趙惠英，楊光凱，高 燕，2，張小軍，2，郝燕燕，2

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 030801；2.果樹種質(zhì)創(chuàng)制和利用山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030031)

果實(shí)色澤是衡量果實(shí)外觀品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，主要由花青素、葉綠素和類胡蘿卜素含量決定[1]。蘋果果實(shí)色澤由底色和表色共同決定，其中底色主要受葉綠素和類胡蘿卜素含量影響，表色主要受花青素含量影響[2]。在果實(shí)成熟前，多數(shù)品種蘋果底色均呈綠色，隨著果實(shí)成熟果皮葉綠素不斷降解，使底色呈現(xiàn)黃白色，此現(xiàn)象稱為果實(shí)褪綠[3-4]。

植物葉綠素降解主要發(fā)生在葉片衰老和果實(shí)成熟過程中，其降解是一個(gè)多種酶共同調(diào)節(jié)的復(fù)雜過程。目前，已鑒定出6種葉綠素代謝酶(Chl catabolic enzymes，CCEs)調(diào)控葉綠素降解[5]，其中，葉綠素b還原酶(Non-yellow coloring 1，NYC1)[6]、脫鎂葉綠酸a加氧酶(Pheophorbide a oxygenase，PAO)[7-8]、紅色代謝產(chǎn)物還原酶(Red chlorophyll catabolite reductase，RCCR)[9]等葉綠素降解關(guān)鍵酶在多種植物中已得到分離。此外，滯綠基因STAYGREEN(SGR)也是葉綠素降解的關(guān)鍵基因[10]。Armstead等[11]首次在豌豆中鑒定出SGR基因?yàn)槿~綠素降解的關(guān)鍵調(diào)控因子。此后，陸續(xù)從許多植物中克隆鑒定了SGR基因，如水稻[12]、擬南芥[13]和番茄[14]。在高等植物中，SGR基因家族分為2個(gè)亞家族，包括SGR和SGR-LIKE(SGRL)亞家族[14]，單子葉植物[15-16]和雙子葉植物[13，17]中都含有這2個(gè)家族。但在不同的植物類群中同源基因的數(shù)目不同，已有研究表明，擬南芥有3個(gè)SGR同源基因(AtSGR1/NYE1、AtSGR2、AtSGRL)[13]，大豆有5個(gè)SGR同源基因(GmSGR1、GmSGR2、GmSGR3a、GmSGR3b、GmSGR4)[18]，水稻有2個(gè)SGR同源基因(OsSGR、OsSGRL)，柑橘有2個(gè)SGR同源基因(CsSGRa和CsSGRb)[19]。近年來，SGR基因的功能已在水稻[16]、柑橘[19]、擬南芥[20]、番茄[21-22]等物種中有了廣泛的研究。Zhu等[19]研究發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)CsSGRa顯著降低了煙草葉片中葉綠素含量，而超表達(dá)CsSGRb煙草葉片中葉綠素含量沒有明顯變化；CsSGRa突變抑制了棕橙果實(shí)和葉片中葉綠素的降解。Sakuraba等[20]研究發(fā)現(xiàn)，AtSGR2負(fù)調(diào)控?cái)M南芥葉片葉綠素的降解。Hu等[22]通過RNAi干擾沉默番茄中的SlSGR1，降低了番茄葉片和果實(shí)葉綠素的降解。但目前有關(guān)蘋果SGR基因的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。

本研究以成熟澳洲青蘋蘋果果皮為試驗(yàn)材料，克隆獲得MdSGR2基因，并對(duì)其編碼的蛋白結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，構(gòu)建其植物超表達(dá)載體，旨在為進(jìn)一步研究MdSGR2基因在蘋果果皮葉綠素降解中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為澳洲青蘋成熟果實(shí)，種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝試驗(yàn)站。2019年10月下旬進(jìn)行樣品采集，果實(shí)采收后迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，用人工打皮刀取胴體部位的果皮(果皮厚度約1 mm)，錫箔紙包好后液氮速凍，-80 ℃保存待用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1MdSGR2基因克隆 利用熱硼酸法提取蘋果果皮總RNA，經(jīng)瓊脂糖電泳凝膠檢測以及核酸蛋白儀(Thermo ND2000C)測定濃度合格后，利用HiScript lI 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。根據(jù)澳洲青蘋轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果分析得到MdSGR2基因的CDS序列(XM_029098422.1)，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，即上游引物MdSGR2-F：5′-CGAGCTCATGGGCGTTTTGGCTGC-3′，下游引物MdSGR2-R：5′-GGGACTAGTCTAGTTTGATTTGCAC-3′，引物由北京擎科生物科技有限公司合成。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：cDNA 1.0 μL(1 ng/μL)，2×Phanta?Flash Master Mix 25.0 μL，引物(10 μmol/L)各2.0 μL，ddH2O 20.0 μL，共50.0 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收后，與克隆載體pMD-18T連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和菌落PCR檢測后，選取陽性單克隆送往北京擎科生物科技有限公司測序。

1.2.2MdSGR2基因生物信息學(xué)分析 利用ExPASY ProtParam tool(https：//web.expasy.org/protparam/)在線工具分析MdSGR2的理化性質(zhì)；MdSGR2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分別利用SOPMA(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html)和Phyre2(http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)進(jìn)行預(yù)測；利用TMHMM 2.0 Server(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在線軟件預(yù)測MdSGR2蛋白跨膜區(qū)；利用PSORT Ⅱ Prediction(https：//psort.hgc.jp/form2.html)在線軟件分析蘋果MdSGR2蛋白亞細(xì)胞定位；MdSGR2基因啟動(dòng)子分析利用PlantCARE(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)完成。

1.2.3MdSGR2基因超表達(dá)載體的構(gòu)建 將克隆載體pMD-MdSGR2和表達(dá)載體pCAMBIA2301分別用QuickCutTMSacⅠ和QuickCutTMSpeI酶進(jìn)行雙酶切。雙酶切體系：質(zhì)粒(0.5 ng/μL)4 μL；QuickCutTMSacⅠ酶1 μL；QuickCutTMSpeⅠ酶1 μL；Buffer 4 μL；ddH2O 30 μL。雙酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根)分別對(duì)克隆載體目的片段和pCAMBIA2301空載體進(jìn)行回收。隨后將目的片段和空載體按摩爾比1∶3的比例進(jìn)行連接。連接體系為：目的基因1.7 μL，表達(dá)載體5.3 μL，T4連接酶1 μL，Buffer 2 μL，16 ℃過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，選取白色單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證。挑取陽性單克隆送往北京擎科生物科技有限公司測序，將測序正確的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取并保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 MdSGR2基因的克隆

以澳洲青蘋果皮cDNA為模板，使用同源克隆引物MdSGR2-F和MdSGR2-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果獲得與預(yù)期結(jié)果相符的目的片段(圖1)，測序結(jié)果表明，目的基因cDNA序列為840 bp，編碼279個(gè)氨基酸。

M.D2000 DNA Marker；1—4.MdSGR2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。M.D2000 DNA Marker；1—4.PCR products of MdSGR2.

2.2 MdSGR2蛋白同源性分析

利用NCBI網(wǎng)站在線工具Blast檢索得到MdSGR2蛋白的同源蛋白，并進(jìn)行同源性分析。利用DNAMAN進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì)，結(jié)果顯示，MdSGR2蛋白與秋子梨SGR蛋白具有較高同源性(圖2)，其中與秋子梨(KAB2632630.1)同源性為84.12%，與甜櫻桃(XP 021803389.1)的同源性為72.83%，與桃(XP 007209459.1)的同源性為73.55%，與草莓(XP 004298724.1)的同源性為68.68%。

Md.蘋果；Pu.秋子梨；Pp.桃；Pa.甜櫻桃；Fa.草莓。Md.Malus domestica；Pu.Pyrus ussuriensis；Pp.Prunus persica；Pa.Prunus avium；Fa.Fragaria vesca subsp.vesca.

同時(shí)利用ClustalX軟件和MEGA 7.0軟件繪制蘋果與秋子梨、梅、桃、獼猴桃、草莓、杏、陸地棉等物種間的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蘋果MdSGR2與秋子梨聚為一小分支，表現(xiàn)為親緣關(guān)系越近同源性越高。

圖3 蘋果MdSGR2與其他同源蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of MdSGR2 protein and other homologous proteins

2.3 MdSGR2基因編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

利用ExPASY網(wǎng)站在線軟件ProtParam對(duì)MdSGR2基因編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行了理化性質(zhì)分析，結(jié)果表明，MdSGR2基因編碼279個(gè)氨基酸，蛋白分子質(zhì)量為31.27 ku，理論等電點(diǎn)pI為8.52，編碼的蛋白分子式為C1403H2175N391O400S11；由20種氨基酸組成，其中負(fù)電荷氨基酸殘基總數(shù)為29，正電荷氨基酸殘基總數(shù)為33；不穩(wěn)定系數(shù)為46.64，屬于不穩(wěn)定蛋白(小于40為穩(wěn)定)；脂肪指數(shù)為82.19，總平均親水性為-0.291，屬親水性蛋白。

2.4 MdSGR2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

采用SOPMA在線工具對(duì)MdSGR2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測，結(jié)果顯示，其主要由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲和延伸鏈構(gòu)成，其中，α-螺旋占40.50%，β-轉(zhuǎn)角占2.51%，延伸鏈占12.54%，無規(guī)則卷曲占44.44%，α-螺旋、無規(guī)則卷曲占的比例較大。采用在線軟件Phyre2預(yù)測了MdSGR2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示(圖4)，其主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相一致。

圖4 MdSGR2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型Fig.4 Tertiary structure model of MdSGR2 protein

2.5 MdSGR2蛋白結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)、亞細(xì)胞定位預(yù)測

根據(jù)NCBI的Conserved Domain Database(CDD)(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ Structure/cdd/wrpsb.cgi)對(duì)MdSGR2蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了預(yù)測，結(jié)果表明，該蛋白屬于Staygreen超家族，具有很高的保守性。

采用TMHMM 2.0 Server在線軟件預(yù)測了MdSGR2蛋白的跨膜區(qū)，結(jié)果顯示，MdSGR2蛋白不具有跨膜區(qū)，在胞外的可能性比較大，屬于胞外蛋白。

植物體中不同基因編碼的蛋白質(zhì)有不同的存在部位，利用PSORT Ⅱ Prediction在線軟件分析了MdSGR2蛋白的亞細(xì)胞定位，結(jié)果表明，該蛋白定位在線粒體的概率為56.5%，定位在細(xì)胞質(zhì)的概率為13.0%，定位在細(xì)胞核的概率僅有4.3%。

2.6 MdSGR2基因啟動(dòng)子分析

利用PlantCARE對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫中查找到的MdSGR2基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2 000 bp的啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，查找到其所包含的順式作用元件，并對(duì)順式作用元件的種類、序列、功能和數(shù)量進(jìn)行了分析，結(jié)果表明(表1)，MdSGR2基因啟動(dòng)子區(qū)域片段包含ABRE元件，表明該基因受脫落酸的誘導(dǎo)與調(diào)控；MdSGR2基因啟動(dòng)子區(qū)域片段包含CGTCA-motif元件、TGACG-motif元件，表明MdSGR2基因參與茉莉酸甲酯的誘導(dǎo)反應(yīng)；MdSGR2基因啟動(dòng)子區(qū)域片段包含TCA-element元件，表明MdSGR2基因參與水楊酸反應(yīng)；MdSGR2基因啟動(dòng)子區(qū)域片段包含LTR元件，表明MdSGR2基因參與低溫反應(yīng)。

表1 MdSGR2基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件及功能Tab.1 Cis-active elements and functions in the promoter region of MdSGR2

2.7 pCAMBIA2301-MdSGR2超表達(dá)載體構(gòu)建

對(duì)克隆載體pMD-MdSGR2和超表達(dá)載體pCAMBIA2301分別進(jìn)行雙酶切后(圖5-A、B)，回收MdSGR2目的片段和超表達(dá)載體的雙酶切產(chǎn)物，連接轉(zhuǎn)化后，選取陽性菌落測序，將測序正確的菌液進(jìn)行了質(zhì)粒的提取，成功構(gòu)建pCAMBIA2301-MdSGR2植物超表達(dá)載體(圖5-C)。

A.pMD-MdSGR2雙酶切；B.pCAMBIA2301載體雙酶切；C.超表達(dá)載體pCAMBIA2301-MdSGR2鑒定結(jié)果。M.D2000 DNA Marker；1.pMD-MdSGR2質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物；2.pCAMBIA2301載體雙酶切產(chǎn)物；3.超表達(dá)載體pCAMBIA2301-MdSGR2雙酶切產(chǎn)物。

3 結(jié)論與討論

SGR蛋白參與葉片衰老和果實(shí)成熟，其對(duì)植物葉綠素降解至關(guān)重要。在高等植物中，SGR通過激發(fā)多個(gè)葉綠素降解酶與捕光復(fù)合物Ⅱ(Light-harvesting complex Ⅱ，LHCⅡ)相互作用，形成SGR-CCE-LHCⅡ復(fù)合體，進(jìn)而調(diào)控葉綠素的降解[23]。蘋果葉綠素降解程度對(duì)果實(shí)色澤有重要影響，目前研究主要集中于不同植物激素處理對(duì)采后果實(shí)葉綠素降解代謝的影響[24-25]，而有關(guān)SGR基因調(diào)控蘋果果實(shí)葉綠素降解尚未報(bào)道。本研究克隆獲得澳洲青蘋MdSGR2基因，結(jié)構(gòu)域和序列比對(duì)分析表明，MdSGR2蛋白具有典型的Staygreen結(jié)構(gòu)域，屬于Staygreen超家族，與青綠苔草[26]、番茄[27]、黑麥草[28]預(yù)測的結(jié)果相一致。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明，該蛋白位于線粒體的概率最大，為56.5%。而前人在日本結(jié)縷草[29]、水稻[12]、蒺藜苜蓿[12]等SGR蛋白亞細(xì)胞定位的研究結(jié)果顯示，SGR蛋白均定位于葉綠體中，屬于典型的葉綠體蛋白。本研究預(yù)測結(jié)果與前人研究結(jié)果不一致。因此，后續(xù)還需進(jìn)一步構(gòu)建亞細(xì)胞定位載體35S-GFP∷MdSGR2并瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草葉片，經(jīng)共聚焦顯微鏡觀察進(jìn)一步確定MdSGR2蛋白的亞細(xì)胞定位。

MdSGR2基因啟動(dòng)子在線分析結(jié)果表明，該基因啟動(dòng)子區(qū)域片段包含了脫落酸、水楊酸、茉莉酸甲酯多個(gè)激素響應(yīng)元件。前人研究發(fā)現(xiàn)，植物葉片衰老或果實(shí)成熟相關(guān)植物激素參與調(diào)控SGR基因的表達(dá)。張倩麗[30]研究表明，外源ABA處理促進(jìn)了菊花腦葉片的衰老，且促進(jìn)了CnSGR1基因的表達(dá)和葉綠素的降解。Yang等[31]研究表明，在ABA處理下，番茄中過表達(dá)SlSGRL加速了葉片的黃化；酵母雙雜試驗(yàn)表明，SlSGRL主要通過與SlPPPH和SlCHa2相互作用參與ABA誘導(dǎo)的葉綠素降解。Tan等[32]研究發(fā)現(xiàn)，外源施用茉莉酸甲酯(MeJA)加速了卷心菜葉片衰老，且BrPAO1、BrNYC1、BrPPH1和BrSGR1基因的表達(dá)量顯著提高。由此推斷，MdSGR2基因可能亦受果實(shí)成熟相關(guān)植物激素的調(diào)控，這為今后進(jìn)一步研究ABA、MeJA等植物激素對(duì)MdSGR2基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制提供了思路。

目前，構(gòu)建植物表達(dá)載體進(jìn)行模式植物遺傳轉(zhuǎn)化是驗(yàn)證目的基因生物學(xué)功能的有效手段。近年來，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)解析SGR基因調(diào)控植物葉綠素降解生物學(xué)功能的研究已有較多報(bào)道。劉凌云等[26]利用花序侵染法將青綠苔草滯綠基因CbSGR轉(zhuǎn)化擬南芥，過表達(dá)株系表現(xiàn)出黃化，加速了植株的衰老。檀鵬輝等[33]利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將ZjSGR基因整合到煙草基因組中，轉(zhuǎn)基因煙草出現(xiàn)黃化現(xiàn)象，并且提高了煙草中SAG113、SAG12、NCED和AAO3衰老基因的表達(dá)量。周志湘等[34]研究發(fā)現(xiàn)，ZjSGR基因轉(zhuǎn)化至匍匐剪股穎其葉綠素含量明顯加速下降。這些結(jié)果都表明，SGR基因參與調(diào)控多種不同植物中葉綠素降解代謝，因此，本研究構(gòu)建了植物超表達(dá)載體pCAMBIA2301-MdSGR2，進(jìn)一步探究MdSGR2基因在葉綠素降解中的作用。