徐小港，徐義峰，王鈺，董辛，章德林，鄭琴，3

1 江西中醫(yī)藥大學(xué) 江西南昌 330004 2 江西中醫(yī)藥大學(xué)科技學(xué)院 江西南昌 330004 3 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江西南昌 330004

龔?fù)①t，明代御醫(yī)，江西金溪人，被譽(yù)為“醫(yī)林狀元”。龔氏不僅秉承家學(xué)，且博綜諸家，以制方萃味，用藥精簡著稱，廣泛涉獵臨床各科，可謂地方醫(yī)學(xué)流派的一代大家。他一生精究醫(yī)源，勤于筆耕，所撰著作達(dá)二十余種。龔氏對于中風(fēng)的病證之源、方藥之制詳審縝密，考古證今，對現(xiàn)代臨床相關(guān)疾病診療具有一定的借鑒意義。

中風(fēng)原指感受風(fēng)邪所引起的疾病，在《醫(yī)學(xué)三字經(jīng)》中有“人百病，首中風(fēng)”之稱。古代醫(yī)家對本病的理解與詮釋不盡相同，其內(nèi)涵與范疇也較為廣泛，主要以口舌歪斜、半身不遂等突發(fā)性癥狀為共同特征。隨著中醫(yī)行業(yè)規(guī)范與標(biāo)準(zhǔn)的建立，中風(fēng)的概念漸趨明確，現(xiàn)指代缺血性腦卒中及腦梗塞等疾病，屬于中醫(yī)內(nèi)科重大病證之一。本病是全球第二大死亡原因，且已成為中國成年人首要致死及致殘疾病[1]， 其中40歲以上成年人中風(fēng)患病率為2.06%[2]，造成了嚴(yán)重的社會負(fù)擔(dān)[3-4]。

從中風(fēng)的病因病機(jī)而論，龔?fù)①t在《萬病回春》中指出：“真中風(fēng)者，中時(shí)卒倒，皆因體氣虛弱，榮衛(wèi)失調(diào)，或喜怒憂思悲恐驚，或酒色勞力所傷，以致真氣耗散，腠理不密，風(fēng)邪乘虛而入，乃其中也”。對于本病的辨證，龔氏善于通過患者脈象細(xì)審明析及判斷預(yù)后，《壽世保元》有載：“夾寒則脈帶浮遲，夾暑則脈虛，夾濕則脈澀。大法浮遲者吉，急疾大數(shù)者兇”。在中風(fēng)的治療上，他強(qiáng)調(diào)應(yīng)精準(zhǔn)辨明病因，理清中腑、中臟、中經(jīng)絡(luò)及兼夾證候，變通而治之。如對于中風(fēng)有昏冒現(xiàn)象者，《魯府禁方》主張宜用通關(guān)之藥，即“先用皂角、細(xì)辛等分為末，每用少許吹入鼻中，有嚏可治，隨用吐法”。鑒于龔?fù)①t在中風(fēng)診治方面的良好療效與鮮明特色，本研究采用現(xiàn)代信息技術(shù)，通過數(shù)據(jù)挖掘闡明其治療中風(fēng)的用藥規(guī)律與學(xué)術(shù)思想，并提取核心藥物組合。采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析其生物學(xué)作用機(jī)制，以期為中風(fēng)的臨床用藥及相關(guān)實(shí)驗(yàn)提供理論參考，具體研究流程圖如下。

材料與方法

1 處方來源與處理

處方均來源于《龔延賢醫(yī)學(xué)全書》[5]中所包含的《魯府禁方》、《萬病回春》、《壽世保元》、《濟(jì)世全書》四書中治療中風(fēng)的方劑。

1.1 篩選標(biāo)準(zhǔn) ①納入所載處方有明確的藥物組成、服用方式為內(nèi)服；②排除處方為單味藥物、用藥方式為外用、《中藥學(xué)》[6]、2020版《中國藥典》[7]及《中藥大辭典》[8]均不收錄的藥物；③組成重復(fù)的處方僅記錄一次。

1.2 數(shù)據(jù)的規(guī)范與數(shù)據(jù)庫的建立 根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)，確定納入處方，依照《中藥學(xué)》及2020版《中國藥典》，對中藥藥名進(jìn)行規(guī)范，并且作為性味、歸經(jīng)統(tǒng)計(jì)參照，《中藥大辭典》作為補(bǔ)充。如仙靈脾規(guī)范為淫羊藿，淮安陳曲規(guī)范為陳皮、神曲，當(dāng)歸尾規(guī)范為當(dāng)歸，遼五味子規(guī)范為五味子，將1.1.1提及的未收錄藥物，予以剔除，如腦末、洛陽花等，按《中藥學(xué)》對中藥功效進(jìn)行歸類，最后通過Ms Excel 2016建立龔延賢治療中風(fēng)方藥數(shù)據(jù)庫。

1.3 數(shù)據(jù)分析 對數(shù)據(jù)庫中單味藥、性味、歸經(jīng)，功效分類進(jìn)行頻數(shù)、頻率分析，采用IBM SPSS Modeler 18.0[9-11]軟件對藥物進(jìn)行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析并提取核心藥物組合（支持度最高），運(yùn)用IBM SPSS Statistics 26.0進(jìn)行聚類分析[12-13]。

2 核心藥物組合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.1 藥物的成分及靶點(diǎn)收集 在中醫(yī)分子機(jī)理生物學(xué)信息分析工具（BATMAN-TCM，http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）依次檢索麥冬-肉桂的有效成分及靶點(diǎn)，檢索條件為Score cutoff≥20、P-value cutoff＜0.05[14]。

2.2 疾病的靶點(diǎn)收集及Venny分析 因缺血性腦卒中占中風(fēng)發(fā)病率的80%以上，具有致死率和致殘率高的特點(diǎn)[15]。為更加明確藥物的作用機(jī)制，故以缺血性腦卒中為主要研究對象，并將缺血性腦卒中（cerebral ischemic stroke）、腦梗死（cerebral infarction）和腦缺血再灌注（cerebral ischemia reperfusion）為關(guān)鍵詞，在人類在線孟德爾遺傳平臺OMIM（https://omim.org/）以及DrugBank（https://www.drugbank.ca）中檢索相關(guān)基因，并與藥對中有效成分靶基因進(jìn)行映射對比篩選出藥對治療缺血性腦卒中的作用靶點(diǎn)。將藥物的靶點(diǎn)與疾病的相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入hiplot （https://hiplot.com.cn/），得到麥冬-肉桂治療中風(fēng)的潛在作用靶點(diǎn)。

2.3 “藥對-化合物-基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 結(jié)合藥物成分及1.2.2所得潛在作用靶點(diǎn)，導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建 “藥對-化合物-基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)，并運(yùn)用其中Network Analysis分析有效成分的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，以確定核心成分。

2.4 作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”，最小互相作用閾值設(shè)為“medium confidence”（＞0.4），得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖及保存TSV格式的PPI數(shù)據(jù)，將PPI數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入Cytoscape3.7.1中的Network Analysis分析有效成分的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)。

2.5 富集分析 將作用靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/），Select Identifier設(shè) 置 為“OFFICIAL GENE SYMBOL”，“Select species”設(shè)置為“Homo sapiens”，設(shè)定P＜0.05，實(shí)現(xiàn)GO功能富集分析和KEGG通路富集分析[16-17]。

結(jié) 果

1 數(shù)據(jù)分析

1.1 高頻藥物頻次、歸經(jīng)統(tǒng)計(jì) 共錄入94首處方，根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)，最終納入63首處方，總計(jì)163味藥物，進(jìn)行“頻次統(tǒng)計(jì)”，藥物總頻次達(dá)1029次，高頻藥物（頻次＞16，下同）共計(jì)20味，頻次最高的藥物為甘草出現(xiàn)35次，其次是茯苓、防風(fēng)、當(dāng)歸、川芎，高頻藥物歸經(jīng)以脾、肺、肝為主。見圖2。

圖2 高頻藥物頻次、歸經(jīng)分布聚類圖（頻次＞16次）

1.2 藥物功效分類統(tǒng)計(jì) 將涉及的163味藥物功效分類和頻次統(tǒng)計(jì)分析，共涵蓋19種功效分類，主要集中在補(bǔ)虛藥（255次，24 .78%），解表藥（163次，15.84%）。見圖3。

1.3 藥物性味統(tǒng)計(jì) 將涉及的163味藥物進(jìn)行性味統(tǒng)計(jì)分析。同一味藥物的多個(gè)藥性、藥味分別統(tǒng)計(jì)入內(nèi)。藥性中主要集中在溫（552次，33.22%）＞寒（195次，28.10%）＞平（187次，25.34%），藥味主要集中在辛（565次，54.33%）＞甘（195次，19.15%）＞苦（187次，18.41%），見圖4。

圖4 藥物性味頻次分布圖

1.4 藥物歸經(jīng)統(tǒng)計(jì) 將涉及的163味藥物進(jìn)行歸經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析。按照頻數(shù)由高到低的順序進(jìn)行排序，歸經(jīng)前3位為脾經(jīng)、肺經(jīng)、肝經(jīng)，累計(jì)頻次均＞400，其頻率依次為18.83%，15.65%，14.13%，其排名與2.1.1中高頻藥物結(jié)果相符，可驗(yàn)證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，見圖5。

圖5 藥物歸經(jīng)頻次分布圖

1.5 關(guān)聯(lián)規(guī)則 運(yùn)用IBM SPSS Modeler 18.0軟件進(jìn)行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，并建立“數(shù)據(jù)源（EXCEL）→類型→網(wǎng)絡(luò)”數(shù)據(jù)流，設(shè)置支持度為30%，置信度為80%，最大前項(xiàng)數(shù)為3，提升度＞1等條件進(jìn)行關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)可視化，再使用Apriori 算法建模，挖掘藥物之間的配伍規(guī)律，得到龔?fù)①t治療中風(fēng)的潛在核心藥物組合（麥冬-肉桂），見圖6。

圖6 藥物關(guān)聯(lián)圖

1.6 聚類分析 采用SPSS Statistics 26.0中的組間聯(lián)接，選擇皮爾遜相關(guān)性，對20味高頻藥物進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，生成樹狀圖（圖7），和冰柱圖（圖8）。結(jié)合專業(yè)知識，分析出5個(gè)多味藥物聚類組合，類1：陳皮、半夏、甘草、茯苓；類2：白術(shù)、黃芩；類3：防風(fēng)、川芎、當(dāng)歸、白芍；類4：白芷、細(xì)辛、天麻；類5：生地黃、熟地黃、羌活，見圖7、圖8。

圖7 高頻藥物聚類樹狀圖

圖8 高頻藥物聚類冰柱圖

2 核心藥物組合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.1 藥物的成分及靶點(diǎn)收集 從BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫中得到麥冬、肉桂有效活性成分共34個(gè)，其中麥冬18個(gè)，肉桂16 個(gè)。同時(shí)收集活性成分相關(guān)作用靶點(diǎn)，其中麥冬305個(gè)，肉桂559個(gè)，去除重復(fù)靶點(diǎn)后，共得到靶點(diǎn)547個(gè)。

2.2 疾病的靶點(diǎn)收集及Venny分析 疾病靶點(diǎn)共收集到200個(gè)人，其中DrugBank59個(gè)，OMIM141個(gè)，去除重復(fù)靶點(diǎn)，共得到靶點(diǎn)194個(gè)，將麥冬-肉桂作用靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行Venny分析，獲得麥冬-肉桂活性成分作用靶點(diǎn)映射于疾病的潛在作用靶點(diǎn)27個(gè)，見圖9。

圖9 麥冬-肉桂治療中風(fēng)靶點(diǎn)venny圖

2.3 “藥對-化合物-基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 運(yùn)用Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建“藥物-化合物-基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖， 可直觀地顯示藥物與基因之間的關(guān)系，圖形節(jié)點(diǎn)（紫色）為活性成分，正方形（藍(lán)色）為藥物與疾病，菱形（綠色）為基因，面積越大說明該節(jié)點(diǎn)越重要。共包含34個(gè)化合物，根據(jù)結(jié)果顯示，豆甾醇（Stigmasterol）、鳥嘌呤核苷（Guanosine hydrate）、茴香烯（Anethole）等34個(gè)成分為治療中風(fēng)的潛在活性成分，見圖10。

圖1 研究流程圖

圖10 “藥物-化合物-基因”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 用STRING數(shù)據(jù)庫得到27個(gè)作用靶點(diǎn)之間的關(guān)系，并保存TSV文件，將其導(dǎo)入Cytoscape3.7.1，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖，利用內(nèi)置Network Analysis分析有效成分的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，發(fā)現(xiàn)TNF、PTGS2、ACE、ADRA1A、PDE4A、PTGS1、PDE5A等節(jié)點(diǎn)度值較高，其中TNF和其他基因的相互作用最強(qiáng)，提示其可能參與的藥理作用最為明顯，見圖11。

圖11 共同基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 富集分析 通過DAVID數(shù)據(jù)庫對麥冬-肉桂藥對作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析與KEGG通路富集分析，設(shè)置閾值P＜0.05，利用Hiplot對結(jié)果進(jìn)行可視化。GO富集分析得到88個(gè)條目，包括生物學(xué)過程（BP）50條、細(xì)胞組成（CC）17條和分子功能（MF）21條，主要有3'， 5'-cyclic-nucleotide phosphodiesterase activity（3'，5'-環(huán)核苷酸磷酸二酯酶活性）、3'， 5'-cyclic-GMP phosphodiesterase activity（3'，5'-環(huán)-GMP磷酸二酯酶活性）、alpha1-adrenergic receptor activity （α1-腎上腺素受體活性）等，見圖12。KEGG 通路富集分析得到22條通路，主要涉及cGMP-PKG信號通路、Arachidonic acid metabolism（花生四烯酸代謝）等，見圖13。

圖12 GO功能富集分析

圖13 KEGG通路富集分析

討 論

本文基于數(shù)據(jù)挖掘和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對龔?fù)①t治療中風(fēng)的63首處方進(jìn)行配伍規(guī)律研究，并將其核心藥對進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為，本病由于腦絡(luò)受損，神機(jī)失用導(dǎo)致氣血逆亂、臟腑功能失調(diào)而發(fā)。因此，中風(fēng)多為本虛標(biāo)實(shí)之證，其病位在腦，與五臟密切相關(guān)，在本為肝腎陰虛、氣血衰少等，在標(biāo)為風(fēng)火相煽、痰濕壅盛、瘀血阻滯及氣血逆亂等，治療則根據(jù)中經(jīng)絡(luò)、中臟腑和后遺癥辨證論治?，F(xiàn)代研究表明，中風(fēng)發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要與腦組織能量代謝障礙、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂等密切相關(guān)[18-19]。本文通過采用現(xiàn)代信息技術(shù)，以期能為中風(fēng)的臨床用藥及相關(guān)實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)與思路。

根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，龔?fù)①t治療中風(fēng)的63首方藥，以補(bǔ)虛藥為先，正如其在《壽世保元·中風(fēng)》中強(qiáng)調(diào)：“予觀古人之方，多用攻擊之劑，施于北方風(fēng)土剛勁之人，間或可也，用于南方風(fēng)土柔弱之人，恐難當(dāng)耳”，反映了龔氏善用補(bǔ)虛藥治療中風(fēng)的學(xué)術(shù)特點(diǎn)。高頻藥物共計(jì)20味，除甘草外，排名靠前依次為茯苓、防風(fēng)、當(dāng)歸、川芎等，高頻藥物多入脾、肺、肝三經(jīng)，且理氣藥使用占比較大，體現(xiàn)了龔?fù)①t治風(fēng)主張理氣的學(xué)術(shù)思想，如《萬病回春·中風(fēng)》指出：“蓋治風(fēng)先理氣，氣順則痰消，徐理其風(fēng)，庶可收斂”。綜合評估11個(gè)藥對和2個(gè)藥組，發(fā)現(xiàn)“麥冬-肉桂”為高頻核心藥對，麥冬配伍肉桂可清心養(yǎng)陰，補(bǔ)火助陽，一陰一陽，清補(bǔ)兼施，為《石室秘錄》倒陽湯結(jié)構(gòu)。聚類分析共包含5個(gè)多味藥物聚類組合，其組方規(guī)律含有燥濕化痰之二陳湯（類1）、和中活血之白術(shù)黃芩湯（類2）、養(yǎng)血活血之四物湯（類3）等結(jié)構(gòu)，以及細(xì)辛-白芷、生地黃-熟地黃（類4、類5）之配伍，其整體治法與中風(fēng)本虛標(biāo)實(shí)病機(jī)相符。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果顯示，豆甾醇、鳥嘌呤核苷、茴香烯等34個(gè)成分為治療中風(fēng)的潛在活性成分。實(shí)驗(yàn)表明，豆甾醇可以有效改善腦缺血再灌注引起的神經(jīng)功能損傷，進(jìn)而減少組織病理學(xué)缺損[20]，鳥嘌呤核苷亦被證實(shí)在缺血性腦卒中動物模型中具有神經(jīng)保護(hù)作用[21]。根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)TNF、PTGS2、ACE等為關(guān)鍵靶點(diǎn)。研究表明，缺血性腦卒中患者在癥狀發(fā)作后12、24、72小時(shí)血液中TNF水平均有所升 高[22-24]，并于發(fā)病后1～6天在神經(jīng)元中表達(dá)，且在2～3天達(dá)到峰值[25]。PTGS2是維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)炎癥的主要應(yīng)答基因，與缺血性腦卒中的發(fā)病密切相關(guān)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦證實(shí)PTGS2的陽性蛋白在大腦中動脈阻塞（MCAO）小鼠模型中的表達(dá)顯著增高[26]。ACE基因表達(dá)失調(diào)起到了推動本病發(fā)生發(fā)展的作用，其通過影響AngⅡ的水平，導(dǎo)致神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞中的下游信號傳導(dǎo)異常，引發(fā)高血壓和炎癥，從而提高中風(fēng)的患病風(fēng)險(xiǎn)[27]。

KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)麥冬-肉桂治療缺血性中風(fēng)主要涉及cGMP-PKG信號通路、NF-κB信號通路及Arachidonic acid metabolism（花生四烯酸代謝）等。多項(xiàng)研究表明，炎癥反應(yīng)與缺血性腦卒中的急慢性階段密切相關(guān)，cGMP可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和炎癥等多種細(xì)胞生物學(xué)過程[28]。此外，Phosphodiesterase-5 Inhibitor（磷酸二酯酶-5抑制劑）可增加腦血流量以促進(jìn)其功能恢復(fù)，往往依賴于NO-cGMP-PKG通 路[29]。NF-κB信號通路亦與炎癥反應(yīng)有關(guān)，并通過降低細(xì)胞的凋亡率及改善腦細(xì)胞的細(xì)胞周期而作用于缺血性腦卒中[30]。Rink Cameron[31]等研究發(fā)現(xiàn)，花生四烯酸代謝在缺血性腦卒中病理機(jī)制中具有重要作用。因在缺血性腦卒中環(huán)境下，腦部的血液運(yùn)行被阻滯，此時(shí)缺氧的腦組織開始從膜磷脂雙層中迅速裂解花生四烯酸，而花生四烯酸能同時(shí)進(jìn)行非酶依賴性和酶介導(dǎo)的氧化代謝，并形成多種有助于缺血性腦卒中病理改善的生物活性代謝物。

本文采用數(shù)據(jù)挖掘結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，初步闡述了旴江醫(yī)家龔?fù)①t治療中風(fēng)的用藥規(guī)律，得出相關(guān)核心藥對及新方組合，并進(jìn)一步分析“麥冬-肉桂”藥對治療中風(fēng)的潛在靶點(diǎn)、活性成分、生物過程及關(guān)鍵信號通路，發(fā)現(xiàn)其主要通過cGMP-PKG信號通路、NF-κB信號通路及花生四烯酸代謝等途徑發(fā)揮作用。綜上，本研究可為傳承和弘揚(yáng)旴江名醫(yī)治療中風(fēng)的臨證經(jīng)驗(yàn)與學(xué)術(shù)思想，以及新藥研發(fā)提供參考借鑒。