佘序華，馮麗平，黃玉梅，秦繼勝

廣西桂林市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 廣西桂林 541004

慢性宮頸炎（chronic cervicitis，CC）是臨床常見的女性生殖道炎癥性疾病，其病理表現(xiàn)是宮頸間質(zhì)中大量炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，最常見的局部病理特征是宮頸糜爛，以陰道分泌物增多、接觸性出血、腰骶部疼痛等為主要癥狀表現(xiàn)[1-3]。慢性宮頸炎屬于中醫(yī)學(xué)帶下病范疇，本文所研究的四妙四逆散是根據(jù)其濕熱下注的基本病機(jī)所創(chuàng)制的臨床有效經(jīng)驗(yàn)方[4-5]，由柴胡、黃柏、白芍、蒼術(shù)、枳實(shí)、薏苡仁、牛膝、甘草八味中藥組成，具有清熱利濕止帶，疏肝解郁理氣功效，廣泛運(yùn)用于慢性宮頸炎的臨床治療，具有抑制病原體感染，促進(jìn)炎癥因子的吸收，改善微循環(huán)，增強(qiáng)自身免疫調(diào)節(jié)等作用。本研究為進(jìn)一步探究四妙四逆散治療慢性宮頸炎的潛在機(jī)制，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法及分子對(duì)接技術(shù)探討其核心化合物及核心靶點(diǎn)的相互作用，為四妙四逆散的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

材料與方法

1 篩選四妙四逆散的有效化合物及靶點(diǎn)

運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（http://tcmspw.com/tcmsp.php）篩選四妙四逆散中符合口服生物利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18的有效化合物，并通過進(jìn)行靶點(diǎn)注釋。

2 篩選四妙四逆散治療慢性宮頸炎的作用靶點(diǎn)及化合物

通 過GeneCards數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https：//www.genecards. org）檢索“chronic cervicitis”相關(guān)的疾病靶點(diǎn)，在Venny軟件中導(dǎo)入四妙四逆散的有效靶點(diǎn)及慢性宮頸炎的疾病靶點(diǎn)并篩選交集基因，獲得作用靶點(diǎn)。

3 構(gòu)建四妙四逆散治療慢性宮頸炎的中藥-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

在Cytoscape 3.8.2軟件導(dǎo)入作用靶點(diǎn)和化合物，構(gòu)建四妙四逆散治療慢性宮頸炎的“中藥-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)并對(duì)該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行核心成分分析。選擇高連接度的化合物作為核心成分。

4 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)及拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)

在Cytoscape 3.8.2軟件導(dǎo)入作用靶點(diǎn)，選擇Between Centrality、Closeness Centrality、Degree Centrality進(jìn)行分析，構(gòu)建拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)并篩選樞紐靶點(diǎn)。在String數(shù)據(jù)庫(kù)（http://string-db.org）導(dǎo)入作用靶點(diǎn)，構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，篩選核心靶點(diǎn)。

5 四妙四逆散治療慢性宮頸炎的GO和KEGG富集分析

使用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/）和KEGG（https://www.kegg.jp/）對(duì)四妙四逆散治療慢性宮頸炎的靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論和KEGG富集分析和可視化。

6 四妙四逆散治療慢性宮頸炎的核心靶點(diǎn)與成分的分子對(duì)接

在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.rcsb.org/）及pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載核心靶點(diǎn)及成分結(jié)構(gòu)，運(yùn)用AutoDock軟件進(jìn)行去水、加氫及計(jì)算電荷處理后以蛋白自帶配體為中心構(gòu)建對(duì)接口袋，并進(jìn)行分子對(duì)接計(jì)算結(jié)合能分值。最后選擇對(duì)接分值最佳的受體-配體結(jié)構(gòu)進(jìn)行繪圖。

結(jié) 果

1 四妙四逆散的有效化合物及靶點(diǎn)

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)共篩選得到155個(gè)有效化合物，其中柴胡12、黃柏25、白芍8個(gè)、蒼術(shù)4、枳實(shí)18、薏苡仁6、牛膝15、甘草88。對(duì)所得化合物進(jìn)行基因注釋，共得到259種有效靶點(diǎn)。

2 四妙四逆散治療慢性宮頸炎的作用靶點(diǎn)

檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)得到與慢性宮頸炎相關(guān)的疾病靶點(diǎn)共5526個(gè)，運(yùn)用Venny軟件與四妙四逆散的259個(gè)有效靶點(diǎn)進(jìn)行取交集后，最終獲得四妙四逆散治療慢性宮頸炎的作用靶點(diǎn)共215個(gè)。

3 四妙四逆散治療慢性宮頸炎的中藥-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

在Cytoscape3.8.2軟件中構(gòu)建四妙四逆散治療慢性宮頸炎的“中藥-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)（圖1），連接度排名在前4位的化合物依次為Quercetin（槲皮素）、luteolin（木犀草素）、kaempferol（山奈酚）、wogonin（黃芩素），即是四妙四逆散治療慢性宮頸炎的核心化合物。

圖1 中藥-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

在cytoscape3.8.2中導(dǎo)入215個(gè)作用靶點(diǎn)，構(gòu)建拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)（圖2），得到四妙四逆散治療慢性宮頸炎作用靶點(diǎn)中的樞紐靶點(diǎn)。同時(shí)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建靶點(diǎn)所編碼的蛋白質(zhì)之間相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖（圖3），根據(jù)連接度排名將蛋白進(jìn)行條形排列（圖4），連接度排名在前4位的作用靶點(diǎn)依次為AKT1（絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶）、IL6（白細(xì)胞介素-6）、MAPK3（絲裂原活化蛋白激酶3）、VEGFA（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A），這與拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)得到的樞紐靶點(diǎn)結(jié)果一致，因此認(rèn)為AKT1、IL6、MAPK3及VEGFA即為四妙四逆散治療慢性宮頸炎的核心靶點(diǎn)。

圖2 四妙四逆散治療慢性宮頸炎的拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)

圖3 作用靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 作用靶點(diǎn)的節(jié)點(diǎn)數(shù)量條形圖

5 四妙四逆散治療慢性宮頸炎的GO及KEGG富集結(jié)果

四妙四逆散治療慢性宮頸炎的GO 富集結(jié)果共包含2492生物過程（biological process）、135個(gè)細(xì)胞成分（cellular component）及212個(gè)分子功能（Molecular Function）。結(jié)果顯示四妙四逆散治療慢性宮頸炎中所調(diào)節(jié)的生物過程和分子功能主要涉及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄、蛋白結(jié)合、抗炎、抗氧化、促進(jìn)免疫應(yīng)答等方面。KEGG富集共獲得173 條通路，其中得到四妙四逆散與慢性宮頸炎的相關(guān)的通路有PI3K-Akt信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、p53信號(hào)通路等。

6 分子對(duì)接

分子對(duì)接結(jié)果顯示槲皮素、木犀草素、山奈酚、黃芩素等核心化合物與 AKT1、IL-6、MAPK3及VEGFA 等核心靶點(diǎn)具有較好的對(duì)接，其中有4對(duì)接結(jié)果的結(jié)合能＜-9.0（圖5），且均來自AKT1與四個(gè)核心化合物的對(duì)接，因此推測(cè)AKT1可能是四妙四逆散治療慢性宮頸炎的重要靶點(diǎn)。

圖5 分子對(duì)接結(jié)合能結(jié)果

討 論

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對(duì)接技術(shù)探討四妙四逆散治療慢性宮頸炎的作用機(jī)制，結(jié)果顯示四妙四逆散治療慢性宮頸炎具有多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。其作用核心化合物槲皮素、木犀草素、山奈酚、漢黃芩素均屬于黃酮類化合物，大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)黃酮類化合物具有調(diào)控細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤生長(zhǎng)、提高抗氧化、清除自由基、抗炎抑菌、抑制血管生成、提高機(jī)體免疫應(yīng)答等作用。朱慧敏[6]發(fā)現(xiàn)槲皮素能抑制宮頸炎大鼠宮頸組織中炎性因子的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)。馮艷紅等[7]研究顯示槲皮素能抑制宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖，且與槲皮素濃度及作用時(shí)間呈正相關(guān)。潘磊等[8]發(fā)現(xiàn)木犀草素能通過抑制Ras-MAPK信號(hào)通路及其下游MMP9、Cyc D1、VEGF等蛋白表達(dá)，發(fā)揮促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖遷移的作用。王穎等[9]研究顯示木犀草素能抑制宮頸癌細(xì)胞增殖遷移，推測(cè)其機(jī)制可能與抑制PI3KAKT信號(hào)通路活化，抑制其增殖、遷移的相關(guān)蛋白表達(dá)相關(guān)。蔡云朗等[10]發(fā)現(xiàn)山奈酚能抑制子宮肌瘤細(xì)胞增殖，下調(diào)ER、IGF1和VEGF等蛋白及基因表達(dá)。漢黃芩素還具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞侵襲及血管生成等多方面活性作用[11]。

四妙四逆散治療慢性宮頸炎的蛋白拓?fù)浞治黾暗鞍谆プ骶W(wǎng)絡(luò)顯示其核心靶點(diǎn)為AKT1、IL6、MAPK3及VEGFA。AKT1是PI3K/AKT通路的中樞靶點(diǎn)，活化的AKT1可調(diào)節(jié)其多個(gè)下游靶標(biāo)發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡、細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移、DNA修復(fù)、細(xì)胞周期及血管生成等作用[12-14]。杜趁香等[15]發(fā)現(xiàn)AKT1在慢性宮頸炎及宮頸癌病變組織中呈高表達(dá)，劉小葉[16]發(fā)現(xiàn)通過下調(diào)AKT1蛋白的表達(dá)可達(dá)到抑制宮頸癌細(xì)胞增殖的作用。IL6作為一種細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的核心介質(zhì)，參與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)及腫瘤細(xì)胞增殖。邵丹等[17]研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者血清中IL-6水平明顯升高，且與病情進(jìn)展程度呈正相關(guān)。磷酸化激活后的MAPK3參與從細(xì)胞骨架變化到基因轉(zhuǎn)錄的各種細(xì)胞反應(yīng)，具有調(diào)控細(xì)胞周期和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抑制細(xì)胞增殖分化、誘導(dǎo)免疫應(yīng)答及維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)等作用[18-19]。曹學(xué)全等[20]研究發(fā)現(xiàn)在慢性宮頸炎、宮頸炎組織中MAPK3蛋白呈高表達(dá)，且其升高水平與疾病進(jìn)展相關(guān)。蔣丹[21]發(fā)現(xiàn)MAPK3在宮頸癌組織中呈高表達(dá)水平，且與凋亡抑制基因bcl-2在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中存在協(xié)同作用。VEGFA是一種血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，參與調(diào)控血管形態(tài)和功能，可誘導(dǎo)腫瘤血管生成，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展起重要作用。朱迎萍等[22]運(yùn)用自擬宮頸方治療宮頸炎模型大鼠，發(fā)現(xiàn)大鼠宮頸組織的炎癥程度與VEGFA、NF-KB等蛋白的表達(dá)水平有關(guān)。徐美容等[23]研究發(fā)現(xiàn)VEGFA在慢性宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌組織中的表達(dá)呈逐漸上升趨勢(shì)，且其表達(dá)水平還與宮頸間質(zhì)浸潤(rùn)深度、腫瘤直徑等相關(guān)，可作為宮頸癌組織中的生物標(biāo)志物。

分子對(duì)接結(jié)果顯示四妙四逆散的核心化合物與其核心靶點(diǎn)有較好的結(jié)合作用，其中 AK1與槲皮素、木犀草素、山奈酚、黃芩素的相互作用更佳，推測(cè)AK1可能是四妙四逆散核心化合物干預(yù)的主要靶點(diǎn)。其作用靶點(diǎn)富集的GO功能涉及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄、蛋白結(jié)合、抗炎、抗氧化、促進(jìn)免疫應(yīng)答等多個(gè)方面。通路富集結(jié)果顯示四妙四逆散治療慢性宮頸炎治療可能通過調(diào)控PI3K-Akt、p53、TNF、HIF-1、IL-17、Th17 細(xì)胞分化等信號(hào)通路達(dá)到抑制細(xì)胞增殖、抑制腫瘤血管生成、提高腫瘤免疫應(yīng)答等作用。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接方法發(fā)現(xiàn)四妙四逆散治療慢性宮頸炎具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的作用特點(diǎn)，結(jié)合核心靶點(diǎn)富集的GO與通路結(jié)果，推測(cè)四妙四逆散治療慢性宮頸炎可能通過槲皮素、木犀草素、山奈酚、漢黃芩素等化合物調(diào)節(jié)AKT1、IL6、MAPK3及VEGFA等蛋白水平，發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞信號(hào)周期、抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管生成、抗炎、抗氧化、促進(jìn)免疫應(yīng)答等作用。