于曉偉

(赤峰學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000)

苦菜(Sonchus Oleraceus L)，屬于菊科植物[1]，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，含有豐富的蛋白質(zhì)、糖、食物纖維、鈣、鐵、錳等礦物元素。目前關(guān)于苦菜的研究主要集中在苦菜的成分分析、分類鑒定、生物活性作用等方面[2-5]，但是，目前關(guān)于苦菜中葉綠素提取的研究卻鮮有報(bào)道。在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，葉綠素起著非常重要的作用，也是植物進(jìn)行光合作用的主要色素之一[6,7]。目前，關(guān)于葉綠素提取方法的研究報(bào)道很多，何思宇[8]等通過(guò)溶液浸提法對(duì)菠菜中的葉綠素提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，葉綠素提取含量可以達(dá)到1.89mg·g-1，并進(jìn)行了酪蛋白分散體系的研究，取得了一定的效果；王鳳婷等[9]以小白菜、菠菜和生菜為試驗(yàn)材料，研究了改進(jìn)的研磨法在葉綠素提取試驗(yàn)中的應(yīng)用，研究結(jié)果表明，該方法用時(shí)短、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單，同時(shí)可以應(yīng)用于不同植物；盛璐等[10]研究不同處理提取液對(duì)鐵線蓮“親愛的”葉綠素含量測(cè)定的影響，結(jié)果表明，不同提取劑配比對(duì)葉綠素含量的提取及穩(wěn)定性的影響有著明顯的差異；甘勇輝[11]等研究了不同提取液提取金線蓮中葉片葉綠素效果，結(jié)果表明，金線蓮葉綠素含量測(cè)定提取液為丙酮-乙醇混合液或80%丙酮時(shí)提取效果最好；劉穎等[12]研究了超聲波輔助混合溶劑提取黃花菜葉綠素的最佳條件，研究結(jié)果表明，使用超聲波輔助混合溶劑方法后葉綠素的提取含量明顯升高，反應(yīng)時(shí)間更短。本試驗(yàn)采用超聲波輔助不同溶劑法對(duì)赤峰地區(qū)苦菜中葉綠素的提取進(jìn)行研究，通過(guò)浸提效果確定最佳工藝條件。

1 試驗(yàn)材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試材為新鮮苦菜葉，采摘于內(nèi)蒙古赤峰市松山區(qū)當(dāng)鋪地滿族鄉(xiāng)，葉片要求完整，顏色鮮艷，消掉泥土，瀝干水分后，置于40℃干燥箱中烘干，研磨，通過(guò)100目篩子篩選后備用。

1.2 試劑與儀器

無(wú)水乙醇，分析純(天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司)；丙酮，分析純(天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司)；試驗(yàn)用水均為去離子水，采購(gòu)獲得。

1.2.2 儀器

電子天平(Secura612-1CN，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司生產(chǎn))；高速離心機(jī)(DD-5M，湖南滬康離心機(jī)有限公司生產(chǎn))；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HHS，江蘇省金壇市金祥龍電子有限公司生產(chǎn))；紫外可見分光光度計(jì)(TU-1810，PC型，北京普析通用生產(chǎn))；超聲波清洗機(jī)(SB-5200DTN，寧波新芝生物科技股份有限公司生產(chǎn))。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 苦菜中葉綠素的提取與測(cè)定

用電子天平準(zhǔn)確稱量苦菜樣品(0.5g)于具塞試管中，加入一定量體積的乙醇或丙酮試劑，具塞試管用錫紙包裹避免光線照射，在一定提取溫度和一定時(shí)間的超聲波(超聲功率250W)處理下，待溫度降低到室溫后，用高速離心機(jī)離心處理5min(2500r·min-1，20℃)，取一定量的離心溶液，放入石英試管中，以乙醇溶劑作為空白對(duì)照，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)為645nm和663nm下的吸光值并記錄。根據(jù)Arnon公式[13]，算出葉綠素a、葉綠素b和葉綠素的總含量。Arnon公式具體如下。

葉綠素a含量Ca(mg·g-1)：

當(dāng)時(shí)，環(huán)形珠墊的編織方法是基于的周期運(yùn)動(dòng)，采用數(shù)學(xué)表達(dá)式的形式表示其周期運(yùn)動(dòng)的規(guī)律，下行線的運(yùn)動(dòng)表示為，上行線的運(yùn)動(dòng)表示為，即

Ca=[(12.71×OD663-2.59×OD645)×V]/1000×W

葉綠素b含量Cb(mg·g-1):

Cb=[(22.9OD645-4.67×OD663)×V]/1000×W

葉綠素提取量C(a+b)(mg·g-1):

C(a+b)=Ca+Cb

式中，OD645表示波長(zhǎng)為645nm下的吸光度值；OD663表示波長(zhǎng)為663nm下的吸光度值；V表示提取液的體積，mL；W表示苦菜質(zhì)量，g。

1.3.2 單因素分析實(shí)驗(yàn)

分別以乙醇和丙酮為提取劑，設(shè)計(jì)不同的液料比(mL·g-1)，提取時(shí)間、提取溫度和超聲波超聲時(shí)間為單因素變量，測(cè)量苦菜中葉綠素的含量。具體設(shè)計(jì)：當(dāng)液料比為30∶1，提取時(shí)間為20min，超聲波(超聲功率250W)10min時(shí)，改變提取溫度分別為20℃、30℃、40℃、50℃、60℃；當(dāng)提取溫度為50℃，液料比為30∶1，超聲波(超聲功率250W)10min時(shí)，改變提取時(shí)間分別為10min、20min、30min、40min、50min；當(dāng)提取溫度為50℃，提取時(shí)間為20min，超聲波(超聲功率250W)10min時(shí)，改變液料比分別為20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1；當(dāng)提取溫度為50℃，液料比為30∶1，提取時(shí)間為20min，改變超聲波(超聲功率250W)，時(shí)間分別為10min、20min、30min、40min。比較提取溫度、提取時(shí)間、液料比和超聲時(shí)間對(duì)苦菜中葉綠素提取含量的影響。

1.3.3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素分析試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以提取溫度(A)、提取時(shí)間(B)、液料比(C)、超聲時(shí)間(D)為自變量，苦菜中葉綠素提取量(Y)為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)法對(duì)苦菜中葉綠素的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及因素水平見表1。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel和Design Expert 11軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，建立方程模型和作圖。每次試驗(yàn)處理均重復(fù)3次，取其平均值。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取溫度對(duì)苦菜中葉綠素提取含量的影響

圖1 提取溫度對(duì)葉綠素提取含量的影響

由圖1可知，當(dāng)分別以乙醇和丙酮作為提取劑時(shí)，在液料比為30∶1，提取時(shí)間為20min，超聲波(超聲功率250W)10min時(shí)，分別改變不同提取溫度，隨著溫度的不斷升高，葉綠素的提取含量不斷增大，當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到50℃時(shí)，兩者的葉綠素提取量均達(dá)到的最大值，此時(shí)繼續(xù)提高反應(yīng)溫度，葉綠素的提取含量明顯下降。相對(duì)于以乙醇作為提取劑，丙酮作為提取劑時(shí)的葉綠素提取含量在各個(gè)溫度下均低于乙醇，乙醇的提取效果更好。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)苦菜中葉綠素提取含量的影響

圖2 提取時(shí)間對(duì)葉綠素提取含量的影響

由圖2可知，分別以乙醇和丙酮作為提取劑時(shí)，當(dāng)提取溫度為50℃，液料比為30∶1，超聲波(超聲功率250W)10min時(shí)，改變提取時(shí)間，發(fā)現(xiàn)隨著提取時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，以乙醇為提取劑的葉綠素的提取量在20～40min的過(guò)程中出現(xiàn)一個(gè)陡增的過(guò)程，葉綠素含量明顯提高，當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)40min時(shí)，提取量有下降的趨勢(shì)；以丙酮為提取劑的葉綠素的整體提取量變化不明顯，提取含量明顯少于以乙醇作為提取劑，提取效果不明顯。

2.1.3 液料比對(duì)苦菜中葉綠素提取含量的影響

圖3 液料比對(duì)葉綠素提取含量的影響

由圖3可知，分別以乙醇和丙酮作為提取劑時(shí)，當(dāng)提取溫度為50℃，提取時(shí)間為20min，超聲波(超聲功率250W)10min時(shí)，在不同液料比的條件下，以乙醇作為提取劑的葉綠素的含量在液料比為30∶1時(shí)，達(dá)到最大值，繼續(xù)增大液料比對(duì)葉綠素提取量的影響不大；以丙酮作為提取劑的葉綠素的含量同樣在30∶1時(shí)，達(dá)到峰值，繼續(xù)增大液料比對(duì)葉綠素提取量的影響不大。且當(dāng)液料比大于40∶1時(shí)，以丙酮作為提取劑的葉綠素的提取量要好于以乙醇作為提取劑的提取效果。

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)苦菜中葉綠素提取含量的影響

圖4 超聲時(shí)間對(duì)葉綠素提取含量的影響

由圖4可知，分別以乙醇和丙酮作為提取劑時(shí)，當(dāng)提取溫度為50℃，液料比為30∶1，提取時(shí)間為20min，改變超聲波(超聲功率250W)的時(shí)間。當(dāng)以乙醇作為提取劑時(shí)，當(dāng)超聲(超聲功率250W)時(shí)間為20min時(shí)，葉綠素的提取含量達(dá)到最大值，繼續(xù)延長(zhǎng)超聲時(shí)間對(duì)葉綠的提取量的影響不大；當(dāng)以丙酮作為提取劑時(shí)，當(dāng)超聲(超聲功率250W)時(shí)間為20min時(shí)，葉綠素的提取含量達(dá)到最大值，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，葉綠素的提取量有一定的降低。以乙醇作為提取劑的葉綠素的提取量的最大值要高于以丙酮作為提取劑的葉綠素提取量。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及結(jié)果

利用Design Expert 11 軟件里的Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，其響應(yīng)值及方差分析結(jié)果見表2。對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到葉綠素提取量(Y)和編碼自變量A、B、C、D的回歸方程：Y=0.7280+0.0042A+0.0525B+0.0183C+0.0133D-0.06AB+0.005AC-0.0125AD-0.005BC-0.0025BD-0.05CD+0.0477A2-0.1377B2-0.0415C2-0.34D2。

由響應(yīng)面方差分析表可知，見表3，該方程模型極顯著(p<0.05)，說(shuō)明所得方程擬合較好，回歸顯著。方程程模型的校正相關(guān)系數(shù)R2=0.8006，校正絕對(duì)系數(shù)R2Adj=0.613，說(shuō)明試驗(yàn)因素A、B、C、D對(duì)葉綠素提取量影響顯著。其中，B2的P值<0.0001，說(shuō)明對(duì)葉綠素提取量影響極顯著。根據(jù)回歸方程中各項(xiàng)系數(shù)的絕對(duì)值表示各因素對(duì)響應(yīng)值影響的大小、正負(fù)表示對(duì)響應(yīng)值影響的方向的原理[14]，得到影響苦菜中葉綠素提取率的因素大小依次為提取時(shí)間(B)>液料比(C)>超聲時(shí)間(D)>反應(yīng)溫度(A)，其中提取時(shí)間對(duì)葉綠素提取量的影響可達(dá)極顯著水平。

2.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

響應(yīng)面優(yōu)化得苦菜中葉綠素提取工藝最佳條件為提取反應(yīng)溫度為40℃，提取反應(yīng)時(shí)間為40min，液料比為30∶1，超聲波(超聲功率250W)的時(shí)間為20min。通過(guò)優(yōu)化后的參數(shù)做3組平行試驗(yàn)，最終測(cè)得苦菜中葉綠素的提取量為0.81±0.03mg·g-1，證明該方程可靠、有效，可用于模擬苦菜中葉綠素的提取工藝。

3 結(jié)論

本文通過(guò)比較以乙醇和丙酮作為提取劑，研究了提取溫度、提取時(shí)間、液料比和超聲波(超聲功率250W)時(shí)間等因素對(duì)苦菜中葉綠素提取含量的影響，并通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化了苦菜中葉綠素的條件。最后得出結(jié)論：以乙醇作為提取劑提取葉綠素的效果明顯好于以丙酮作為提取劑；最佳反應(yīng)工藝條件為提取溫度為40℃，提取時(shí)間為40min，液料比為30∶1，超聲波(超聲功率250W)時(shí)間為20min。此結(jié)果為今后在苦菜中葉綠素提取提供了可行的參考方法。