王兆衛(wèi), 呂亞楠, 胡 正, 楊永廣

（吉林大學(xué)第一醫(yī)院 器官再造與移植教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130061）

高脂血癥又稱血脂譜異常癥，一般特指甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）升高伴或不伴高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）降低的癥狀；臨床上，通常根據(jù)引起高脂血癥的原因?qū)⑵浞譃樵l(fā)性和繼發(fā)性2 類［1］。原發(fā)性高脂血癥是由于遺傳基因缺陷所致，分為單基因高脂血癥和散發(fā)性或多基因高脂血癥；繼發(fā)性高脂血癥的原因主要包括高脂肪飲食與高熱量飲食、肥胖、增齡、不良生活習(xí)慣和某些疾病等。高脂血癥的病理生理過程復(fù)雜，高脂血癥容易引起脂質(zhì)在血管內(nèi)皮的沉積，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS） 和心腦血管等病癥的發(fā)生發(fā)展［2］。AS 是導(dǎo)致心血管疾?。╟ardiovascular disease，CVD） 的主要病理生理基礎(chǔ)，現(xiàn)被認(rèn)為是一種慢性炎癥性疾病。實(shí)驗(yàn)和臨床證據(jù)［3］表明：適應(yīng)性免疫反應(yīng)可加速或抑制AS，包括T 細(xì)胞和B 細(xì)胞在內(nèi)的適應(yīng)性免疫細(xì)胞可以通過分泌不同的細(xì)胞因子或抗體發(fā)揮促炎或抗炎作用。

近年來，研究［4-6］表明：AS 的誘導(dǎo)和進(jìn)展主要與免疫機(jī)制有關(guān)，適應(yīng)性免疫應(yīng)答在AS 的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用。然而，這些研究多數(shù)是在普通小鼠模型中進(jìn)行的。CVD 研究人員采用近交系LDLR-KO C57BL/6J 小鼠作為金標(biāo)準(zhǔn)，然而這種小鼠有很強(qiáng)的T 細(xì)胞亞群偏向，不能完全適用于更為復(fù)雜的人免疫系統(tǒng)研究［7-8］。并且小鼠和人類免疫系統(tǒng)具有很大的差異，這導(dǎo)致從普通小鼠模型中獲得的研究成果通常無法解釋人類的生理或病理問題。免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型為研究高膽固醇對(duì)人體免疫細(xì)胞功能的作用提供了一條新的途徑?？莶萑芫剞D(zhuǎn)化酶9 （proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9） 是一種肝源性分泌蛋白，其與低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein receptor，LDLR）的胞外區(qū)結(jié)合，產(chǎn)生降解作用，進(jìn)而升高血液中的膽固醇水平。研究［9］表明：通過對(duì)NSG 小鼠進(jìn)行高脂喂養(yǎng)和前蛋白轉(zhuǎn)化酶腺相關(guān)病毒8-枯草桿菌蛋白酶/kexin 9 型（adenoassociated virus 8-proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，AAV8-PCSK9） 的感染，可以用于模擬高血脂條件下的人免疫功能異常。但該方法較為復(fù)雜，不易于推廣應(yīng)用。因此，本研究選擇對(duì)NOD/SCID 小 鼠 進(jìn) 行LDLR 基因敲除， 使其LDLR 表達(dá)量減少，使小鼠體內(nèi)LDL-C 水平升高，采用人胎胸腺移植和胎肝CD34+造血干細(xì)胞重建，與人T 細(xì)胞和B 細(xì)胞重建良好［10-12］，以此作為后期免疫系統(tǒng)人源化的基礎(chǔ)。該方法與目前已報(bào)道的策略相比，簡(jiǎn)單且長(zhǎng)效。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器本實(shí)驗(yàn)室自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的NOD SCID LDLR+/－基因編輯小鼠正常膳食喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（吉）2019-0012，按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可管理辦法》 和《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。PCR引物購自吉林省庫美生物科技有限公司，200 bp DNA Ladder（貨號(hào)：MD115-02）購自天根生化科技有限公司，GelStain（貨號(hào)：GS101-03）購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司，10×Loading Buffer（貨號(hào)：9157）、5×PrimeSTAR Buffer（貨號(hào)：R050A） 和dNTP Mixture（貨號(hào)：4030） 購自TaKaRa 寶生物工程（大連）有限公司，瓊脂糖（貨號(hào)：75510019） 購自Thermo 賽默飛世爾科技有限公司，血膽固醇水平測(cè)試試劑盒（貨號(hào)：999-02601） 購自日 本FUJIFILM Cholesterol E kit 公司。酶標(biāo)儀（型號(hào)：SPARK） 購自瑞士TECAN公司， 干式恒溫器 （型 號(hào)： MK-20） 購 自ALLSHENG 杭州奧盛儀器有限公司，PCR 儀（型號(hào)：T100TMThermal Cycler）和凝膠成像系統(tǒng)（型號(hào)： ChemiDocTMXRS+）購自美國(guó)BioRad 公司。

1.2 小鼠模型的構(gòu)建將外顯子exon2-18 刪除，采用百奧賽圖公司基于CRISPR/Cas9 開發(fā)的EGE系統(tǒng)制備基因敲除小鼠。采用Cas9/sgRNA 注射受精卵的方法構(gòu)建基因敲除小鼠時(shí)，由于胚胎早期卵裂速度很快，因此得到的F0 小鼠為嵌合體。將F0 代陽性小鼠與野生型小鼠交配，獲得具有穩(wěn)定基因型的F1 代小鼠。將得到F1 代陽性小鼠與野生型小鼠交配，獲得穩(wěn)定基因型來源的F2 代陽性小鼠，在F2 代陽性小鼠間進(jìn)行合籠擴(kuò)繁，使用F3 代小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 鑒定小鼠基因型的PCR 引物設(shè)計(jì)Mut-F1/WT-R：擴(kuò)增出突變型等位基因的PCR 產(chǎn)物。2 條引物分別設(shè)計(jì)在敲除序列的兩側(cè)。對(duì)于雜合子動(dòng)物，使用該引物進(jìn)行PCR 時(shí)會(huì)得到野生型等位基因的PCR 產(chǎn)物和突變型等位基因的PCR 產(chǎn)物；這2 條PCR 產(chǎn)物的長(zhǎng)度差別很大，野生型等位基因的PCR 產(chǎn)物較長(zhǎng)，而突變型等位基因的PCR 產(chǎn)物較短，行PCR 時(shí)僅能擴(kuò)增出突變型等位基因上的PCR 產(chǎn)物，再進(jìn)行電泳即可顯示出條帶，表示該小鼠有突變型等位基因，反之則沒有該等位基因。WT-F/WT-R：擴(kuò)增出野生型等位基因的PCR 產(chǎn)物，將產(chǎn)物進(jìn)行電泳即可顯示出條帶，表示該小鼠有野生型等位基因，反之則沒有該基因。結(jié)合Mut-F1 / WT-R 的PCR 擴(kuò)增結(jié)果，將可以確定動(dòng)物的具體基因型為純合子/雜合子/野生型。以下將LDLR+/+記 為AA、將LDLR+/－記為Aa。PCR 引物序列：WT-F，5′-TGACCGGGTCCTGGGTACCAT-3′； Mut-F， 5′-TGTACCAGTATGTTAGGAGATCAGGTGG-3′； Mut-R/WT-R， 5′-TGCACCAGGGTCAGTGCAACC-3′ （吉林省庫美生物科技有限公司）。見圖1。

圖1 用于鑒定小鼠基因型的引物設(shè)計(jì)Fig.1 Primer design for idenifying genotypes of mice

1.4 提取和擴(kuò)增小鼠基因剪下約3 mm 的小鼠鼠 尾，加 入30 μL A 液（將0.0399 g NaOH 和0.0234 g EDTA 溶 入40 mL 純 水 中），100 ℃加熱30 min，冷卻后加入等體積的B 液（0.2522 g Tris-HCl 溶入40 mL 純水中） 獲得小鼠基因提取物。野生型等位基因按下述體系和反應(yīng)溫度進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。

野生型等位基因反應(yīng)體系1： 2 μL 5×PrimeSTAR Buffer， 0.8 μ L dNTP Mixture，0.5 μL WT-F 引物，0.5 μL WT-R 引物，0.2 μL PrimeSTAR GXL DNA Polymerase， 3.5 μL ddH2O，2.5 μL 小鼠基因組提取物。野生型等位基因反應(yīng)溫度及步驟1：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s，62 ℃、30 s，72 ℃、30 s，72 ℃、10 min，4 ℃、∞；30 個(gè)循環(huán)。

突變型等位基因按下述體系和反應(yīng)溫度進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。突變型等位基因反應(yīng)體系2：2 μL 5×PrimeSTAR Buffer； 0.8 μL dNTP Mixture；0.5 μL Mut-F 引物；0.5 μL WT-R 引物；0.2 μL PrimeSTAR GXL DNA Polymerase； 3.5 μL ddH2O；2.5 μL 小鼠基因組提取物。突變型等位基因反應(yīng)溫度及步驟2：94 ℃、2 min；98 ℃、10 s，62 ℃、30 s，68 ℃、40 s，68 ℃、10 min，4 ℃、∞，30 個(gè)循環(huán)。

1.5 核酸電泳鑒定小鼠基因型采用TAE 緩沖液、瓊脂糖和熒光核酸染色試劑（GelStain）（×10000）配制成濃度為1.5%瓊脂糖核酸凝膠。將得到的9 μL PCR 產(chǎn)物與1 μL 10×Loading Buffer混勻，加入凝膠的上樣孔里。在120 V 條件下電泳30 min 后，使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察。

1.6 小鼠外周血膽固醇測(cè)定空腹?fàn)顟B(tài)下，采得外周血。離心取上清，將每個(gè)樣品、標(biāo)準(zhǔn)品和空白品（蒸餾水）吸取20 μ L，并預(yù)先標(biāo)記管。添加2 mL 顯色劑?；靹颍?7 ℃孵育5 min。測(cè)量樣品（As）和標(biāo)準(zhǔn)品（Astd）在600 nm 處對(duì)空白的吸光度（A）值。對(duì)于樣品，測(cè)量樣品（As）和標(biāo)準(zhǔn)品（Astd）相對(duì)于空白的A 值，并計(jì)算Csample總膽固醇濃度（mg·dL－1）。Csample=AAs/AAstd×Csta。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組小鼠體質(zhì)量和外周血中膽固醇水平均服從正態(tài)分布，以±s表示，多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間均數(shù)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 F2小鼠基因型鑒定通過堿裂法提取小鼠鼠尾基因組后，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和核酸凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下進(jìn)行觀察。野生型等位基因小鼠基因條帶和突變型等位基因小鼠基因條帶見圖2 和3（圖中標(biāo)注為小鼠耳號(hào)）。鑒定每只小鼠的基因型并記錄小鼠基因型的數(shù)量，經(jīng)過繁育后得到的AA 數(shù)量是22 只，Aa 數(shù)量是32 只。在得到繁育小鼠中，挑選得到相同周齡的小鼠，并進(jìn)行分組。總共分為4 組，每組各5 只，分別為雄性AA、雄性Aa、雌性AA 和雌性Aa。

圖2 野生型等位基因電泳圖Fig.2 Electrophoregram of wild type alleles

圖3 突變型等位基因電泳圖Fig.3 Electrophoregram of mutant type alleles

2.2 各組小鼠體質(zhì)量在各組小鼠成年后，進(jìn)行體質(zhì)量監(jiān)測(cè)。 隔2 周記錄小鼠體質(zhì)量，各組小鼠體質(zhì)量逐漸升高，記錄各組小鼠體質(zhì)量以±s表示。與雄性小鼠比較，雌性小鼠體質(zhì)量普遍較?。≒＜0.05）。相同性別的不同基因型小鼠之間的體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組小鼠每周體質(zhì)量Tab.1 Body weights of mice every week in various groups （n=5，±s，m/g）

表1 各組小鼠每周體質(zhì)量Tab.1 Body weights of mice every week in various groups （n=5，±s，m/g）

*P＜0.05 compared with male AA group；△P＜0.05 compared with male Aa group.

Group Male AA Male Aa Female AA Female Aa Body weight(week) 023.30±1.7422.60±2.7016.90±0.20*△17.80±0.89*△225.20±0.6624.34±2.4619.23±0.59*△19.67±0.64*△426.90±1.2125.26±2.9320.93±0.97*△21.67±0.06*△627.77±0.8526.16±2.3521.15±1.77*△21.63±0.74*△829.50±0.7528.78±1.6522.35±0.92*△23.10±1.05*△

2.3 各組小鼠外周血中膽固醇水平體質(zhì)量監(jiān)測(cè)結(jié)束后，取小鼠外周血，進(jìn)行小鼠外周血中膽固醇水平檢測(cè)。雄性AA 小鼠膽固醇水平為（75.43±10.06） mg·dL－1，雌性AA 小鼠膽固醇水平為（60.78±2.11） mg·dL－1，雄性Aa 小鼠膽固醇水平為（120.56±11.16）mg·dL－1，雌性Aa 小鼠的膽固醇水平為（100.80±4.42） mg·dL－1。與AA基因型比較，Aa 基因型小鼠血中膽固醇水平明顯升高（P＜0.05）。

3 討論

全世界每年死于心腦血管疾病的人數(shù)高達(dá)1500 萬人，居各種死因首位，全球?qū)π难茴愃幬锏男枨蟪掷m(xù)增長(zhǎng)。LDL-C 升高，而由其引起的血脂異常被認(rèn)為是AS 等CVD 發(fā)生的主要原因。LDLR 是機(jī)體通過內(nèi)吞機(jī)制清除血液中LDL-C 的關(guān)鍵受體，在維持體內(nèi)膽固醇代謝平衡方面具有核心地位［4］。

脂質(zhì)與適應(yīng)性免疫細(xì)胞之間的相互作用及與這些細(xì)胞類型相關(guān)的共刺激和共抑制途徑一直是心血管疾病研究的重點(diǎn)。高膽固醇血癥可刺激適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，促進(jìn)AS 等炎癥性疾病的發(fā)生。膽固醇在T 細(xì)胞的活化和增殖中起重要作用［13］。最新研究［14］表明：高膽固醇血癥可調(diào)節(jié)肝臟中分化的T細(xì)胞亞群， 并通過增加轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1） 介 導(dǎo) 肝內(nèi)Treg 和Th17 分化，誘導(dǎo)肝臟耐受，導(dǎo)致肝臟呈特異性免疫抑制狀態(tài)。但當(dāng)嚴(yán)重的高膽固醇血癥引起肝臟炎癥時(shí)，則會(huì)抑制肝臟耐受性誘導(dǎo)，阻礙肝內(nèi)Treg 分化，而促進(jìn)AS 的Th1 分化。

調(diào)節(jié)膽固醇代謝可以影響CD4+T 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞的增殖和效應(yīng)功能［15-16］。T 細(xì)胞是AS病變中主要白細(xì)胞類型之一［17］。在斑塊病變中，分布最為豐富的適應(yīng)性免疫細(xì)胞為CD4+T 細(xì)胞，也可觀察到少量CD8+T 細(xì)胞。在疾病進(jìn)程中，CD4+T 細(xì)胞可以分化成不同類型的輔助性T 細(xì)胞亞型，而這些具有免疫抑制或免疫激活作用的輔助性T 細(xì)胞亞型可以發(fā)揮直接抗炎或促炎作用。同時(shí)CD4+T 細(xì)胞功能表型可因內(nèi)環(huán)境的改變而發(fā)生改變，隨之其作為調(diào)節(jié)細(xì)胞和炎性細(xì)胞發(fā)揮功能的相對(duì)能力也會(huì)發(fā)生變化［17］。

AS 形成時(shí)會(huì)發(fā)生動(dòng)脈周圍及全身的B 細(xì)胞反應(yīng)，心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)也取決于B 細(xì)胞的增殖和活化狀態(tài)。B 細(xì)胞產(chǎn)生的抗體可抑制細(xì)胞對(duì)氧化低密度 脂 蛋 白 （oxidized low density lipoprotein，OxLDL）顆粒的攝取，也可以通過與多種免疫細(xì)胞表面表達(dá)的Fc 受體相互作用來發(fā)揮功能［18］。研究［19］表明：B 細(xì)胞除了具有產(chǎn)生抗體的功能外，也充當(dāng)主要抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）激活幼稚CD4+T 細(xì)胞并促進(jìn)其分化。

但近年來的研究［20］顯示：高膽固醇血癥在活化小鼠與人類T 細(xì)胞亞群的分化過程中存在明顯差異。在對(duì)LDLR－/－小鼠研究［21］中，當(dāng)嚴(yán)重高膽固醇血癥引起肝臟炎癥時(shí)，肝臟中Treg 的分化被阻斷，進(jìn)而促進(jìn)AS 的Th1 的分化被促進(jìn)。臨床高脂血癥患者表現(xiàn)為Th2 的比例增加。因此，采用傳統(tǒng)小鼠模型研究人體免疫系統(tǒng)與高膽固醇血癥之間的關(guān)系不合適。為了解決將非人類動(dòng)物模型中的研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用的局限性，研究人員設(shè)計(jì)并開發(fā)了人源化小鼠模型，以求在細(xì)胞和分子水平上模擬人類［22-23］。近年來研發(fā)的具有人類免疫系統(tǒng)的人源化小鼠模型已廣泛應(yīng)用于理解疾病的發(fā)病機(jī)制和評(píng)估藥物對(duì)于人類疾病的治療，研究的疾病主要包括癌癥、傳染病、自身免疫疾病及移植物抗宿主病等。目前應(yīng)用最廣的具有人類免疫系統(tǒng)的人源化小鼠模型是Hu-BLT 小鼠模型，該模型是將免疫缺陷小鼠經(jīng)亞致死劑量輻照處理后，將人胎肝和胸腺組織移植到小鼠腎臟被膜下，同時(shí)靜脈注射同一個(gè)體的造血干細(xì)胞［10］。因此，構(gòu)建可以發(fā)生高脂血癥的免疫缺陷小鼠模型是研究人體免疫系統(tǒng)與高膽固醇血癥間的關(guān)系的基礎(chǔ)。

LDLR 是分布于細(xì)胞表面網(wǎng)格蛋白包膜竇區(qū)的一種內(nèi)吞受體，其能結(jié)合并內(nèi)化LDL 和載脂蛋白b-100 及載脂蛋白E，是維持哺乳動(dòng)物脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵受體［12］。LDLR 廣泛分布于多種組織和細(xì)胞，尤其是肝臟。肝臟是應(yīng)對(duì)膳食膽固醇攝入的核心器官，其有助于脂蛋白顆粒的釋放和清除。增加LDLR 的表達(dá)可降低血漿膽固醇水平。綜上，在NOD/SCID 小鼠的基礎(chǔ)上進(jìn)行基因編輯，通過合籠雜交獲得LDLR+/－的雜合子與野生型小鼠。本研究結(jié)果顯示：在經(jīng)過普通飼料喂養(yǎng)8 周后，小鼠體質(zhì)量均增加，不同性別小鼠的體質(zhì)量有區(qū)別，與雌性小鼠比較，雄性小鼠體質(zhì)量較大?？崭箿y(cè)得外周血中膽固醇水平有明顯變化，其中與野生型小鼠比較，雄性小鼠和雌性小鼠中基因突變型雜合子的血中膽固醇水平較高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在繁育飼養(yǎng)過程中，研究發(fā)現(xiàn)未出現(xiàn)LDLR－/－的純合子的NOD/SCID 小鼠，出現(xiàn)這種情況的的原因暫不明確，也未見有關(guān)報(bào)道，對(duì)此現(xiàn)象還有待研究發(fā)現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示：通過對(duì)LDLR 基因編輯，實(shí)現(xiàn)了免疫缺陷小鼠自發(fā)性血脂水平的升高，并有望通過高脂喂養(yǎng)進(jìn)一步提高血脂水平，為研究高血脂環(huán)境下人免疫系統(tǒng)的反應(yīng)與機(jī)制提供了新方法。