賀建豪，黃培煒，許金森，陳 銘

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院，福建 福州 350108；2.福建省中醫(yī)藥科學(xué)院經(jīng)絡(luò)研究所，福建 福州 350003；3.福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)系，福建 福州 350101）

慢性阻塞性肺疾?。ê喎Q慢阻肺）是以不完全可逆性氣流受限為特征的呼吸道疾病，其臨床特征包括慢性呼吸系統(tǒng)異常、肺結(jié)構(gòu)異常、肺功能受損，且通常還會伴有其他多器官功能紊亂［1］，主要癥狀是呼吸困難、慢性咳嗽、咳痰［2］。慢阻肺目前居我國疾病死亡原因的第3位［3］，預(yù)計到2030年慢阻肺將成為全世界發(fā)病率和病死率的第四大病因［4］，其高患病率、高死亡率和較重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)已成為我國及全球重要的公共衛(wèi)生問題［5］。撳針作為一種傳統(tǒng)干預(yù)方式，安全有效，目前國內(nèi)已有一些臨床研究證實在西藥治療基礎(chǔ)上輔助撳針治療可以更好地改善慢阻肺患者癥狀［6-7］，但相關(guān)基礎(chǔ)研究較少。鑒于此，本文采用脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）聯(lián)合煙熏建立慢性阻塞性肺疾病大鼠模型，觀察撳針“肺俞”穴對慢阻肺大鼠的氣管、肺組織形態(tài)學(xué)及血清、肺組織超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量的影響，初步探討撳針治療慢阻肺的機(jī)理，為臨床使用撳針提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物與儀器 18只雄性SD大鼠購自上海斯萊克實驗有限責(zé)任公司，體質(zhì)量（180±20）g，9周齡，清潔級，許可證及合格證號碼分別為：SCXK（瀘）2017-0005，20170005006824。自制氣管滴管；自制煙熏箱（100 cm×80 cm×50 cm）；DNP-9162型恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；多功能酶標(biāo)分析儀（瑞士帝肯公司，型號：Infinite F50）；L660低速離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；YT-7FB型生物組織攤烤片機(jī)、ZT-14V2型組織脫水機(jī)、YB-7LF型包埋機(jī)均購自孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司；RM2255型石蠟切片機(jī)（德國萊卡公司）。

1.1.2 材料與試劑 白色七匹狼牌香煙（福建中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，每支含一氧化碳13 mg、煙堿0.9 mg、焦油量12 mg）；LPS（中國生物檢驗檢定所，規(guī)格：100 mg，批號：S09M10I87813）；一次性使用無菌撳針（吳江市云龍醫(yī)療器械有限公司，規(guī)格：0.25×2.0 mm）；4%多聚甲醛（蘭杰柯科技有限公司）；MDA、SOD檢測試劑盒（均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號分別為ml077384、ml001998，批號均為03/2021）。

1.2 方 法

1.2.1 分組及模型制備 SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，按隨機(jī)數(shù)字表分為正常組、模型組、撳針組，每組6只。后兩組采用LPS氣管內(nèi)滴注+煙熏的方式造模［8］。造模方法：造模第1日用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，采用自制氣管插管，氣管內(nèi)滴注1 mg/mL的LPS溶液，0.2 mL/只，休息1周。第2周開始置于煙熏箱，首先一次性點燃15支白色七匹狼香煙后放入煙熏箱內(nèi)，關(guān)閉煙熏箱，每次30 min，每天1次，連續(xù)熏4周；繼而進(jìn)行第2次氣管滴注1 mg/mL的LPS溶液，0.3 mL/只。休息1周后，用20支香煙熏4周，每天1次，每次30 min。造模共耗時10周，其中LPS滴注2次，休息2周，煙熏8周。正常組大鼠于相同時間點暴露于空氣中。

1.2.2 干預(yù) 于造模第8周開始對雙側(cè)“肺俞”穴進(jìn)行干預(yù)，將腧穴部位及其周圍去毛，定位“肺俞”穴［9］，將撳針刺入“肺俞”穴，按揉“肺俞”2 min，每隔30 min按揉1次，共循環(huán)4次，總按揉時間為8 min，其余時間用膠布固定撳針，1次/d，每周干預(yù)6 d，連續(xù)干預(yù)3周，取針時一手固定大鼠，另一手用鑷子將膠布向外撕下。模型組除無撳針干預(yù)以外，其他都與撳針組相同。

1.2.3 觀察指標(biāo) 干預(yù)結(jié)束次日，采用10%水合氯醛麻醉大鼠，切開腹部，用紗布撥開組織找到腹主動脈，用采血針進(jìn)行腹主動脈采血，離心取上清液，存于-80℃冰箱待用；取右側(cè)固定位置的一塊肺組織，低溫冷凍破碎，以0.1 mg樣本加1 mL預(yù)冷PBS重懸，2～8℃，12 000RPM，離心取上清液存于-80℃冰箱，待用ELISA法檢測SOD及MDA，嚴(yán)格遵照試劑盒中說明書操作。取氣管、左側(cè)固定邊緣位置的肺組織，將其浸泡于4%的多聚甲醛中固定，在光學(xué)顯微鏡下觀察經(jīng)過脫水、包埋、切片等過程后的氣管及肺組織病理改變并拍攝圖片。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，如果3組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)性分布，則選擇單因素方差分析；如果3組中有一組數(shù)據(jù)不符合正態(tài)性分布，則選擇秩和檢驗；分析結(jié)果均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）來表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠氣管、肺組織病理形態(tài)學(xué)

正常組大鼠氣管黏膜上皮完整（表面平滑），纖毛細(xì)胞游離面的纖毛未見異常；與正常組比較，模型組大鼠氣管黏膜上皮細(xì)胞增厚（表面毛糙），纖毛細(xì)胞增多，纖毛長度變長；與模型組比較，撳針組上皮細(xì)胞無明顯增厚（表面較平滑），纖毛細(xì)胞少，纖毛長度短。正常組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)未見異常，肺泡壁結(jié)構(gòu)較完整，極少量炎性細(xì)胞浸潤；與正常組比較，模型組大鼠肺內(nèi)肺泡間隔破裂融合形成肺大泡，肺泡腔明顯擴(kuò)張，肺間質(zhì)內(nèi)見炎性細(xì)胞浸潤；與模型組比較，撳針組大鼠肺中融合的肺大泡數(shù)量減少，肺間質(zhì)內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤減少。結(jié)果見圖1。

圖1 各組大鼠氣管、肺組織病理圖

2.2 各組大鼠血清、肺組織中SOD、MDA含量

與正常組比較，模型組大鼠血清、肺組織MDA含量增加（P＜0.05，P＜0.01）；肺組織SOD含量下降（P＜0.01）；與模型組比較，撳針組大鼠血清MDA含量下降（P＜0.01）、肺組織SOD含量增加（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

表1 3組大鼠血清、肺組織SOD和MDA含量比較 （±s）

表1 3組大鼠血清、肺組織SOD和MDA含量比較 （±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01；與模型組比較，3）P＜0.05，4）P＜0.01

組別n 血清肺組織SOD（ng/mL）MDA（nmol/mL）SOD（ng/mL）MDA（nmol/L）正常組6 9.766±0.879 5.478±0.101 11.045±0.420 4.737±0.391模型組6 9.102±0.634 5.908±0.1692）9.944±0.7262）5.141±0.1921）撳針組6 9.271±0.521 5.532±0.1264）10.942±0.6273）5.138±0.192 F值1.480 18.079 6.063 4.300 P值0.259 0.000 0.012 0.033

3 討論

慢阻肺屬中醫(yī)學(xué)“肺脹”“咳嗽”“喘證”等范疇，常累及肝、脾、腎等臟，病機(jī)為本虛標(biāo)實，急性期以標(biāo)實為主，慢性期以本虛為主。糖皮質(zhì)激素霧化吸入、長期吸氧、支氣管擴(kuò)張劑等對癥支持治療是目前主要的治療方法，但是這些藥物長期使用會帶來感染、心血管事件等不良反應(yīng)。盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在考慮如何使用藥物治療慢阻肺時盡可能減少副作用，但仍未找到解決此問題的方法［10］。

撳針長度較短，約為2～2.5 mm，只觸及皮下，不達(dá)深部，也不損傷大血管、神經(jīng)，是一種安全、有效的干預(yù)方式，適用于需要長時間留針的慢性疾病。撳針療法的相關(guān)理論來源于《黃帝內(nèi)經(jīng)》中關(guān)于浮刺及《靈樞·官針》中關(guān)于久留針的論述，是十二皮部理論、衛(wèi)氣理論、經(jīng)絡(luò)腧穴學(xué)說、針刺理論共同指導(dǎo)下的實際應(yīng)用［11］。《針灸甲乙經(jīng)》載：“肺氣熱，呼吸不得臥，上氣嘔沫，喘氣相追逐，胸滿脅膺急，息難，肺俞主之……肺脹者，肺俞主之?！薄端貑枴た日摗吩唬骸爸闻K者，治其俞?！狈斡嵫ㄗ鳛樽闾柊螂捉?jīng)的一個重要穴位，在臨床和科研中應(yīng)用頻繁。肺俞穴為肺氣所轉(zhuǎn)輸、輸注的部位，與肺臟相應(yīng)。當(dāng)肺部有疾時，肺俞穴處會出現(xiàn)敏化現(xiàn)象，此時刺激此穴可以達(dá)到調(diào)節(jié)肺臟氣血的作用，損有余而補(bǔ)不足，維持人體氣血陰陽動態(tài)平衡［12］。有臨床研究表明撳針肺俞聯(lián)合八珍湯可降低患者TNF-α含量、升高IL-10含量，并且能提高6 min行走距離，明顯改善慢阻肺所引起的各種臨床癥狀［13］。

LPS聯(lián)合煙熏是一種耗時長的造模方法，可以成功制作慢阻肺模型。LPS是空氣污染物中革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的一個組成部分，細(xì)菌侵入生物體后，其細(xì)胞壁的LPS觸發(fā)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞釋放炎性因子，在氣道和肺組織中誘發(fā)炎癥反應(yīng)。香煙燃燒后會產(chǎn)生較高濃度的氧化產(chǎn)物和氧自由基，通過不同途徑刺激肺部產(chǎn)生炎癥，導(dǎo)致大量中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞往肺部和氣道遷移。中性粒細(xì)胞會釋放基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-8、MMP-9、彈性蛋白酶（NE）等，它們對肺泡組織有破壞作用。NE和MMP-9會降解彈性蛋白、膠原蛋白等多種細(xì)胞外基質(zhì)成分；MMP-8擁有膠原酶活性，可以破壞肺泡間隔的正常結(jié)構(gòu)，而間隔細(xì)胞的正常功能是保持肺泡結(jié)構(gòu)完整性的前提。巨噬細(xì)胞中檢測到的巨噬細(xì)胞彈性蛋白酶（MMP-12）可以降解彈性蛋白，形成的片段會趨化單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)，加速肺組織結(jié)構(gòu)破壞［14］。纖毛細(xì)胞是氣管黏膜上皮的組成成分之一，呈柱狀，游離面有纖毛，當(dāng)纖毛快速擺動時，可將黏液及附在其上的細(xì)菌、塵埃推向咽部，經(jīng)咳嗽反射咳出，以凈化吸入的空氣，長期吸煙可使纖毛變形、膨脹［15］。通過上述形態(tài)學(xué)的結(jié)果可知，模型組大鼠的氣管黏膜上皮增厚，纖毛細(xì)胞增多，纖毛變長，肺泡間隔破裂，有炎性細(xì)胞浸潤。而撳針肺俞可以使氣管、肺組織的病理改變減輕，說明撳針肺俞穴可以在一定程度上治療慢阻肺。本研究造模時間較長，因為課題組前期預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)停止煙熏后大鼠自行恢復(fù)速度較快，會影響撳針干預(yù)慢阻肺大鼠效果的判斷。

氧化/抗氧化失衡是慢阻肺發(fā)生的重要機(jī)制之一，生理狀況下人體內(nèi)的氧化劑與抗氧化劑處于動態(tài)平衡，當(dāng)二者處于不平衡時會出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡和組織損傷。肺臟因其擁有豐富的血供和呼吸膜面積大等獨(dú)特的組織結(jié)構(gòu)特點，極易受到活性氧（ROS）、活性氮（RNS）及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物等內(nèi)源性氧化劑的損害［16］。MDA可間接反映細(xì)胞受損害的程度，是脂質(zhì)過氧化的標(biāo)志，因其由ROS和不飽和脂肪酸反應(yīng)分解而來，可交聯(lián)機(jī)體內(nèi)大分子如蛋白質(zhì)、核酸和脂類，引起生物膜變性，致使細(xì)胞死亡［17］。SOD是內(nèi)源性抗氧化劑中的一種抗氧化酶，也是一種金屬活性酶，它可消除超氧陰離子自由基，阻止細(xì)胞核氧化裂解，進(jìn)而防止生物細(xì)胞損傷凋亡［18］。

由表1可知，與正常組比較，模型組大鼠血清SOD含量有下降趨勢，肺組織SOD含量顯著下降，推測是香煙燃燒后產(chǎn)生的大量氧自由基首先被大鼠吸入肺部，機(jī)體啟動保護(hù)反應(yīng)，肺中SOD因要消除大量氧自由基而比血液中消耗更多；模型組大鼠肺組織MDA含量上升，血清MDA含量顯著上升，說明機(jī)體存在肺部及血液中細(xì)胞受損害的情況，且血液中細(xì)胞受損害更嚴(yán)重，推測是肺中大量消耗的SOD清除了一部分氧自由基，減少了肺部細(xì)胞的損傷。與模型組比較，撳針組大鼠肺組織MDA含量變化不大，肺組織SOD含量上升，說明撳針可以增加肺中SOD含量以更多的消耗香煙產(chǎn)生的氧自由基，有效防止肺部細(xì)胞進(jìn)一步損傷。血清MDA含量顯著下降，SOD有上升趨勢，說明撳針可以有效減輕血液中的細(xì)胞受損傷程度。綜上所述，我們可知撳針可以在一定程度改善機(jī)體氧化/抗氧化失衡狀態(tài)。

慢阻肺公認(rèn)的發(fā)病機(jī)制除氧化-抗氧化失衡外，還有炎癥機(jī)制、蛋白酶-抗蛋白酶失衡、自身免疫性疾病以及最新的細(xì)胞凋亡學(xué)說等，目前僅依靠一種機(jī)制不足以解釋慢阻肺的復(fù)雜病理，不同機(jī)制之間可能發(fā)生相互作用，比如氧化應(yīng)激可以引起蛋白酶抗蛋白酶失衡、放大炎癥、引起自身免疫反應(yīng)［19］，后續(xù)筆者將繼續(xù)觀察撳針肺俞在抗炎及糾正蛋白酶-抗蛋白酶等方面的作用，為臨床應(yīng)用撳針提供實驗依據(jù)。