量測序以及查閱相關(guān)文獻在母豬乳汁中發(fā)現(xiàn)部分致病菌,但對于其在仔豬疾病和健康中的影響還需做進一步評估。