韋良孟，李昌明，翁鴻宇，王秀媛，王 芳，戴培強(qiáng)，柴同杰*

（1山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 泰安 271018； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所；江蘇 南京；3.中科生物研究所，山東 泰安）

梭菌是一類革蘭氏陽性厭氧桿菌，該屬細(xì)菌分布極其廣泛，存在于腐物、土壤、人和動(dòng)物腸道中。梭菌病則是由梭菌屬中致病性菌種引起疾病的總稱[1]。一般認(rèn)為其病發(fā)機(jī)制是由梭菌感染后，釋放的外毒素所致，如C型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的α、β毒素[2]，可引起多種家畜腸源毒血癥和“猝死癥”；D型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的α、ε毒素，能引起羔羊、綿羊、山羊等動(dòng)物的腸毒血癥[3]；腐敗梭菌主要分泌α毒素，能夠引起綿羊快速感染死亡稱為快疫[4]。梭菌病發(fā)病急，往往來不及治療導(dǎo)致死亡。因此，免疫接種是預(yù)防梭菌病最有效的途徑。將外毒素滅活后轉(zhuǎn)變?yōu)轭惗舅匦纬梢呙?，免疫接種動(dòng)物后，能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生相 應(yīng)的抗體即抗毒素。但由于腐敗梭菌的培養(yǎng)條件苛求，外毒素的制備困難，可通過基因工程技術(shù)獲得的重組腐敗梭菌α毒素，制備的疫苗對火雞和小鼠等起到了很好保護(hù)作用[5]。故本課題將重組腐敗梭菌α毒素替代天然毒素，制備C、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌和腐敗梭菌二價(jià)二聯(lián)疫苗。應(yīng)用于本體動(dòng)物綿羊并評估其保護(hù)效果，為將來‘三聯(lián)四防類毒素疫苗’的研制奠定基礎(chǔ)，提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

C型、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌 （ National Collection of Type Cμltμres，英國微生物菌種保藏 中心保藏，保藏號：NCTC 3180、NCTC 8346）；腐敗梭菌（美國菌種保藏中心保藏，保藏號：ATCC 12464）；腐敗梭菌天然毒素由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備并保存；硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基購自于青島海博生物技術(shù)有限公司、HIS標(biāo)簽純化試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；Clarity TM Western ECL Sμbstrate 發(fā)光試劑盒購自美國BIO-RAD公司；限制性內(nèi)切酶XhoI、NdeI購自寶生生物（大連）公司，T4 DNA連接酶購自NEB公司。昆明系小鼠購自濟(jì)南泰邦生物有限公司；6～7月齡綿羊由泰安市某羊場飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用和操作按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利的相應(yīng)要求進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 C、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌天然毒素的制備

將C型產(chǎn)氣莢膜梭菌（NCTC 3180）接種在綿羊血平板上復(fù)蘇，37 ℃ 厭氧培養(yǎng)12 h后，挑取菌落接種于硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基中，37 ℃ 厭氧震蕩培養(yǎng)12 h，隨后以5 % 的比例接種于自制的產(chǎn)毒培養(yǎng)基中，45 ℃ 培養(yǎng)6 h，將培養(yǎng)液離心（10 000 r/min）30 min取上清，并用0.22 μm濾膜過濾，得到的上清液即為C型產(chǎn)氣莢膜梭菌的外毒素，以相同方法得D型產(chǎn)氣莢膜梭菌（NCTC 8346）外毒素。隨后將產(chǎn)毒培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的C型產(chǎn)氣莢膜梭菌和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素用飽和硫酸銨法粗提后，用Tris-HCl（pH 7.4）溶液進(jìn)行溶解，并于 -20 ℃ 保存。

1.2.2 腐敗梭菌α重組蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建

（1）腐敗梭菌基因組DNA的提取：將凍存的腐敗梭菌菌種，按照10 % 的比例接種至以腦心浸液為基礎(chǔ)的改良型培養(yǎng)基中，于37 ℃厭氧環(huán)境中靜置培養(yǎng)1～2 d。取培養(yǎng)好的菌液按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的說明書提取基因組，將提取的DNA于 -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）腐敗梭菌csa基因擴(kuò)增與序列分析：根據(jù) GenBank中公布的α毒素全長序列（NCBI No. AB083433）設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物csa-F和csa-R（表1），并在引物5'末端分別引入XhoI和NdeI酶切位點(diǎn)。以提取的腐敗梭菌基因組為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增csa基因。PCR體系為：2×Repid Taq Master Mix 10 μl，上下游引物各0.4 μl，模板1 μl，ddH2O 8.2 μl。PCR反應(yīng)條件為95 °C 預(yù)變性5 min；95 °C 反應(yīng)15 s，55 °C 反應(yīng)30 s，72 °C 反應(yīng)30 s，以上三個(gè)過程進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；然后72 °C 反應(yīng)10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收目的片段，并與pET-21a（+）分別進(jìn)行雙酶切。通過T4 DNA連接酶將合成的目的片段及酶切后的pET-21a（+）載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，鑒定正確的重組質(zhì)粒PET-csa送青島擎科生物科技有限公司測序。

表1 PCR擴(kuò)增腐敗梭菌csa基因的引物序列

（3）腐敗梭菌csa基因的表達(dá)及純化：將重組質(zhì)粒PET-csa轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，涂布于氨芐抗性平板，37 °C 過夜培養(yǎng)后，挑取單菌落接入5 ml氨芐抗性LB培養(yǎng)基中，37 °C 220 r/min過夜培養(yǎng)。隨后按1 % 轉(zhuǎn)接于100 ml含氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C 220 r/min培養(yǎng)，當(dāng)OD值約為0.6時(shí)，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，37 °C 200 r/min誘導(dǎo)5 h，收獲菌體離心并將菌體沉淀用PBS懸浮洗滌3次，加入8 ml Binding bμffer懸浮后超聲裂解30 min，4 °C 12 000 r/min離心10 min后，上清經(jīng)0.45 μm濾器過濾，應(yīng)用Ni柱純化試劑盒純化目的蛋白，對蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析誘導(dǎo)結(jié)果。

（4）重組蛋白的免疫原性分析：取表達(dá)的重組蛋白制樣后按10 μl每孔上樣，經(jīng)12.5 % SDS-PAGE分離后，應(yīng)用半干轉(zhuǎn)印儀轉(zhuǎn)印至NC膜，并將NC膜置于5 % 脫脂乳中4 °C 過夜封閉后，置于anti-His鼠單抗（1:8 000稀釋）中37 °C 孵育2 h，PBST洗3次后，于HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG-HRP（l:8 000稀釋）37 °C孵育2 h，PBST洗3次后，按Clarity TM Western ECL Substrate操作說明，避光條件下，將試劑A與試劑B等體積混合，將NC膜放入混合液中，37 ℃ 避光反應(yīng)5 min，于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.3 疫苗的制備及檢驗(yàn)

將C、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素和重組腐敗梭菌α毒素按照0.1～0.2 mg/ml的終濃度進(jìn)行稀釋，隨后將這三種組分等量混合后，加入0.3 % 甲醛溶液37 ℃ 滅活48 h。將滅活完全的類毒素按1:2（V/V）的比例，緩慢加入白油佐劑，經(jīng)乳化后制成疫苗，按《中華人民共和國生物制品規(guī)程》檢驗(yàn)合格，4 ℃保存。

1.2.4 疫苗的保護(hù)效果評價(jià)

（1）外毒素對于小鼠的最小致死量測定：將C、D型除菌外毒素和腐敗梭菌外毒素分別用生理鹽水倍比稀釋，腹腔注射0.5 ml，使全部小鼠死亡的最大稀釋倍數(shù)時(shí)毒素的含量為小鼠的最小致死量。

（2）疫苗對于小鼠的保護(hù)率的評價(jià)：取16～ 20 g小鼠27只，分為3組（對照組、0.1 ml組和0.2 ml組），每組9只，分別以0.1 ml、0.2 ml的劑量接種此疫苗，對照組注射0.1 ml生理鹽水。21 d后，每組腹腔注射1MLD各天然毒素3只，觀察72 h，記錄小鼠死亡和存活情況。

（3）本體動(dòng)物綿羊的血清抗體效價(jià)檢測：取6～7月齡的綿羊（約90 kg）6頭，分為3組，2只/組，分別注射2 ml、5 ml和7 ml的疫苗。免疫21 d后，收集血清，并將每組的血清混合后，通過間接ELISA法分別測定各組免疫綿羊血清中抗各天然毒素的抗體效價(jià)。

1.2.5 毒素中和試驗(yàn)

根據(jù)間接ELISA結(jié)果，對效價(jià)最好的一組綿羊血清進(jìn)行毒素中和試驗(yàn)。將血清按照1:100、1:200、1:400、1:600、1:800的比例用pH為7.4的PBS溶液進(jìn)行稀釋。取各稀釋度的綿羊血清0.2 ml與2個(gè)最小致死量（MLD）各型毒素混合，加入無菌生理鹽水至總體積為1.0 ml，并置于37 ℃ 作用2 h，然后腹腔注射16～20 g小鼠3只，0.5 ml/只。觀察48 h，統(tǒng)計(jì)死亡數(shù)和存活數(shù)。

中和效價(jià)是指0.1 ml稀釋后的血清或初乳能夠中和1個(gè)最小致死量的天然毒素，即使注射后的小鼠全部存活，此時(shí)血清的最大稀釋倍數(shù)稱為該血清或初乳的中和效價(jià)，未經(jīng)免疫的綿羊血清作為陰性對照。

2 結(jié)果

2.1 相關(guān)毒素蛋白的鑒定結(jié)果

2.1.1 C、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌天然毒素蛋白的檢測

將制備的外毒素利用SDS-PAGE的方法進(jìn)行分離，C型產(chǎn)氣莢膜梭菌的α毒素蛋白分子量為43 Kda、β毒素蛋白分子量為34 Kda，D型產(chǎn)氣莢膜梭菌的ε毒素蛋白分子量為33 Kda，圖1中的條帶位置大小符合上述毒素蛋白大小。

圖1 C、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌天然毒素SDS-PAGE鑒定圖譜

2.1.2 腐敗梭菌csa基因的擴(kuò)增結(jié)果

以腐敗梭菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 12464基因組DNA為模板，利用PCR擴(kuò)增csa基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產(chǎn)物大小為1329bp（圖2），與預(yù)期片段大小一致，經(jīng)測序鑒定為csa基因。

圖2 腐敗梭菌csa基因的擴(kuò)增

2.1.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建結(jié)果

腐敗梭菌csa基因片段與pET-21（+）質(zhì)粒分別經(jīng)XhoI和NdeI雙酶切后連接。重組質(zhì)粒pET-csa經(jīng)XhoI和NdeI雙酶切鑒定，目的片段大小為1 329 bp，結(jié)果與預(yù)期相符合（圖3）。測序結(jié)果表明，成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-csa。

圖3 重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物電泳圖

2.1.4 重組蛋白的表達(dá)與純化

將pET-csa轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果如圖4顯示，重組蛋白獲得表達(dá)，其分子質(zhì)量大小為46 Kda，與理論預(yù)期一致，且主要以可溶性方式表達(dá)。利用Westen-Blot鑒定，表明重組蛋白表達(dá)成功（圖5）。

圖4 腐敗梭菌α毒素重組蛋白表達(dá)結(jié)果的 SDS-PAGE 鑒定圖譜

圖5 腐敗梭菌α毒素重組蛋白特異性鑒定的 Western-blot 圖譜

2.2 疫苗的制備及檢驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 小鼠最小致死量的測定

將C型產(chǎn)氣莢膜梭菌粗毒素稀釋25、50、100、200倍后（表2），經(jīng)腹腔注射0.5 ml后，小鼠均全部死亡，因而毒素稀釋200倍為C型產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素對小鼠的最小致死量，此稀釋度所含C型產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素為2.5 μl，因而C型產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素對小鼠的MLD量是2.5 μl。同理，D型產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素對小鼠的MLD為5 μl，天然腐敗梭菌α毒素對小鼠的MLD為10 μl。

表2 天然毒素對小鼠的最小致死量試驗(yàn)

2.2.2 疫苗的安全性檢驗(yàn)

制備的二價(jià)二聯(lián)疫苗無菌檢驗(yàn)，甲醛、硫柳汞殘留量檢驗(yàn)，均符合《中華人民共和國獸用生物制品》要求。安全性檢驗(yàn)中接種大劑量疫苗的兔子觀察10 d，精神狀態(tài)良好，全身無異常反應(yīng)，注射部位無腫脹、結(jié)節(jié)或肉芽腫。免疫效力檢驗(yàn)中，攻毒后接種疫苗的兔子全部存活，且精神狀態(tài)良好，對照組兔子全部死亡。

2.2.3 疫苗對小鼠的免疫保護(hù)效果比較

在對免疫后的小鼠攻入1 MLD的各天然毒素后，疫苗對0.2 ml免疫組的小鼠的保護(hù)率可達(dá)100 %（表3），而0.1 ml免疫組的小鼠在腐敗梭菌的攻擊下其保護(hù)能力稍弱。

表3 各毒素對免疫小鼠的攻毒保護(hù)試驗(yàn)

2.2.4 綿羊血清中的抗體效價(jià)

通過間接ELISA法測定的綿羊血清中抗C型產(chǎn)氣莢膜梭菌、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌和腐敗梭菌外毒素的血清抗體（表4），各免疫劑量下的綿羊均能產(chǎn)生較高的抗毒素血清，效價(jià)基本在1:1 600以上，而隨著免疫劑量的增加，其血清效價(jià)也隨之明顯上升。而當(dāng)免疫7 ml疫苗后，血清中的抗體并沒有在繼續(xù)升高。同時(shí)，血清中的抗C型產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素抗體效價(jià)在各免疫劑量下均低于抗D型產(chǎn)氣莢膜梭菌和腐敗梭菌外毒素抗體。

表4 間接ELISA測定不同免疫劑量下 綿羊血清抗各毒素的抗體效價(jià)

2.2.5 毒素中和試驗(yàn)結(jié)果

選取5 ml組的血清進(jìn)行小鼠毒素中和試驗(yàn)，測定綿羊血清抗體中和效價(jià)（表5），結(jié)果表明，綿羊血清中的抗C型產(chǎn)氣莢膜梭菌中和抗體效價(jià)為400；D型產(chǎn)氣莢膜梭菌和腐敗梭菌抗體抗體效價(jià)均為800；而未免疫綿羊血清則檢測不到中和抗體。

表5 綿羊血清抗各毒素中和抗體效價(jià)檢測

3 討論與結(jié)論

近年來，由于梭菌感染導(dǎo)致的羊群大量死亡屢見不鮮，對羊業(yè)生產(chǎn)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。而目前國內(nèi)對于梭菌病的預(yù)防多采用多種疫苗聯(lián)用的策略，不僅加重了養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，并且多次注射大大增加了免疫動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)。所以本研究制備針對C、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌和腐敗梭菌的類毒素二價(jià)二聯(lián)疫苗，能夠通過一次免疫即可同時(shí)預(yù)防C、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌和腐敗梭菌的感染，能夠預(yù)防羊猝死癥、羊腸源毒血癥、羊快疫等。

現(xiàn)有的疫苗如‘三聯(lián)四防’中的抗原成分主要為菌體抗原。根據(jù)對梭菌病發(fā)病機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，致病物質(zhì)主要是幾種病原梭菌產(chǎn)生的毒素進(jìn)入血液循環(huán)造成毒血癥。所以，疫苗抗原應(yīng)為類毒素，能夠起到確實(shí)的免疫保護(hù)效果。本研究使疫苗的抗原成分由菌體上升為毒素蛋白，具有鮮明的創(chuàng)新。

根據(jù)《中國獸藥典》2010年版三部的規(guī)定，血清中和效價(jià)對快疫達(dá)到1即0.1 ml免疫動(dòng)物血清可中和1 MLD毒素，對腸毒血癥達(dá)到3 即0.1 ml免疫動(dòng)物血清可中和3 MLD毒素，即可判為疫苗效力合格，可以用于預(yù)防羊相關(guān)梭菌病。而本實(shí)驗(yàn)所制備的疫苗中和效價(jià)在400以上，其中抗C、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素中和效價(jià)和劉雪慧[7]等結(jié)果相近。證明該疫苗具有良好的免疫原性。值得注意的是，在大劑量免疫綿羊后，綿羊血清抗體效價(jià)并未有升高，推測可能是由于大劑量的抗原成分進(jìn)入體內(nèi)后，宿主仍有一定的耐受性。也是其安全性的表現(xiàn)。

目前。國內(nèi)的三聯(lián)四防疫苗中腐敗梭菌組分血清抗體效價(jià)不高，按《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》（2000年版）的培養(yǎng)法，顯示了獲得配制聯(lián)苗的有效抗原含量不足[8]。而本試驗(yàn)選用基因工程技術(shù)獲得的重組腐敗梭菌α毒素，替代該疫苗腐敗梭菌菌體抗原組分，配制聯(lián)苗的效價(jià)高，且對其他組分的免疫效果無影響，這為將來三聯(lián)四防疫苗的升級換代提供依據(jù)。