趙力興，王琳，溫麗，候偉峰，畢盛楠，其格其，孫烏日娜

(1.興安盟農(nóng)牧業(yè)科學(xué)研究所，內(nèi)蒙古 烏蘭浩特 137400；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

土壤-植被是陸地生態(tài)系統(tǒng)功能的基礎(chǔ)，土壤質(zhì)量和植被生長狀況是陸地生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)發(fā)展的重要保證[1]。土壤中NaCl和Na2SO4含量較高的土壤被稱為鹽土，Na2CO3和NaHCO3含量較高的土壤稱為堿土，而在自然界，鹽土和堿土往往同時(shí)存在，稱為鹽堿土[2]。土壤鹽化、堿化是兩種不同的非生物脅迫，以高鹽度和高pH值為主要特點(diǎn)[3]，對植物危害的程度大小為鹽堿脅迫>堿脅迫>鹽脅迫[4-5]。研究表明土壤中鹽分的積累會破壞植物體內(nèi)的離子平衡和正常的新陳代謝，引起可溶性鹽離子在體內(nèi)的積累，產(chǎn)生離子毒害，增加能耗和抑制植物對養(yǎng)分的獲取能力，導(dǎo)致植物代謝受阻以及抑制植物生長發(fā)育，使植物進(jìn)一步萎蔫甚至死亡[6-7]。在堿脅迫下，隨著植物根系土壤pH值的升高，無機(jī)陰離子減少，F(xiàn)e2+、Mg2+、Ca2+離子的沉積導(dǎo)致植物礦質(zhì)營養(yǎng)吸收受阻[8-9]。土地鹽堿化是非常重要的非生物脅迫，嚴(yán)重影響作物的生產(chǎn)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力[10]。土壤鹽堿化已經(jīng)成為一個(gè)世界性的資源問題和生態(tài)問題，逐漸威脅人類的生存需求。

紫花苜蓿(Medicagosativa)是一種重要的多年生優(yōu)質(zhì)豆科牧草，有著“牧草之王”的美譽(yù)[11]。紫花苜蓿具有中強(qiáng)度的抗鹽堿特性，葉片具有排鹽能力[12]，能夠在含鹽量0.1%～0.8%的鹽堿地中生長[13-14]，50～200 mmol/L的NaCl脅迫會降低產(chǎn)量[15]。種子萌發(fā)期是植物鹽害最敏感時(shí)期，鹽脅迫會顯著降低紫花苜蓿相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、胚根干質(zhì)量和胚芽干質(zhì)量，半致死鹽濃度為0.85%，1.2% NaCl為耐鹽性鑒定的適宜濃度[16]。當(dāng)蘇打(Na2CO3)濃度超過30 mmol/L時(shí)，會對種子的萌發(fā)和芽苗的生長產(chǎn)生明顯的抑制作用[17]。在鹽堿地建植苜蓿草地：一方面提高了鹽堿地的利用率，緩解了與糧食作物爭地的矛盾，同時(shí)能夠?yàn)椴莸匦竽翗I(yè)的發(fā)展提供優(yōu)質(zhì)飼草；另一方面能夠改良鹽堿地，提高土壤肥力。青海省西北部棄耕鹽堿地pH值在8左右，含鹽量高達(dá)6.73～28.08 g/kg，且表層土壤鹽分聚集，養(yǎng)分含量極低[18]。種植紫花苜蓿后提高了土壤中全氮和有效鉀含量，提高土壤肥力[19]。隨著苜蓿種植時(shí)間的增加，生物產(chǎn)量減少，對土壤養(yǎng)分的消耗降低，根系-根瘤菌共生體更加成熟，固氮能力增強(qiáng)，大量的植物殘?bào)w分解形成腐殖質(zhì)，使土壤質(zhì)量提高[20]。

在鹽堿地建植苜蓿人工草地，對開發(fā)利用鹽堿地資源，提高鹽堿地的經(jīng)濟(jì)生態(tài)效益有著重要意義。本文論述了鹽堿地苜蓿的適應(yīng)機(jī)制和栽培策略，旨在為鹽堿地苜蓿栽培管理提供一定參考。

1 鹽堿地苜蓿的適應(yīng)機(jī)制

苜蓿在鹽堿地上生長，隨著鹽堿脅迫時(shí)間的延長要抵御由水、滲透脅迫造成的短期脅迫和由離子毒害作用造成的長期脅迫[21]。紫花苜蓿如何抵御、緩解和適應(yīng)滲透脅迫及離子毒害，維持體內(nèi)滲透和酸堿平衡成為研究的熱點(diǎn)。

1.1 苜蓿的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)與耐鹽堿性

在逆境脅迫下植物體內(nèi)脯氨酸和可溶性糖含量增加，這是植物對逆境脅迫的一種生理生化反應(yīng)[22-23]。植物體內(nèi)的游離脯氨酸作為一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，當(dāng)苜蓿受到鹽堿脅迫時(shí)，體內(nèi)會合成大量的游離脯氨酸來調(diào)節(jié)植物體的滲透勢、平衡細(xì)胞代謝作用維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定[24-25]。堿脅迫對苜蓿的影響大于鹽脅迫，主要是由于在堿脅迫下苜蓿通過脯氨酸進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)，同時(shí)進(jìn)行植物體內(nèi)pH值調(diào)節(jié)，而后者需要消耗大量能量，導(dǎo)致苜蓿植株矮小、存活率降低?？扇苄蕴窃谲俎５钟{迫的過程中也起到重要作用，鹽堿脅迫下苜蓿體內(nèi)可溶性糖含量增加，能夠?yàn)楦彼岬暮铣商峁┨脊羌芎湍芰俊＼俎Ｔ邴}堿脅迫下會發(fā)生膜質(zhì)過氧化，丙二醛是膜質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，能夠與膜中蛋白結(jié)合引起蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間交聯(lián)，使蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚合[26]，會使葉綠素降解[27]，降低光合作用，進(jìn)而抑制植物生長，其含量多少反映了膜的穩(wěn)定性和受傷害程度[28-29]。在低濃度鹽堿脅迫下，苜蓿通過一系列的調(diào)節(jié)機(jī)制使膜不受損傷，當(dāng)中性鹽濃度≥100 mmol/L或堿性鹽濃度≥60 mmol/L時(shí)，苜蓿體內(nèi)丙二醛含量顯著增加，即苜蓿受傷害程度增加[30]。

1.2 苜蓿耐鹽堿性與抗氧化酶活性

過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)是植物體內(nèi)主要的抗氧化酶。在鹽堿逆境脅迫中，植物體內(nèi)SOD可將超氧離子歧化為過氧化氫，CAT和POD將過氧化氫氧化還原為氧氣和水，從而清除植物體內(nèi)的活性氧，消除因鹽堿脅迫產(chǎn)生的毒害物質(zhì)，從而保護(hù)植物膜系統(tǒng)，保證苜蓿在一定鹽堿脅迫下能夠正常生長發(fā)育[31-32]。研究表明，在混合鹽堿脅迫下POD、CAT和SOD可在一定程度下清除苜蓿體內(nèi)過剩的活性氧，維持代謝平衡，保護(hù)膜系統(tǒng)。當(dāng)脅迫超過苜蓿承受極限時(shí)POD、CAT和SOD活性會降低或被破壞，使植物生長受阻[33]。李波等[34]研究表明苜蓿體內(nèi)SOD和POD的活性隨著蘇打鹽堿濃度的增加而增加，當(dāng)濃度超過150 mmol/L時(shí)逐漸失去活性、降低對鹽堿脅迫的抵御能力。

1.3 苜蓿葉、莖、根解剖結(jié)構(gòu)與耐鹽堿性

鹽堿脅迫會對苜蓿生長發(fā)育產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)，苜蓿通過不同的結(jié)構(gòu)來適應(yīng)鹽堿環(huán)境。葉片是植物進(jìn)行光合作用和蒸騰作用的重要器官，其結(jié)構(gòu)特征能夠體現(xiàn)植物與生境的適應(yīng)特點(diǎn)[35]。鹽堿脅迫使苜蓿葉片整體變薄，苜蓿葉片表皮細(xì)胞壁角質(zhì)層增厚；海綿組織薄壁細(xì)胞體積增大，以增加水分容量稀釋細(xì)胞內(nèi)鹽濃度[36-37]；主葉脈維管束中木質(zhì)導(dǎo)管數(shù)量減少，孔徑變小，以降低從莖稈向葉片水分輸送量[37]。苜蓿莖稈通過改變皮層、維管組織和髓的結(jié)構(gòu)來適應(yīng)環(huán)境的變化：苜蓿莖稈表皮細(xì)胞由圓形大小不一向方形大小均一轉(zhuǎn)變；莖稈皮層細(xì)胞排列緊密；維管束木質(zhì)導(dǎo)管數(shù)量和孔徑降低；髓腔面積減少；髓細(xì)胞逐漸規(guī)則且髓細(xì)胞壁加厚，以阻止體內(nèi)水分散失，提高苜蓿缺水條件下的抗倒伏能力[37-38]。植物根系具有固定植株、吸收和運(yùn)輸水分養(yǎng)分、合成貯藏營養(yǎng)物質(zhì)等功能，是植物最先感受土壤鹽堿脅迫等逆境脅迫的部位。當(dāng)受到逆境脅迫后通過生理或形態(tài)變化來響應(yīng)逆境脅迫[39]。植物根系具有阻止鹽分進(jìn)入輸導(dǎo)組織的作用。在鹽堿脅迫下苜蓿根系直徑顯著增加，木質(zhì)導(dǎo)管直徑降低但數(shù)量增加，加強(qiáng)了對離子運(yùn)輸?shù)倪x擇和控制以及水分的運(yùn)輸，促進(jìn)植物的生理代謝。同時(shí)鹽堿脅迫水平的提升會使周皮細(xì)胞的排列更加緊密，根部所有組織內(nèi)細(xì)胞壁加厚，這種特殊的結(jié)構(gòu)抑制了有毒有害離子進(jìn)入苜蓿根系[37]。苜蓿根系發(fā)達(dá)生物量高，具有較強(qiáng)的向土壤深處生長的能力，三年平均根長為240.80～460.77 cm[40]。豐富的根系能夠分泌大量的有機(jī)物質(zhì)(糖類、有機(jī)酸、氨基酸等)和胞外酶(蔗糖酶、脲酶、磷脂酶等)，改善土壤根際微環(huán)境[41]。研究表明混合鹽堿脅迫對根尖的影響表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)，低濃度的混合鹽堿脅迫對苜蓿根系生長具有一定的促進(jìn)作用，高濃度混合鹽堿脅迫且堿性鹽比例的增加，對苜蓿根系生長的抑制作用更加明顯，當(dāng)鹽濃度達(dá)到150 mmol/L時(shí)，根系總長度顯著降低[42]。

2 鹽堿地苜蓿栽培策略

苜蓿在鹽堿脅迫下，其適應(yīng)能力存在閾值，適宜的栽培策略有益于鹽堿地苜蓿的生長。通過合理的灌溉制度以改造鹽堿土、接種有益根際微生物以改善根際微環(huán)境、選育耐鹽堿品種以提高抗性，提高苜蓿對鹽堿環(huán)境的抵御和適應(yīng)能力。

2.1 灌排水洗鹽與土壤含鹽量

鹽堿地苜蓿栽培策略中灌水洗鹽是最直接、見效快的方法，能夠快速降低土壤含鹽量，有效緩解鹽堿對植物的毒害作用，制定科學(xué)的灌排水洗鹽制度尤為關(guān)鍵。灌水：植物蒸騰會帶動(dòng)鹽分上移，如果灌溉水量僅滿足植物蒸騰、蒸發(fā)的需水要求，沒有足夠的水將土壤中的鹽分淋洗到深層，則會在植物根部下層形成鹽分聚集層，影響植物的生長并且灌溉用水應(yīng)當(dāng)選擇礦化度較低的水源。排水：及時(shí)抽排地下水，能夠防止地下水位上升、淺水蒸發(fā)加劇和鹽分積累造成的次生鹽堿化。研究表明[43]，在地下水鹽分濃度較低，表土沒有嚴(yán)重積鹽的地區(qū)，可適當(dāng)加大灌溉水量。在重度、中度鹽堿化土地且地下水礦化度高的情況下，為盡快消除根系范圍內(nèi)的積鹽，應(yīng)該加大渠管量使表層積鹽得到淋洗，并且適量抽排地下水。

因地制宜的制定灌排水方案，使地面水和地下水聯(lián)合調(diào)度運(yùn)行、水資源達(dá)到合理利用、優(yōu)化配置，從而改造鹽堿土。

2.2 苜蓿耐鹽堿性與根際微環(huán)境

生物修復(fù)技術(shù)是利用植物與微生物的相互作用，提高植物的抗逆性，改善土壤微環(huán)境促進(jìn)植物生長[61]。植物根際促生菌(Plant Growth Promoting Rhizobacteria，PGPR)是指能夠定殖在植物根際且有利于植物生長，提高作物產(chǎn)量品質(zhì)的有益菌[62]。植物根際促生菌可以通過產(chǎn)生植物激素(脫落酸、赤霉素、細(xì)胞分裂素和植物生長素)；產(chǎn)生1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)脫氨酶，降低生長中植物根部的乙烯水平；固氮、溶磷、解鉀、產(chǎn)生嗜鐵素和誘導(dǎo)植物對生物及非生物脅迫的系統(tǒng)抗性來促進(jìn)植物生長[63-64]。劉佳莉[65]在鹽堿地中生長的植物根際篩選出4株含ACC脫氨酶的PGPR。這4株菌株(Serratiamarcescens、Acinetobacterbaumannii、Pseudomonasmediterranea、Pseudomonasfluorescens)通過降低鹽堿脅迫下乙烯的合成量來促進(jìn)紫花苜蓿的生物量的積累、提高蛋白含量及磷素利用率降低纖維含量。鹽堿脅迫下接種PGPR后紫花苜蓿根系活力、葉綠素含量和抗氧化酶活性顯著提高，同時(shí)清除過量的超氧離子自由基等有害物質(zhì)，積累滲透保護(hù)物質(zhì)，提高耐鹽堿能力。向君亮[66]從草原鹽堿土壤中分離得到一株能夠產(chǎn)生植物激素 IAA和ACC脫氨酶功能的菌株堀越氏芽孢桿菌(Bacillushorikoshii)。苜蓿接種后發(fā)芽率和發(fā)芽勢分別提高了15%和10%，緩解了鹽堿脅迫對苜蓿種子萌發(fā)的抑制作用。叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)能夠與植物的根系共生形成菌根，顯著改善植物養(yǎng)分和水分的吸收，影響植物的生理代謝過程，增強(qiáng)植物的抗逆性[67]。在單鹽脅迫條件下接種AMF能夠調(diào)節(jié)紫花苜蓿的生理生長來增加植物的耐鹽性[68]。酚酸類物質(zhì)是植物生長過程中所產(chǎn)生的一類重要次生代謝產(chǎn)物，其可以通過增加植物細(xì)胞壁厚度[69]，以及調(diào)控抗氧化酶活性來增加植物的抗逆能力[70-72]。有研究表明接種AMF能夠促進(jìn)宿主植物體內(nèi)酚酸含量的積累[73]。趙琦等[74]認(rèn)為在混合鹽堿脅迫下，接種AMF能夠改變紫花苜蓿體內(nèi)酚酸的含量、積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，提高耐鹽堿性，促進(jìn)植物生長。這些研究結(jié)果為研制復(fù)合菌肥，治理和利用鹽堿地奠定了理論基礎(chǔ)。

2.3 苜蓿耐鹽堿性與新品種選育

苜蓿中等的耐鹽堿能力，限制了紫花苜蓿的種植范圍，因此選育耐鹽堿能力更強(qiáng)的紫花苜蓿品種成為亟待解決的問題。常規(guī)育種目前仍然是選育抗鹽堿苜蓿新品種的主要方法。國外通過雜交手段培育出AZ-Germ SaltII、AZ-97MEC、AZ-97MEC-ST、ZS-9491、ZS9592等耐鹽堿紫花苜蓿品種[75]。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所以保定紫花苜蓿(M.sativacv.Baoding)、秘魯苜蓿(M.sativacv.Peru)、南皮苜蓿(M.sativacv.Nanpi)、RS苜蓿(M.sativacv.RS)及細(xì)胞耐鹽篩選的植株為原材料，經(jīng)開放授粉和田間混合選擇4代培育出耐鹽堿新品種“中苜1號”，其產(chǎn)量在鹽堿含量為0.3%的鹽堿地上比一般栽培品種增加10%[76]。以“中苜1號”為親本材料，通過鹽堿地表型選擇、耐鹽性一般配合力的測定，經(jīng)過兩次輪回選擇和一次混合選擇，獲得耐鹽苜蓿新品系“中苜3號”。新品種在鹽堿地表現(xiàn)出較好的豐產(chǎn)性與適應(yīng)性，在含鹽量為0.18%～0.39%的鹽堿地上，比對照品種“中苜1號”產(chǎn)量提高10%以上，干草粗蛋白含量達(dá)18%～20%[77]。60Co-γ輻射誘變育種是一種創(chuàng)造新品種和新種質(zhì)的重要手段[78]。γ射線照射可降低Na+在紫花苜蓿中的積累[79]，在臭氧協(xié)同脅迫時(shí)，鹽堿地紫花苜蓿相對產(chǎn)量增加42%[80]。黑龍江省畜牧研究所對親本二倍體扁蓿豆與四倍體紫花苜蓿進(jìn)行輻射誘變處理，攻克了遠(yuǎn)緣雜交關(guān)，采用集團(tuán)選擇法選育，歷經(jīng)16年育成了“龍牧801”和“龍牧803”紫花苜蓿新品種。通過品種比較試驗(yàn)、區(qū)域試驗(yàn)和生產(chǎn)試驗(yàn)結(jié)果表明該品種具有耐鹽抗寒高產(chǎn)的特點(diǎn)[81]。

由于選育周期長、費(fèi)時(shí)費(fèi)力限制了傳統(tǒng)雜交育種的發(fā)展。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)成為育種工作的重要手段。Deak等[82]首次報(bào)道了利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得抗性苜蓿植株。Webb等[83]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法培育出轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿。此后紫花苜蓿轉(zhuǎn)基因技術(shù)取得了很大進(jìn)展，當(dāng)前利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將優(yōu)良性狀導(dǎo)入紫花苜蓿以提高苜蓿耐鹽堿性已經(jīng)成為一種重要途徑[84]。陳冉冉等[85]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的子葉節(jié)侵染法將從野生大豆中篩選出堿脅迫應(yīng)答基因GsARHP轉(zhuǎn)化肇東苜蓿，轉(zhuǎn)基因株系在堿脅迫下長勢良好，質(zhì)膜透性和丙二醛含量低于非轉(zhuǎn)基因株系，葉綠素含量和CAT活性高于非轉(zhuǎn)基因株系，提高了苜蓿的耐堿性。植物谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GsT)能夠催化谷胱甘肽(GSH、γ-Glu-Cvs-Glv)與生物異源物或細(xì)胞過氧化物結(jié)合，以促進(jìn)這些底物代謝、區(qū)域化隔離或?qū)⑵鋸氐浊宄?。王臻昱等[86]從野生大豆中篩選克隆得到GsGST19基因，轉(zhuǎn)化苜蓿后進(jìn)行鹽堿脅迫。轉(zhuǎn)基因株系GsT酶活性是非轉(zhuǎn)基因的1.19～1.52倍，且長勢良好，質(zhì)膜透性和丙二醛含量顯著低于非轉(zhuǎn)基因株系，葉綠素含量和根系活力顯著高于非轉(zhuǎn)基因株系。Suarez等[87]將酵母海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase)基因TPS1和海藻糖-6-磷酸磷酸酶(trehalose-6-phosphate phosphatase,TPP)基因TPS2融合，分別以35S和rd29A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)在紫花苜蓿中表達(dá)，轉(zhuǎn)基因株系耐鹽堿性顯著提高。Winicov等[88-89]將轉(zhuǎn)錄因子Alfin1導(dǎo)入紫花苜蓿中，超表達(dá)的Aflin1的愈傷組織可抵御171mmol/L的NaCl脅迫，增強(qiáng)MsPRP2的表達(dá)和苜蓿耐鹽性。

植物的耐鹽堿性是受多個(gè)基因協(xié)同控制的數(shù)量性狀，目前報(bào)道的只涉及單基因的轉(zhuǎn)化，且缺乏品種的區(qū)域性試驗(yàn)。山東省林業(yè)科學(xué)研究院科研團(tuán)隊(duì)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)將山菠菜(Atriplex hortensis)甜菜堿醛脫氫酶Ah-BADH的編碼基因?qū)胫熊?號紫花苜蓿，T1代植株可抵御含量為0.8%～0.9%的NaCl脅迫，經(jīng)過對T3代轉(zhuǎn)基因植株的鑒定和篩選，通過自交、雜交選育出耐鹽堿的“山苜2號”，品種比較試驗(yàn)、區(qū)域試驗(yàn)和生產(chǎn)試驗(yàn)表明山苜2號在不同鹽堿條件下植株抗逆性和產(chǎn)草量明顯高于中苜1號[90-91]。BADH在山苜2號中穩(wěn)定地遺傳和表達(dá)，使生物技術(shù)手段結(jié)合自交和雜交等常規(guī)育種方法培育耐鹽新品種成為一條有效且簡捷的途徑。

3 總結(jié)與展望

苜蓿通過調(diào)節(jié)生理代謝改變組織結(jié)構(gòu)等自身特點(diǎn)以適應(yīng)鹽堿環(huán)境，其耐鹽堿性存在閾值，通過選育耐鹽堿品種，優(yōu)化農(nóng)藝措施，以保障紫花苜蓿的生長發(fā)育。紫花苜蓿的抗鹽堿性是由其體內(nèi)抗鹽堿基因的表達(dá)、耐鹽堿代謝途徑及其與其他多種代謝途徑綜合作用的復(fù)雜過程。目前對紫花苜蓿的耐鹽堿機(jī)制仍不完全清楚，是限制獲得耐鹽堿性強(qiáng)的新品種的主要障礙。在今后苜蓿耐鹽堿研究工作中，需要整合植物遺傳育種學(xué)、植物生理生化和分子生物學(xué)等領(lǐng)域研究方法，對進(jìn)一步明確苜蓿的耐鹽堿機(jī)制，最大限度地挖掘苜蓿的生物學(xué)潛力，培育更多抗鹽堿性強(qiáng)、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)苜蓿品種和制定相關(guān)栽培措施具有重要作用。