馮徐根，韓軍，孫旸，孫敬，楊萌

（北京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院 國家紡織及皮革產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，北京 100025）

前言

N- 亞 硝 基胺類物質(zhì)被認為是最重要的化 學(xué)致癌物之一，N- 亞硝基胺可以通過呼吸道、消化道進入人體，也可以通過皮膚的吸收進入人體誘發(fā)癌癥[1-2]。近年來,隨著人民對該類物質(zhì)重視度的提高，國內(nèi)外對 N- 亞硝基胺殘留量的測定研究越來越多，集中在食品、水和各種日用橡膠制品，如橡膠密封材料、嬰兒奶嘴、橡膠玩具及橡膠手套等[3-7],橡膠制品中的 N- 亞硝基胺主要源于橡膠加工所用的仲胺類促進劑，硫化過程中形成仲胺, 再與硝基化試劑反應(yīng)生成 N- 亞硝基胺[8-9]。

我國國家標(biāo)準(zhǔn) GB/T24153-2009[10]也提供了橡膠中 N- 亞硝基胺類物質(zhì)的檢測方法。該標(biāo)準(zhǔn)使用氣質(zhì)聯(lián)用法測定 N- 亞硝基胺類物質(zhì)，但 N- 亞硝基-N- 甲基苯胺、N- 亞硝基 -N- 乙基苯胺和 N- 亞硝基二苯基胺具有熱不穩(wěn)定性，在進樣口高溫條件下會分解為 N- 甲基苯胺、N- 乙基苯胺和二苯胺，實際測定物質(zhì)為分解產(chǎn)物 N- 甲基苯胺、N- 乙基苯胺和二苯胺，而該 3 種分解產(chǎn)物同時也常作為橡膠生產(chǎn)助劑和促進劑廣泛應(yīng)用于橡膠生產(chǎn)中，可能會少量殘留于橡膠制品中，如果實際樣品中含有這 3種物質(zhì)，按照 GB/T24153-2009 的方法測試將會得到假陽性結(jié)果。

本研究建立了橡膠材料中 3 種 N- 亞硝基胺類物質(zhì)及 3 種假陽性物質(zhì)液相色譜儀和液質(zhì)聯(lián)用儀的鑒別方法，3 種 N- 亞硝基胺類物質(zhì)及 3 種假陽性物質(zhì)化學(xué)信息見表 1。

表1 3 種 N- 亞硝基胺類物質(zhì)及 3 種假陽性物質(zhì)化學(xué)信息Tab.1 Chemical information of 3 N-nitrosoamines and 3 false positive substances

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

儀器：氣質(zhì)聯(lián)用儀 Agilent 7890A-5975C（安捷倫科技有限公司）；液相色譜儀 Agilent 1260 Infinity（安 捷 倫 科 技 有 限 公 司）； 液 質(zhì) 聯(lián) 用 儀 Agilent 1200-641 0B（安捷倫科技 有 限公 司）；超聲 波發(fā) 生器JP-040（深 圳 市 潔 盟 清 洗 設(shè) 備 有 限 公 司）；旋 轉(zhuǎn) 蒸 發(fā)儀（瑞士步琦有限公司）。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、試劑、材料：N- 亞硝基 -N- 甲基苯胺（標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，99.5%，F(xiàn)irstStandard）；N- 亞硝基 -N-乙基苯胺（標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，98.4%，F(xiàn)irstStandard）；N- 亞硝基二苯基胺（標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，98.0%，F(xiàn)irstStandard）；N- 甲基苯胺（標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，98.9%，BePure）；N- 乙基苯胺（標(biāo)準(zhǔn) 物 質(zhì) ，99.2% ，BePure）； 二 苯 胺 （ 標(biāo) 準(zhǔn) 物 質(zhì) ，1000μg/mL，BePure）；甲醇（色譜純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；黑色橡膠（經(jīng)檢測不含 3 種 N- 亞硝基胺類物質(zhì)及 3 種假陽性物質(zhì)）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取 0.0250 g 的 N- 亞硝基 -N- 甲基苯胺、N- 亞硝基 -N- 乙基苯胺、N- 亞硝基二苯基胺、N- 甲基苯胺、N- 乙基苯胺，用色譜純甲醇定容至 25 mL，得到質(zhì)量濃度均為 1000 μg/mL 的單種標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，使用時用甲醇將標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液稀釋至所需濃度。

1.3 儀器分析條件

1.3.1 氣質(zhì)聯(lián)用儀 GC-MS

色譜柱：DB-5MS （30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度：140 ℃；質(zhì)譜接口溫度：280 ℃；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；載氣：氦氣，流速：1.0 mL/min；電離方式：EI 源；進樣方式：不分流進樣；升溫程序：38 ℃保持 2 min，以 20 ℃/min 升溫至 250 ℃，保持 2 min；質(zhì)量掃描范圍：50～200 amu。

1.3.2 液相色譜儀 HPLC

色譜柱：Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm×5 μm)流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣體積：15 μL；流動相 A：二級水，流動相 B：乙腈；梯度洗脫程序：0～8 min，50%A 等度洗脫；8～10 min，A 由 50%線性降至 40%，保持 5 min；二極管陣列檢測器，檢測波長：243 nm、270 nm、282 nm。

1.3.3 液質(zhì)聯(lián)用儀 LC-MS

色譜柱：ZORBAX XDB-C18(50 mm×2.1 mm×5 μm)流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣體積：10 μL；流動相 A：二級水，流動相 B：乙腈；梯度洗脫程序：0～4 min，A 由 80%線性降至 40%，保持 0.5 min；離子源：ESI；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多重反應(yīng)監(jiān) 測（MRM）；電 噴 霧 電 壓 ：4000 V；霧 化 器 壓 力 ：40 psi；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流速：11 L/min。

1.4 前處理

按照 GB/T24153-2009 標(biāo)準(zhǔn)中的前處理方法對樣品進行前處理，樣品萃取液轉(zhuǎn)移至棕色進樣瓶中，于 4 ℃條件下冷藏待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 氣質(zhì)聯(lián)用儀檢測結(jié)果

使用 GB/T24153-2009 標(biāo)準(zhǔn)中的氣質(zhì)聯(lián)用儀分析條件分析 3 種 N- 亞硝基胺類物質(zhì)及 3 種假陽性物質(zhì)色譜圖見圖 1，質(zhì)譜圖見圖 2～ 圖 4。

圖1 3 種 N- 亞硝基胺類物質(zhì)及 3 種假陽性物質(zhì)GC-MS 色譜圖Fig.1 GC-MS Chromatogram of 3 N-nitrosamines and 3 false positive substances

圖2 N- 亞硝基 -N- 甲基苯胺、N- 甲基苯胺 GC-MS 質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectrum of N-nitroso-N-methylaniline and Nmethylaniline with GC-MS

圖3 N- 亞硝基 -N- 乙基苯胺、N- 乙基苯胺 GC-MS質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectrum of N-nitroso-N-ethylaniline and Nethylaniline with GC-MS

由圖 1～ 圖 4 可知，3 種 N- 亞硝基胺類物質(zhì)與其對應(yīng)的 3 種假陽性物質(zhì)在保留時間、特征離子和特 征 離 子 豐 度 比 上 均一 致 ， 結(jié) 果 表 明 ： 采 用GB/T24153-2009 標(biāo)準(zhǔn)中的儀器分析條件，無法分辨3 種 N- 亞硝基胺類物質(zhì)及 3 種假陽性物質(zhì)。

圖4 N- 亞硝基二苯基苯胺、二苯胺 GC-MS 質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectrum of N-nitrosodiphenylaniline and diphenylamine with GC-MS

2.2 假陽性原因分析

N- 亞硝基 -N- 甲基苯胺、N- 亞硝基 -N- 乙基苯胺和 N- 亞硝基二苯基胺具有熱不穩(wěn)定性，高溫條件下容易分解，在進樣口的高溫條件下，N- 亞硝基 -N- 甲基苯胺、N- 亞硝基 -N- 乙基苯胺和N- 亞硝基二苯基胺會分解成 N- 甲基苯胺、N- 乙基苯胺和二苯胺，同時還會生成副產(chǎn)物 N- 甲基羥乙基苯胺、2,3,3- 三甲基 -1- 苯基氮雜環(huán)丁烷和 N-乙 基 羥 乙 基 苯 胺 。 所 以 使 用 氣 質(zhì) 聯(lián) 用 儀 采 用GB/T24153-2009 標(biāo)準(zhǔn)中儀器條件分析 N- 亞硝基-N- 甲基苯胺、N- 亞硝基 -N- 乙基苯胺和 N- 亞硝基二苯基胺時，實際測定的是其分解產(chǎn)物 N- 甲基苯胺、N- 乙基苯胺和二苯胺。N- 甲基苯胺、N- 乙基苯胺和二苯胺作為橡膠生產(chǎn)助劑和促進劑廣泛應(yīng)用于橡膠生產(chǎn)中，可能會少量殘留于橡膠產(chǎn)品中 ， 如 果 實 際 樣 品 中 含 有 這 3 種 物 質(zhì) ， 按 照GB/T24153-2009 的測試方法將會得到假陽性的結(jié)果。所以需降低進樣口溫度防止物質(zhì)分解或采用其他分析方法來分辨 3 種 N- 亞硝基胺類物質(zhì)及 3 種假陽性物質(zhì)。

2.3 氣質(zhì)聯(lián)用法鑒別方法的確定

陶進熊等人研究了氣質(zhì)聯(lián)用儀進樣口溫度對N- 亞硝基 -N- 甲基苯胺和 N- 亞硝基 -N- 乙基苯胺的影響[11]，但并未研究 N- 亞硝基二苯基胺在進樣口高溫條件下的分解情況，所以基于上述研究結(jié)果，進樣口溫度分別選擇 100、140 和 180 ℃，比較不同進樣口溫度對 N- 亞硝基二苯基胺結(jié)果的影響，結(jié)果見圖 5。

結(jié)合圖 5 及物質(zhì)對應(yīng)的質(zhì)譜圖可知，進樣口溫度為 100 ℃時，N- 亞硝基二苯基胺已經(jīng)分解為二苯胺，過低的進樣口溫度還會影響樣品溶液的氣化效果，結(jié)果表明：氣質(zhì)聯(lián)用法目前不適應(yīng)于 N- 亞硝基二苯基胺的檢測。文獻[12]顯示，N- 亞硝基二苯基胺熱穩(wěn)定性不好，通常采用測定其分解產(chǎn)物二苯胺對 N- 亞硝基二苯基胺進行定量。但二苯胺也可作為防老劑應(yīng)用于橡膠生產(chǎn)中[13]，勢必會在檢測中有假陽性的情況發(fā)生，所以還應(yīng)結(jié)合使用其他分析手段鑒別 N- 亞硝基二苯基胺和二苯胺。

圖5 不同進樣口溫度下 N- 亞硝基二苯基胺的 GC-MS色譜圖Fig.5 GC-MS Chromatograms of N-nitrosodiphenylamine at different inlet temperatures

使用優(yōu)化后的分析條件對 2 種 N- 亞硝基胺類物質(zhì)及 3 種假陽性物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進行分析，2 種 N-亞硝基胺類物質(zhì)及 3 種假陽性物質(zhì)色譜圖見圖 6，定量離子、定性離子及保留時間信息見表 2。

圖6 2 種 N- 亞硝基胺類物質(zhì)及 3 種假陽性物質(zhì) GC-MS色譜圖Fig.6 GC-MS Chromatograms of 2 N-nitrosamine substances and 3 false positive substances

表2 2 種 N- 亞硝基胺類物質(zhì)及 3 種假陽性物質(zhì)的 GC-MS 定性離子及定量離子Tab.2 Qualitative and quantitative ions of 2 N-nitrosoamines and 3 false positive substances with GC-MS

2.4 HPLC 鑒別方法的確定

2.4.1 色譜柱的選擇

試驗考察了 Eclipse XDB-C18 柱（250 mm×4.6 mm×5 μm） 和 Eclipse Plus-C18 柱 （250 mm×4.6 mm×5 μm）對 3 種 N- 亞硝基胺類物質(zhì)及 3 種假陽性物質(zhì)的保留和分離效果，發(fā)現(xiàn)在同等條件下，兩種色譜柱都可以實現(xiàn) 6 種物質(zhì)的分離，當(dāng)使用 Eclipse XDB-C18 柱時，6 種物質(zhì)的分離效果更好，所以本實驗選擇 Eclipse XDB-C18 柱。

2.4.2 流動相的選擇

為保證 3 種 N- 亞硝基胺類物質(zhì)及 3 種假陽性物質(zhì)間良好的色譜分離及響應(yīng)，分別考察了乙腈 -水流動相體系和甲醇 - 水流動相體系對 6 種物質(zhì)分離的影響。結(jié)果表明，在同等梯度條件下，乙腈 -水流動相體系比甲醇 - 水流動相體系的分離效果更好，峰形更加尖銳，保留時間更短，但色譜峰響應(yīng)基本一致，所以綜合考慮本實驗選擇乙腈 - 水流動相體系。

2.4.3 檢測波長的確定

使用二極管陣列檢測器對 3 種 N- 亞硝基胺類物質(zhì)及 3 種假陽性物質(zhì)進行光譜全掃描檢測，檢測結(jié)果表明：N- 亞硝基二苯基胺、N- 甲基苯胺和 N-乙基苯胺在 240～246 nm 有特征吸收，二苯胺在 282 nm 有特征吸收，而 N- 亞硝基 -N- 甲基苯胺和 N-亞硝基 -N- 乙基苯胺在 215 nm 和 270 nm 均有特征吸收，綜合考慮到越靠近遠紫外區(qū)，乙腈溶劑和雜質(zhì)吸收越強，會對目標(biāo)物造成干擾，所以確定 270 nm 作為 N- 亞硝基 -N- 甲基苯胺和 N- 亞硝基-N- 乙基苯胺的檢測波長，243 nm 作為 N- 亞硝基二苯基胺、N- 甲基苯胺和 N- 乙基苯胺的檢測波長，282 nm 作為二苯胺的檢測波長。

3 種 N- 亞硝基胺類物質(zhì)及 3 種假陽性物質(zhì)液相色譜圖見圖 7，由圖7 可知，該方法可以實現(xiàn) 6 種物質(zhì)的分離，6 種物質(zhì)在 243 nm、270 nm 和282 nm 下，可以得到較好的峰強度，檢測時長為18 min。

圖7 3 種 N- 亞硝基胺類物質(zhì)及 3 種假陽性物質(zhì)液相色譜圖Fig.7 Liquid chromatograms of 3 N-nitrosoamines and 3 false positive substances

2.5 液質(zhì)聯(lián)用法鑒別方法的確定

使用 ESI 源分別在正離子和負離子模式下對 3種 N- 亞硝基胺類物質(zhì)及 3 種假陽性物質(zhì)進行質(zhì)譜全掃描。結(jié)果表明：在 ESI 源正離子模式下，3 種 N-亞硝基胺類物質(zhì)及 3 種假陽性物質(zhì)質(zhì)譜響應(yīng)更強，因此電離方式選擇正離子模式。

在正離子模式下對 3 種 N- 亞硝基胺類物質(zhì)及3 種假陽性物質(zhì)進行全掃描，準(zhǔn)分子離子[M+H]-為最高響應(yīng)強度離子，將其選為母離子后使用選擇離子掃描模式優(yōu)化碎裂電壓。采用子離子掃描方式對二級質(zhì)譜進行分析，選擇豐度較強并且干擾較少的子離子分別作為定量離子和定性離子，進一步優(yōu)化碰撞能量，使各物質(zhì)的特征碎片離子強度達到最大，具體質(zhì)譜參數(shù)見表 ，使用多重反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）掃描 3 種 N- 亞硝基胺類物質(zhì)及 3 種假陽性物質(zhì)，MRM 色譜圖見圖 8，質(zhì)譜參數(shù)見表 3。

表3 3 種 N- 亞硝基胺類物質(zhì)及 3 種假陽性物質(zhì)的質(zhì)譜參數(shù)Tab.3 Mass spectrometric parameters of 3 N-nitrosamine substances and 3 false positive substances

圖8 3 種 N- 亞硝基胺類物質(zhì)及 3 種假陽性物質(zhì) MRM 色譜圖Fig.8 MRM chromatograms of 3 N-nitrosoamines and 3 false positive substances

2.6 方法線性關(guān)系及檢出限

以 3 種 N- 亞硝基胺類物質(zhì)及 3 種假陽性物質(zhì)的濃度為橫坐標(biāo)，3 種 N- 亞硝基胺類物質(zhì)及 3 種假陽性物質(zhì)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，方法檢出限采用試劑空白添加標(biāo)準(zhǔn)溶液完成前處理步驟后進行儀器分析，當(dāng) S/N=3 時所對應(yīng)的濃度為方法檢出限。結(jié)果表明：液相色譜法的線性相關(guān)系數(shù)為 0.9928～0.9992，方法檢出限為 0.14～0.43 mg/kg，結(jié) 果 見 表 4。 液 質(zhì) 聯(lián) 用 法 的 線 性 相 關(guān) 系 數(shù) 為0.9931～0.9968，方法 檢 出 限 為 0.10～0.46 mg/kg，結(jié)果見表 5。

表4 液相色譜法測 3 種 N- 亞硝基胺類物質(zhì)及 3 種假陽性物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限Tab.4 Standard curve and detection limit of 3 N-nitrosoamines and 3 false positive substances by HPLC

表5 液質(zhì)聯(lián)用法測 3 種 N- 亞硝基胺類物質(zhì)及 3 種假陽性物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限Tab.5 Standard curve and detection limit of 3 N-nitrosoamine substances and 3 false positive substances by LC-MS/MS

2.7 回收率與精密度

回收率采用基體加入法，選取黑色橡膠作為基體，添加三個水平，分別為 1.0 mg/kg、5.0 mg/kg、10.0 mg/kg，每個水平平行測定 7 次，結(jié)果表明：液相色譜法的加標(biāo)回收率為 96.7%～103.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為 2.3%～5.4%；液質(zhì)聯(lián)用法的加標(biāo)回收率為 98.1%～106.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為 2.2%～4.2%，均滿足日常檢測要求。

3 結(jié)論

分析了氣質(zhì)聯(lián)用法測 3 種 N- 亞硝基胺類物質(zhì)出現(xiàn)假陽性的原因，建立了測定 3 種 N- 亞硝基胺類物質(zhì)及其 3 種假陽性物質(zhì)的液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用法，優(yōu)化了儀器參數(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)對 3 種物質(zhì)的準(zhǔn)確定量，有助于提高實驗室對 N- 亞硝基胺類物質(zhì)假陽性情況的識別及檢測能力，也為其他產(chǎn)品中N- 亞硝基胺類物質(zhì)的測定提供了參考方法。