趙允清 邵明珠 郭家媚 葛 成 周云宵吳同壘 張志強 任 海 張召興，2* 張艷英*

(1.河北科技師范學(xué)院，河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室，秦皇島，066604；2.河北旅游職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系，承德，067000)

中華草龜(Chinemysreevesiis)又稱泥龜、烏龜?shù)?，在我國龜類中分布最廣、數(shù)量最多，具有生長快、抗病力強、出肉率高、味道鮮美且具有觀賞性等特點，養(yǎng)殖量逐年攀升[1]。維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)又名維羅納氣單胞菌、維隆氣單胞菌和凡隆氣單胞菌等，屬于弧菌科(Vibrionaceae)氣單胞菌屬成員，其中維羅納生物型和維氏氣單胞菌溫和生物型是維氏氣單胞菌的2個變種，可以引起水生動物、哺乳動物及人患胃腸炎、腦膜炎、腹瀉和菌血癥等疾病，是人—獸—魚共患病原菌[2-3]。維氏氣單胞菌是主要存在水系統(tǒng)中的一種條件致病菌，在正常水系統(tǒng)生態(tài)環(huán)境下不導(dǎo)致疾病，當環(huán)境中存在應(yīng)激因素時，如換料、轉(zhuǎn)群等，有些致病菌株可以引起龜、蟹、魚、蝦及大魷等水產(chǎn)動物發(fā)病，死亡率最高可達到100%，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失[4-5]。維氏氣單胞菌攜帶腸毒素、氣溶素、溶血素、外膜蛋白和細胞毒性腸毒素等多種毒力基因，該菌致病與其攜帶的毒力基因表達具有一定相關(guān)性，且分離的致病菌株大多數(shù)攜帶腸毒素、溶血素和細胞游離性溶血素等毒力基因[6-7]。維氏氣單胞菌對臨床中常用的抗生素具有較高的耐藥性，出現(xiàn)多重耐藥性，耐藥性的產(chǎn)生與環(huán)境、溫度、用藥的頻率及攜帶耐藥基因等多方面有關(guān)[8]。

本研究從患病死亡的中華草龜體內(nèi)分離得到1株維氏氣單胞菌，命名為CRQ1，并檢測其致病性、毒力基因、耐藥性和耐藥基因，為進一步對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中維氏氣單胞菌的防控提供科學(xué)指導(dǎo)，降低養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟損失。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

患病瀕死的中華草龜來自河北科技師范學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)業(yè)中心中華草龜養(yǎng)殖基地；健康斑馬魚(Brachydaniorerio)來自河北省秦皇島市旺旺水族館。

1.2 細菌分離與培養(yǎng)

將瀕死的中華草龜無菌解剖，取肝組織、腸道等病料劃線接種于綿羊鮮血平板上，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)18～24 h后，挑選形態(tài)大小一致的優(yōu)勢菌落接種于RS瓊脂培養(yǎng)基進一步鑒定培養(yǎng)，獲得純化后的菌株進行革蘭氏染色，分離菌株命名為CRQ1。

1.3 分離菌的生化試驗鑒定

按照說明書，將純化培養(yǎng)的分離菌調(diào)整菌液濃度為OD600≈0.4時，接種于ID32E生化鑒定試條中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，利用ATB自動化微生物生化鑒定系統(tǒng)進行生化特性鑒定。

1.4 分離菌的16S rRNA鑒定

用提取試劑盒提取分離菌株的基因組DNA為模板，以細菌通用16S rRNA基因序列(5′-CCGTCTTCAGTTCCAGTGTG-3′/5′-GTGGCGGACGGGTGAGTAA-3′)為引物，PCR擴增出大小約為1 500 bp的目的片段。回收基因片段與pMD-18T載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒由生工生物工程(上海)股份有限公司測序，利用BLAST軟件將測序結(jié)果與GenBank中登錄的16S rRNA序列進行同源性比對，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.5 分離菌的致病性試驗

將分離純化培養(yǎng)的菌液培養(yǎng)至對數(shù)期(OD600=0.8)時，滴板計數(shù)，調(diào)整菌液濃度。將100尾健康斑馬魚隨機挑選大小一致的分為7組，每組10尾進行試驗。1～6組每尾注射菌液20 μL，濃度分別為1.0×103、1.0×104、1.0×105、1.0×106、1.0×107、1.0×108cfu/mL，第7組為對照組，注射等量的PBS，感染12 h后，觀察15 d，記錄每組發(fā)病情況及死亡情況，利用改良寇氏法計算分離菌株感染健康斑馬魚的半數(shù)致死量( LD50)。

1.6 毒力基因檢測

參照文獻[6-7]，設(shè)計維氏氣單胞菌act、aha、Exu、aerA、LuxS、Lip、Hly、ompA和Ser9種毒力基因引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，以提取分離株CRQ1的基因組DNA為模板。PCR擴增相關(guān)毒力基因，回收PCR產(chǎn)物測序，測序結(jié)果與GenBank中登錄的毒力基因序列進行同源性比對(BLAST軟件)。

1.7 藥敏試驗

參考文獻[9]，采用美國臨床實驗室標準機構(gòu)(CLSI)推薦的K-B紙片擴散法對分離純化的細菌進行10種藥物的敏感性試驗。

1.8 耐藥基因的檢測

參照文獻[10-11]，四環(huán)素類耐藥基因tet(A)、tet(C)、tet(D)、tet(E)、tet(G)，氟喹諾酮類耐藥基因qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qepA、oqxA、oqxB、gyrA、gyrB、parC、parE，氨基糖苷類耐藥基因aadA1、aadA2、StrA、aac(6)-Ib、aadB、aac2、aac4、aadD、npmA、ant-Ia、aac(3)-Ia，磺胺類耐藥基因sul-1、sul-3，大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因ermB、mefA、ermA，5類耐藥基因引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，利用已提取的細菌基因組DNA為模板，進行PCR擴增，回收PCR產(chǎn)物測序，測序結(jié)果與GenBank中登錄序列進行同源性比對(BLAST軟件)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離培養(yǎng)與鑒定

從中華草龜病變肝臟組織中，分離純化到1株單一病原菌，命名為CRQ1。CRQ1株在7%脫纖兔血培養(yǎng)基長出邊緣整齊、光滑的圓形菌落，形成透明的溶血環(huán)，呈現(xiàn)β溶血；在RS瓊脂培養(yǎng)基長出圓形、邊緣整齊、透明的淡黃色菌落。染色鏡檢為陰性菌，可見單個或者成對排列，略微彎曲短桿狀菌。CRQ1菌株經(jīng)ATB自動化微生物生化鑒定系統(tǒng)鑒定為維氏氣單胞菌，其生化特征與維氏氣單胞菌一致(表1)。CRQ1菌株經(jīng)過培養(yǎng)特性、形態(tài)學(xué)及生化鑒定，初步鑒定為維氏氣單胞菌。

表1 分離菌株的生化檢測結(jié)果

2.2 分離菌16S rRNA鑒定

用提取試劑盒提取分離菌株的基因組DNA為模板，以細菌通用16S rRNA基因序列為引物，從分離菌CRQ1中擴增出大約為1 492 bp的PCR目的基因條帶(圖1)。16S rRNA基因的同源性分析結(jié)果顯示，CRQ1菌株與GenBank中登錄的10株維氏氣單胞菌參考株基因序列同源性為97.9%～99.4%，16S rRNA系統(tǒng)進化樹(圖2)可見CRQ1分離菌與GeneBank登錄的CP050012.1株聚為同一支，表明CRQ1分離菌為維氏氣單胞菌。

圖1 分離菌株16S rRNA鑒定結(jié)果Fig.1 Results of isolated strains of PCR amplification 注：M.DL2000 DNA Marker；1.菌株 Note：M，DL2000 DNA Marker.1，Isolates strain

圖2 分離菌株的16S rRNA系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of 16S rRNA of isolated strains

2.3 分離菌的致病性

將分離菌CRQ1培養(yǎng)液分別經(jīng)腹腔注射感染斑馬魚，24 h后出現(xiàn)死亡，直到感染后的第10天，死亡率100%，對照組試驗斑馬魚無明顯的癥狀，在死亡實驗斑馬魚的內(nèi)臟中分離到維氏氣單胞菌。利用改良寇氏法計算分離株CRQ1的 LD50為3.57×107cfu/mL，表明從病死中華草龜肝臟中分離的維氏氣單胞菌具有很強的致病性。

2.4 分離菌的毒力基因

用PCR方法對維氏氣單胞菌毒力基因進行檢測，結(jié)果顯示，CRQ1株同時攜帶aerA、Hly、ompA、aha、Ser、LuxS、Exu、Lip和act9種毒力基因(圖3)，毒力基因的測序結(jié)果與GenBank中登錄的維氏氣單胞菌參考株基因序列同源性均大于97.0%，表明分離維氏氣單胞菌攜帶多種毒力基因。

圖3 分離菌株毒力基因檢測結(jié)果Fig.3 Results of virulence gene detection of isolated strains 注(Note)：M.DL2000 DNA Marker；1～9.aerA，Hly，ompA，aha，Ser，LuxS，Exu，Lip，act

2.5 分離菌的藥敏特性

采用K-B法測定CRQ1菌株對18種抗菌藥物的耐藥性。結(jié)果顯示，CRQ1菌株對頭孢曲松、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、多西環(huán)素、土霉素、林可霉素和替米考星9種藥物高度敏感；對阿米卡星、鏈霉素、磺胺間甲氧嘧啶、青霉素、氨芐西林、氟苯尼考、卡那霉素及阿莫西林8種藥物中度敏感；對新斯的明耐藥(表2)，表明該菌對多種藥物較敏感，可以藥敏結(jié)果輪換用藥或穿梭用藥。

表2 分離菌藥敏試驗結(jié)果

2.6 分離菌耐藥基因的PCR檢測

用PCR方法檢測CRQ1株的四環(huán)素類、氟喹諾酮類、氨基糖苷類、磺胺類和大環(huán)內(nèi)酯類5類藥物的耐藥基因。結(jié)果顯示，CRQ1株攜帶四環(huán)素類耐藥基因tet(A)、tet(E)，氟喹諾酮類耐藥基因oqxA、gyrA、gyrB、parC、parE，氨基糖苷類耐藥基因aac2、aac(6)-Ib、aadB、aac4，磺胺類耐藥基因sul-1，大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因ermB(圖4)，由此可見，耐藥基因型與耐藥表型存在一定差異，說明分離株攜帶相關(guān)耐藥基因還未表達出來，需要輪回用藥和穿梭用藥。測序結(jié)果與GenBank中登錄的維氏氣單胞菌參考株基因序列同源性均大于97.0%，表明CRQ1株攜帶多種耐藥基因。

圖4 分離菌株耐藥基因檢測結(jié)果Fig.4 Results of drug resistance gene detection of isolated strains 注(Note)：M.DL2000 DNA Marker；1～33.tet(A)，tet(C)，tet(D)，tet(E)，tet(G)，qnrA，qnrB，qnrC，qnrD，qnrS，qepA，oqxA，oqxB，gyrA，gyrB，parC，parE，aadA1，aadA2，StrA，aac2，aac4，aadB，aadD，npmA，ant-Ia，aac(3)-Ia，aac(6)-Ib，sul-1，sul-3，ermB，mefA，ermA

3 討論

維氏氣單胞菌廣泛存在大自然的水體和土壤中，可以分為致病型和非致病型菌株，致病型菌株可以引起魚、蝦、龜?shù)榷喾N水生生物的潰瘍、出血、腹水及敗血癥等，感染率和死亡率均較高，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成較大經(jīng)濟損失[12-13]。該菌還可以引起人腹瀉、患腦膜炎和敗血癥等，是臨床中人—獸—魚共患病原菌。近幾年關(guān)于龜源的致病型維氏氣單胞菌的報道逐漸增多。方振華等[12]從發(fā)病死亡的中華條頸龜(Mauremyssinensis)體內(nèi)分離得到致病型維氏氣單胞菌。何成偉等[14]從患病黃喉擬水龜(M.mutica)中分離到維氏氣單胞菌。本試驗從患病死亡的中華草龜分離得到致病型維氏氣單胞菌，國內(nèi)尚未見報道。維氏氣單胞菌可能對龜類等水生動物的養(yǎng)殖存在潛在威脅，應(yīng)該注重該病防控。

維氏氣單胞菌攜帶多種毒力基因，致病性與攜帶多種毒力基因的表達有關(guān)，同時毒力基因的種類與數(shù)量對致病具有一定相關(guān)性，不同種類的毒力基因與致病性之間具有一定的差異性，毒力基因在致病過程中起著不可忽視的作用[15]。aerA是維氏氣單胞菌的重要毒力基因，具有細胞毒性、溶血性和腸毒素毒性特性，可以導(dǎo)致全身臟器的廣泛性出血；Lip主要參與宿主細胞膜的變化；Ser、Lip和aha參與氣單胞菌黏附、整合；LuxS參與細菌生物膜的形成，加強細菌的感染力[6-7]。本研究從中華草龜體內(nèi)分離的致病型維氏氣單胞菌株，攜帶aerA、act、aha、Ser、Exu、Lip、Hly、ompA和LuxS9種毒力基因，說明攜帶毒力基因與致病性具有相關(guān)性，與任燕等[4]研究的草魚源維氏氣單胞菌致病性與攜帶毒力基因相關(guān)一致。中華草龜體內(nèi)分離的致病型維氏氣單胞菌攜帶多種基因，說明致病機制復(fù)雜，這些毒力基因可能具有協(xié)同致病作用。

臨床中主要用抗生素對維氏氣單胞菌進行防治，由于使用不合理，常用的抗生素會產(chǎn)生很強的耐藥性。本研究表明，CRQ1株對常用的藥物敏感，耐藥性較低，與方振華等[12]、何成偉等[14]、Prediger等[16]研究的維氏氣單胞菌的耐藥性存在差異性，這可能與菌株及藥物使用有關(guān)。經(jīng)耐藥基因檢測結(jié)果表明，CRQ1株攜帶多種耐藥基因，但是對臨床中常用藥物沒有產(chǎn)生很強的耐藥性，可能是耐藥基因沒有表達所致，耐藥基因與耐藥性的關(guān)聯(lián)需要進一步研究。