孫婧朗，周慧晶，鄭珂媛，戴錫玲，朱木蘭*

(1. 中國科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心，上海 200032；2. 上海辰山植物園 / 中國科學(xué)院上海辰山植物科學(xué)研究中心 / 上海市資源植物功能基因組學(xué)重點實驗室，上海 201602；3. 上海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200234)

菠蘿(Ananas comosus)又名黃梨、鳳梨，原產(chǎn)于美洲熱帶地區(qū)，是熱帶亞熱帶四大名果之一，世界范圍內(nèi)約有90個國家種植，中國菠蘿年產(chǎn)量居全球第六位，其中84%以上的菠蘿種植面積集中在廣東及海南兩省[1—2]。菠蘿維生素種類較多[3—5]，藥用價值高，菠蘿汁可改善肥胖及相關(guān)心血管功能障礙等疾病[6—7]。因而菠蘿新品種培育和優(yōu)質(zhì)種苗繁育備受關(guān)注。但菠蘿為異花授粉植物，存在花期不同步、雜交種子獲取困難[8]、萌發(fā)率低[9]、品種較單一[10]、基因豐余度高[11]、種質(zhì)穩(wěn)定性差[12—13]等問題，遺傳保守性種苗規(guī)?；庇w系亦有待建立。組織培養(yǎng)技術(shù)可以快速量化繁育菠蘿芽苗，加速菠蘿育種進(jìn)程[14—15]。因此，菠蘿高效離體再生技術(shù)體系研究十分重要。

本文對近年來菠蘿離體再生研究進(jìn)行總結(jié)，包括外植體選擇、外植體消毒、基本培養(yǎng)基確定、直接不定芽發(fā)生、間接不定芽發(fā)生、體細(xì)胞胚胎發(fā)生、不定根誘導(dǎo)及煉苗移栽等七個方面，并展望未來研究方向，以期為完善菠蘿繁育體系及菠蘿種質(zhì)資源的創(chuàng)新提供參考。

1 外植體選擇

外植體直接影響植物離體再生頻率，進(jìn)而影響遺傳轉(zhuǎn)化及基因編輯效率，富含干細(xì)胞的外植體再生頻率相對較高。菠蘿離體再生通常選用芽、幼葉和莖段等組織器官作為外植體，不同外植體再生頻率差異顯著。鄭加協(xié)等[16]選取蜜寶菠蘿的冠芽、裔芽、吸芽和塊莖芽開展不定芽誘導(dǎo)頻率研究，結(jié)果表明，冠芽再生誘導(dǎo)率最高(達(dá) 37.5%)，裔芽、吸芽、塊莖芽相對較差，且誘導(dǎo)率裔芽＞吸芽＞塊莖芽。李霞等[17]以莖段、莖薄片、葉鞘、葉片等為外植體，開展不定芽誘導(dǎo)速度研究，莖薄片不定芽誘導(dǎo)時間最短，僅需20～30 d，莖段需35 d，葉鞘需60 d以上，葉片未見不定芽。許早時等[18]以雜交品種粉菠蘿的冠芽、幼葉為外植體進(jìn)行不定芽遺傳穩(wěn)定性誘導(dǎo)研究，得到與實生苗基因型、表型一致的再生植株。因此，從誘導(dǎo)時間上來看，莖薄片的直接不定芽誘導(dǎo)所需時間最短；從再生頻率上來看，芽的誘導(dǎo)率最高，莖、葉其次；葉片是高度分化的組織器官，需經(jīng)由脫分化、再分化等環(huán)節(jié)，再生過程相對復(fù)雜，不定芽誘導(dǎo)難度高。

2 外植體消毒

無菌材料的獲得是離體再生體系建立的第一步，消毒處理至關(guān)重要。就菠蘿消毒而言，消毒劑一般選用氯化汞(HgCl2)[19]。許燕[20]使用酒精、0.1% HgCl2溶液及數(shù)滴吐溫對巴厘、神灣等菠蘿品種的冠芽、吸芽消毒，結(jié)果表明，75%酒精消毒90 s，0.1% HgCl2溶液10 min(加數(shù)滴吐溫)消毒效果最佳，污染率可降至33.3%，不定芽誘導(dǎo)率可達(dá)46.7%。楊冬業(yè)等[21]同樣發(fā)現(xiàn) 0.1% HgCl2溶液10 min(加數(shù)滴吐溫)對莖段消毒效果最理想，污染率為60%，成活率達(dá)53.3%。少數(shù)研究采用其他消毒方法，如Al-Saif等[22]用 20% NaClO溶液消毒 25 min；Sripaoraya等[23]用20% domestos漂白劑消毒40 min后，10% domestos漂白劑消毒10 min，均可獲得無菌材料。作為重金屬鹽類，HgCl2對細(xì)菌真菌的殺菌性極強(qiáng)，Hg2+可與蛋白結(jié)合，使蛋白變性失活[24]?？梢?，對于菠蘿不同品種、不同外植體而言，消毒步驟基本相同，即首先用洗潔精和自來水將外植體表面清洗干凈，75%酒精 30～120 s，0.1% HgCl2溶液 8～12 min(數(shù)滴吐溫)，無菌水沖洗。HgCl2消毒能力最強(qiáng)，NaClO次之，其他市售漂白劑更弱。因此，采用適當(dāng)?shù)南痉桨?，可將菠蘿外植體污染率降至較低水平，同時保持良好的材料活力。

3 基本培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

培養(yǎng)基是植物高效離體再生的根本，不同基本培養(yǎng)基下，菠蘿離體培養(yǎng)組織生長情況差異較大。Atawia等[25]以 MS、B5、WPM 及相應(yīng)的減少量培養(yǎng)基(1/4、1/2、3/4的 MS、B5、WPM)為基本培養(yǎng)基開展了菠蘿生長勢研究，發(fā)現(xiàn)正常鹽濃度的 MS培養(yǎng)基中菠蘿生長最佳。MS培養(yǎng)基中加入維生素可有效促進(jìn)試管苗出芽分化[26]。Fichet[27]采用 MT培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷分化，MT培養(yǎng)基中維生素和硝酸鉀濃度較高，有利于愈傷出芽。Kiss等[28]發(fā)現(xiàn)，N6培養(yǎng)基可使黃化的嫩枝變綠。菠蘿離體再生的最適基本培養(yǎng)基為 MS，可能因為菠蘿屬草本植物，器官生長發(fā)育快，營養(yǎng)供給需求高，對鉀和氮的需求量相對多，而MS培養(yǎng)基的硝酸鉀和硝酸銨等氮素營養(yǎng)成分含量較多，能保證菠蘿組織生長所需。

培養(yǎng)方法對再生效率也有所影響。一些研究表明，MS液體培養(yǎng)基優(yōu)于MS固體培養(yǎng)基。沈清景[29]研究剝粒菠蘿快繁技術(shù)時，發(fā)現(xiàn)液體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基誘導(dǎo)芽苗的增殖倍數(shù)是固體培養(yǎng)基的 2倍。鄭加協(xié)等[16]發(fā)現(xiàn)，液體振動培養(yǎng)最利于芽苗吸收養(yǎng)分，芽的增殖倍數(shù)最高，液體淺層靜止培養(yǎng)其次，固體培養(yǎng)最低。洪燕萍等增殖培養(yǎng)基采用固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換的方式，發(fā)現(xiàn)固體培養(yǎng)基培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基增殖倍數(shù)最高[30]。培養(yǎng)基均添加蔗糖 20～40 g·L-1，瓊脂粉 5～8 g·L-1，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基 pH為 5.6～6.0。培養(yǎng)條件均為 20～25 ℃，光照強(qiáng)度2000～3000 lx，光照時間12 h·d-1[31]?？梢?，對于誘導(dǎo)菠蘿芽苗再生，液體培養(yǎng)基增殖倍數(shù)更高，優(yōu)于固體培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)分布均勻，既可增大培養(yǎng)基與植物材料的接觸面積，又有利于溶解植物體的有害代謝產(chǎn)物。長時間的固體培養(yǎng)，易使菠蘿自身代謝產(chǎn)物增多，最終導(dǎo)致芽苗黃化死亡。

4 直接不定芽發(fā)生

直接不定芽發(fā)生，即組織器官在植物激素的作用下不經(jīng)愈傷組織誘導(dǎo)階段或進(jìn)程，直接產(chǎn)生不定芽的離體再生途徑。該途徑歷時周期短，不定芽遺傳保守性強(qiáng)。

4.1 直接不定芽誘導(dǎo)

菠蘿直接不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基大多以MS為基本培養(yǎng)基，添加生長素和細(xì)胞分裂素作為生長調(diào)節(jié)劑。生長素可調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育，加快代謝，提高抗逆能力。細(xì)胞分裂素促進(jìn)細(xì)胞分裂，是腋芽生長最直接有效的激活劑[32]。生長調(diào)節(jié)劑主要有6-BA、NAA、2,4-D、ZT，其中ZT可用于預(yù)防菠蘿常見病害——水心病[33]，高水平的ZT有利于菠蘿花器官形成[34]。研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基 MS + 27 μmol·L-1NAA +1 μmol·L-16-BA 誘 導(dǎo) 卡 因 類 菠 蘿 以 及 MS +5.0 mg·L-16-BA誘導(dǎo)‘Maspine’菠蘿時，不定芽誘導(dǎo)率最高，可達(dá) 86%[35—36]?？梢?，6-BA 是刺激菠蘿直接不定芽產(chǎn)生最有效的細(xì)胞分裂素，選用1.0～5.0 mg·L-16-BA 和 0.1～1.0 mg·L-1NAA 組合使用，可顯著增加不定芽的誘導(dǎo)率(表1)。

表1 不同菠蘿品種、外植體的不定芽誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)基Table 1 Adventitious bud induction and subculture media of different pineapple varieties and explants

4.2 直接不定芽繼代

菠蘿直接不定芽繼代培養(yǎng)主要是以MS為基本培養(yǎng)基，6-BA和NAA組合有利于芽的分化，合適的濃度配比可使芽的生長狀態(tài)達(dá)到最佳(表1)。

因此，菠蘿直接不定芽發(fā)生體系較成熟，采用的菠蘿品種豐富，外植體種類多樣，誘導(dǎo)率高，直接不定芽發(fā)生所需時間短于間接不定芽發(fā)生和體胚發(fā)生途徑，遺傳穩(wěn)定性更高。

5 間接不定芽發(fā)生

間接不定芽發(fā)生途徑是菠蘿組織培養(yǎng)的重要途徑之一，即外植體經(jīng)由愈傷組織誘導(dǎo)分化出不定芽，繼而形成完整植株。

5.1 愈傷組織誘導(dǎo)

愈傷誘導(dǎo)是間接不定芽發(fā)生的關(guān)鍵步驟，愈傷誘導(dǎo)率直接影響植株的再生效率。菠蘿愈傷組織誘導(dǎo)大多以MS為基本培養(yǎng)基，少數(shù)以N6為基本培養(yǎng)基，添加6-BA和NAA或是6-BA和2,4-D生長調(diào)節(jié)劑組合，少數(shù)添加 IBA、TDZ。林文秋等[40]采用菠蘿葉基為外植體，用 MS + 3 mg·L-16-BA +2 mg·L-1NAA進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)，出愈率最高可達(dá)60%。因此，較高濃度的細(xì)胞分裂素與生長素組合有利于愈傷誘導(dǎo)(表2)。

5.2 愈傷組織分化與芽苗伸長

菠蘿愈傷組織分化以 MS基本培養(yǎng)基添加生長調(diào)節(jié)劑6-BA和NAA為主，少數(shù)添加2,4-D和IBA。Sripaoraya 等[23]用 MS + 2.0 mg·L-16-BA +0.5 mg·L-12,4-D誘導(dǎo)愈傷分化不定芽，不定芽分化率高達(dá)83.30%。此外，6-BA和IBA同時使用可提高菠蘿扦插枝條的成活和發(fā)芽率[43]?？梢?，高濃度細(xì)胞分裂素配合低濃度生長素有助于愈傷分化(表 2)。

表2 不同菠蘿品種、外植體的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基Table 2 Callus induction medium of different pineapple varieties and explants

6 體細(xì)胞胚胎發(fā)生

體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑簡稱體胚發(fā)生，即植物細(xì)胞通過脫分化誘導(dǎo)成體細(xì)胞胚，再發(fā)育成完整植株的過程。體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑較其他組織器官發(fā)生途徑而言，遺傳相對穩(wěn)定，是較為理想的再生途徑。一般采用愈傷組織誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生，從體細(xì)胞向胚胎細(xì)胞的轉(zhuǎn)變是體胚發(fā)生的核心，是限制植物再生效率的關(guān)鍵步驟[46]。

來源于菠蘿愈傷組織的體細(xì)胞胚胎發(fā)生位于愈傷組織內(nèi)部和表層。Ma等[47]在2,4-D體細(xì)胞誘導(dǎo)實驗中，發(fā)現(xiàn)少數(shù)薄壁細(xì)胞可以轉(zhuǎn)化為感受態(tài)細(xì)胞，感受態(tài)細(xì)胞通過原胚突起、原胚和早期球狀胚形成球狀胚胎，從而完成再生過程。何業(yè)華等[48]取葉基愈傷組織細(xì)胞用 MS + 0.01 mg·L-1TDZ + 5 mg·L-12,4-D培養(yǎng)基誘導(dǎo)體細(xì)胞胚，誘導(dǎo)率高達(dá)97%，但這種體細(xì)胞胚很難繼續(xù)增殖、萌發(fā)。而后對從非胚性細(xì)胞至球狀胚的形成進(jìn)行了組織細(xì)胞學(xué)觀察和探討，以提高體胚發(fā)生率[49]。Sripaoraya等[23]用MS +3 mg·L-1picloram誘導(dǎo)體胚，發(fā)生率達(dá)58%；Soneji等[50]用 MS + 41 μmol·L-1picloram + 9 μmol·L-1TDZ誘導(dǎo)體胚，誘導(dǎo)率 55%；Yapo等[51]用 MSB(含 B5維生素的MS鹽) + 3 mg·L-1picloram誘導(dǎo)，胚性愈傷組織誘導(dǎo)頻率最高僅為 37.6%。梁雪蓮等[52]發(fā)現(xiàn)通過培養(yǎng)薄細(xì)胞層切片的方法，可不經(jīng)過愈傷階段，直接誘導(dǎo)體胚形成，獲得再生植株，有效地避免嵌合體的形成；Rao等[53]還對雜交胚進(jìn)行間接分化誘導(dǎo)，獲得了完整植株；Firoozabady等[54]通過體胚再生途徑對菠蘿遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)行研究，獲得了抗病抗蟲轉(zhuǎn)基因菠蘿。

可見，菠蘿體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)采用 MS +0.01 mg·L-1TDZ + 5 mg·L-12,4-D 配方效果較好，但體胚不萌發(fā)，體系有待進(jìn)一步優(yōu)化、完善。

7 生根培養(yǎng)與煉苗移栽

7.1 不定根誘導(dǎo)

不定根是吸收外界水和營養(yǎng)的主要器官。大多數(shù)生根誘導(dǎo)以MS和1/2MS基本培養(yǎng)基為主，添加生長調(diào)節(jié)劑主要是IBA，生根率可達(dá)90%～100%(表3)。

表3 不同菠蘿品種、外植體的生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基Table 3 Rooting induction medium of different pineapple varieties and different explants

生長素對根系發(fā)育的作用主要表現(xiàn)在調(diào)控不定根的發(fā)生和生長[55]。Jie等[56]認(rèn)為，當(dāng)培養(yǎng)基中存在生長素時，組織培養(yǎng)中就會有根形成，推測可能與生長素參與細(xì)胞間期、分裂和分化的調(diào)控有關(guān)。鄭加協(xié)等[16]發(fā)現(xiàn)，MS 培養(yǎng)基加入NAA 0.5 mg·L-1，IBA 1.0～5.0 mg·L-1時，培養(yǎng)30 d后生根率皆為100%。其中IBA濃度為3 mg·L-1時，根最粗壯。他提出用食用白糖和自來水代替化學(xué)純蔗糖和蒸餾水誘導(dǎo)生根，誘導(dǎo)生根效果無明顯差異，為簡化培養(yǎng)、降低成本提供新思路。

7.2 煉苗與移栽

試管苗的煉苗與移栽是組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵，影響菠蘿組培技術(shù)在實際生產(chǎn)中大規(guī)模應(yīng)用的主要問題在于組培苗移栽成功率低。以往研究中，采用合適的煉苗移栽方法，成活率可達(dá)90%及以上。

許燕[20]在菠蘿根生長至約3～4 cm時，為使菠蘿苗適應(yīng)空氣濕度、溫度等外界條件，共進(jìn)行煉苗5～6 d，放入1000倍的多菌靈溶液中，浸泡2 h左右。選擇椰糠:河砂:表土的比例為5:3:2的移栽基質(zhì)，30 d后統(tǒng)計移栽成活率高達(dá)99.3%以上。楊冬業(yè)等[21]采用泥炭:椰糠:珍珠巖:黃泥為 4:1:1:2的營養(yǎng)土比例，移栽成活率可達(dá)90%以上。

8 結(jié)語

國內(nèi)外開展了許多菠蘿離體再生體系技術(shù)的探索，主要集中于直接不定芽發(fā)生途徑、間接不定芽發(fā)生途徑、體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑等。相對而言，菠蘿直接不定芽再生途徑研究較多，再生體系較完善；間接不定芽發(fā)生遺傳穩(wěn)定性較差，可能因為誘導(dǎo)愈傷過程中 DNA甲基化容易導(dǎo)致體細(xì)胞克隆變異[57—58]的緣故。體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑的研究相對較少，再生體系很不成熟。

菠蘿離體再生研究的困難在于不同品種植株離體再生體系的差異性較大，再生體系適用范圍小，可嘗試不同種類基本培養(yǎng)基與激素配比，建立普適性再生體系；再生植株同源性較高[59]，離體再生技術(shù)與外源基因轉(zhuǎn)化整合研究較少，應(yīng)著重創(chuàng)建抗旱性、耐寒性等抗逆性強(qiáng)的新品種，從而實現(xiàn)熱帶植物北移，擴(kuò)大菠蘿的適生范圍。

本文對國內(nèi)外菠蘿離體再生體系的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述，討論了目前菠蘿離體再生存在的問題，以期為菠蘿的遺傳轉(zhuǎn)化和基因編輯提供技術(shù)參考。