杜業(yè)剛，劉奕雄，王韋達，朱雨田，鄭燕燕

（深圳市計量質(zhì)量檢測研究院，國家營養(yǎng)食品質(zhì)量檢驗檢測中心（廣東），廣東 深圳 518102）

引言

天然皮革，一般是以動物生皮為主要原料，經(jīng)脫毛脫脂、堿處理、酸水解、鞣制和染 色 等工序加工制成，其種類繁多，有哺乳動物類、爬行類、兩棲動物類皮革等，其中豬、牛、羊皮革是最 常 見 的三大皮種。天然皮革制品的優(yōu)良性能深受廣大消費者的鐘愛，在箱包、衣服、鞋具、手套、家居等產(chǎn)品中應(yīng)用廣泛，市場需求量巨大，全球每年貿(mào)易額超過 1000 億美元。隨著加工工藝水平的提高，使得市場上以假亂真、以次充好，以人造革冒充天然皮革，以低價種類皮革冒充高價種類皮革等現(xiàn)象屢見不鮮。因此，鑒定皮革的物種屬性一直以來都是皮革和紡織業(yè)研究和關(guān)注的重點方向之一[1-2]。目前鑒定皮革種類的方法主要有傳統(tǒng)感官法、紅外光譜法、聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）法和質(zhì)譜法。感官經(jīng)驗法[3-4]主要是借助放大鏡或顯微鏡等輔助設(shè)備，依靠眼看手摸，通過對皮質(zhì)的毛孔、紋理、手感等進行綜合性評價分析來進行辨別。該法主觀性強，經(jīng)驗要求高，而且先進的加工水平使得通過傳統(tǒng)感官法難以應(yīng)對。紅外光譜法[5-7]將皮革表面的涂飾層去除后，根據(jù)不同種類的皮革在紅外區(qū)特征吸收的指紋圖譜中細微差別來進行甄別。紅外光譜法能有效區(qū)分人造革和天然皮革，但是天然皮革之間的紅外光譜吸收有交叉，因此紅外光譜法較難區(qū)分天然皮革的動物種類。分子生物學(xué)手段[8-10]是先提取皮革中動物物種的 DNA，然后采用PCR 技術(shù)對特征 DNA 進行擴增來判斷其物種屬性，方法靈敏度高，特異性強。但是皮革在鞣制加工過程中的酸堿處理會降解 DNA，鞣劑使 DNA 與蛋白質(zhì)交聯(lián)增加了分離難度，重金屬對酶的影響會抑制 PCR 擴增，這些問題都限制了 PCR 方法的應(yīng)用。質(zhì)譜技術(shù)在物種屬性鑒別領(lǐng)域的應(yīng)用是近年來的研究熱點[11-15]。動物皮革富含膠原蛋白，經(jīng)胰蛋白酶酶解后，利用質(zhì)譜篩選出物種膠原蛋白特征肽段，基于不同物種熱穩(wěn)定性好的特征肽段，通過 UPLC-MS/MS 法能成功鑒定經(jīng)過加熱等處理過的動物物種屬性。本研究根據(jù)篩選出豬皮、牛皮和羊皮的特征肽段，建立了鑒別皮革動物屬性的多離子反應(yīng)監(jiān)測（MRM）UPLC-MS/MS 方法。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Acquity UPLC 液相系統(tǒng) （美國 Waters 公司）；QTRAP 5500 三重四極桿 - 線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜儀（美國 SCIEX 公司）；Heraeus Fresco 21 型冷凍離心機（美國 Thermo Fisher Scientific 公司）；3-30K 型高速冷凍離心機 （德國 Eppendorf 公司）；DKZ-2 型電熱恒溫震蕩水槽 （上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；HV-110 型自動高壓滅菌器（日本 Hirayama 公司）；BC-1000 渦旋振蕩器 （深圳逗點生物技術(shù)有限公司）；CAP224S 型萬分位分析天平（德國 Sartorius 公司）；1.5 mL 低蛋白吸附離心管 （德國 Eppendorf 公司）；10000MWCO HY 超濾離心管（德國 Sartorius 公司）；ABI 7500 實時熒光 PCR 儀 （新加坡 Life Technologies）。

碳酸氫銨（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；測序級修飾胰蛋白酶（porcine，美國 Promega 公司）；乙 腈（色 譜 純 ，德 國 Merck 公 司）；甲 酸（質(zhì) 譜純，美國 Thermo Fisher 公司）；實驗用水均為一級水；蛋白酶 K、Taq 酶及 2×premix Extaq 酶（寶生物工程（大連）有限公司）；引物及探針（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）。

1.2 UPLC-MS/MS 法條件

1.2.1 樣品前處理

皮革樣品剪成約 2 mm×2 mm 塊狀大小，備用。稱取 1 g 樣品于具塞玻璃管中，加入 4 mL 水，于高壓滅菌器中處理 15 min（0.1 MPa，121 ℃），冷卻至室溫。將提取液移至離心管中，12 000 r/min 離心 15 min。移取上清液 200 μL 至蛋白超濾管中，14 000 r/min 離心 30 min。加入 100 μL 碳酸氫銨溶液（50 mmol/L）至蛋白超濾管，14 000 r/min 離心 30 min，棄去濾液，重復(fù)上述操作 2 次。更換接收杯，再加入100 μL 碳酸氫銨溶液（50 mmol/L）至蛋白超濾管上，并加入 20 μg/100 μL 的胰蛋白酶 10 μL 混勻，置于37 ℃水浴鍋中酶解 16 h。將蛋白超濾管于 14 000 r/min 離心 35 min，收集濾液，待測。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18 （2.1 mm×100 mm，1.8 μm），柱溫：35 ℃，進樣量 4 μL，流動相 A為 0.1%甲酸水，B 為乙腈，流速 0.300 mL/min，梯度洗脫程序：0～5 min，5%～15% B；5～6 min，15%～85%B；6～8 min，85% B；(8～9) min，85%～5%B；9～12 min，5% B。

1.2.3 質(zhì)譜條件

多反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM），電噴霧正離子模式掃描（ESI+），噴霧電壓為 5500 V，離子源溫度 550 ℃，氣簾氣 40 psi，霧化氣 55 psi，輔助氣 55 psi，離子對相關(guān)信息見表 1。

表1 特征肽段的 MRM 相關(guān)參數(shù)信息Tab. 1 MRM parameters of peptide markers

1.3 感官鑒定法

感官鑒定法采用現(xiàn) 有 廣 東省 地 方 標準 方 法：DB44/T 1358-2014《天然皮革材質(zhì)鑒別方法》。

1.4 PCR法

PCR 檢測方法采用賴心田等[9]研制的熒光 PCR法。

2 結(jié)果與討論

2.1 物種特征肽段的篩選

本研究中豬牛羊皮特征肽段的篩選方法與本課題組在之前發(fā)表的論文[16]中保持一致，所篩選出的特征肽段都經(jīng) Blast 分析確認，并進行了特異性驗證，且實驗證明所選取的肽段耐高溫高壓，在酸堿等嚴苛環(huán)境條件下仍能穩(wěn)定存在，適用于天然皮革動物源屬性的鑒定，具體肽段信息見表 1。

2.2 方法應(yīng)用

利 用 建 立 的 豬 牛 羊 皮 革 特 征 肽 段 的 UPLC-MS/MS 法對 26 批次皮革樣品進行了檢測，包括 7 批次標識羊成分皮樣，17 批次標識牛成分皮樣和 2 批次標識豬成分皮樣，并與感官鑒定法和 PCR方法的檢測結(jié)果進行了對比。

從表 2 的檢測結(jié)果可見，感官鑒定法僅對其中的 6 批次皮料樣品做出了有效鑒定，由于現(xiàn)代生產(chǎn)工藝水平的提高，以及感官法的局限，未能對其他樣品進行區(qū)分。PCR 法鑒定出了 7 批次樣品，與感官法檢測出的數(shù)量相當，其他樣品中未能有效提取出 DNA，不能得到 PCR 擴增結(jié)果，從而限制了方法的應(yīng)用。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法相比于感官鑒定法和 PCR 法則具有明顯的優(yōu)勢，能對所有26 批次樣品均進行有效的鑒定，不受皮革種類和工藝的影響，適用性更廣。感官鑒定法和 PCR 法的鑒定結(jié)果與樣品標識的成分一致，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測結(jié)果有 25 批次都與樣品標識成分保持相同，但發(fā)現(xiàn)有 1 批次標識為羊皮的半裙面料，實際只檢測到牛皮的特征肽段，并未檢測到羊皮的特征肽段（如圖 1 所示）。分析原因可能為標識錯誤，也有可能由于羊皮面料價格明顯高于牛皮面料，商家有意用廉價的牛皮來冒充高價的牛皮的疑似造假行為。而該批次問題樣品，用傳統(tǒng)的感官鑒定法和 PCR 法都未能有效地鑒別區(qū)分，說明本研究所開發(fā)的基于特征肽段的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法更先進，結(jié)果更準確可靠。

圖1 標識為羊皮的樣品中特征肽段 MRM 圖Fig.1 MRM chromatograms of peptide markers of a sample claimed to be sheep skin

表2 皮革樣品檢測結(jié)果匯總表Tab. 2 summary of leather test results

圖2 真實羊皮特征肽段提取離子流圖Fig.2 Extracted ion chromatograms of real sheep skin peptide marker

3 結(jié)論

應(yīng)用基于物種特征肽段建立的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜鑒別方法對皮革實際樣品進行了檢測，實驗表明該方法特異性強，準確可靠，重復(fù)性好，且不受生產(chǎn)工藝影響，能適用于市面上不同類型皮料物種屬性的鑒定，為解決當前天然皮革物種屬性難以鑒別的難題提供了新的技術(shù)手段，為市場監(jiān)管提供技術(shù)支撐，有助于打擊假冒偽劣皮革制品，促進行業(yè)健康有序發(fā)展，具有廣闊的推廣應(yīng)用前景。本研究僅選取了最為常見的豬牛羊皮做為研究對象，未來可以繼續(xù)擴大研究范圍，比如建立兔、狐貍、雪貂等皮毛的鑒定方法，本研究可以為進一步的研究提供參考。