丁亞群 丁寧 謝深民 黃夢娜 張昱 張勤，2 姜力

（1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 畜禽育種國家工程實驗室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 100193；2. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，泰安 271018）

Vps28（vacuolar protein sorting 28，Vps28） 是編碼液泡蛋白分選蛋白的基因，是內(nèi)吞體轉(zhuǎn)運分選復(fù)合體ESCRT-I（endosomal sorting complex required for transport I）的重要組成成分之［1］。ESCRT- 0、ESCRT-I、ESCRT-II和 ESCRT-III共同組成 ESCRT復(fù)合體。ESCRT復(fù)合體是一種內(nèi)體蛋白分選轉(zhuǎn)運裝置，主要識別泛素化修飾的膜蛋白，在分選和降解泛素化的膜蛋白過程中發(fā)揮重要作用。通過使一些激素、生長因子及細胞因子受體與配體結(jié)合后內(nèi)化并被溶酶體降解，導(dǎo)致受體表達下調(diào)，從而在信號衰減中起重要作用［2］。此外，ESCRT參與多種細胞代謝過程，包括多泡體的形成、細胞脫落、自體吞噬和包膜病毒出芽等。有研究表明，如果ESCRT復(fù)合體組件受損，將導(dǎo)致各種不同疾病的發(fā)生，如人類免疫缺陷病毒感染、腫瘤、甲狀腺疾病等［3-8］。ESCRT復(fù)合體組件中的ESCRT-I包含泛素結(jié)合位點，通過聚集泛素化蛋白產(chǎn)生多泡體，并且是連接 ESCRT- 0和 ESCRT-II的橋梁［9-10］。ESCRT-I由Vps23，Vps28，Vps37 和 Mvb12（Tsg101）組成［11-13］。Vps28是ESCRT-I的頂端帽子結(jié)構(gòu)，與ESCRT-II中的Vps36結(jié)合，Vps36同時與泛素蛋白結(jié)合［14］。因此，Vps28可以通過影響內(nèi)體ESCRT裝置的穩(wěn)定性而影響該裝置對泛素化蛋白的識別、分選和轉(zhuǎn)運。

Vps28位于奶牛的14號染色體，編碼221個氨基酸。小鼠的Vps28基因位于15號染色體，編碼221個氨基酸。Vps28蛋白序列在不同物種間高度保守，人、小鼠和奶牛的氨基酸序列同源性高達99%。本課題組前期對奶牛產(chǎn)奶性狀進行全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS）研究，發(fā)現(xiàn)Vps28與奶牛的產(chǎn)奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白率顯著相關(guān)［15］。隨后，我們利用目標區(qū)域捕獲測序技術(shù)對Vps28基因5′ UTR區(qū)的一個SNP位點在新的奶牛資源群體中進行產(chǎn)奶性狀關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示該位點與產(chǎn)奶量、乳脂量、乳蛋白量、乳脂率和乳蛋白率都顯著相關(guān)，所有性狀中最大P值為1.99E-09［16］。隨后，利用qPCR技術(shù)在奶牛泌乳期的心臟、肝臟、肺、腎、乳腺、卵巢、子宮、肌肉組織中進行Vps28基因表達量的檢測，發(fā)現(xiàn)其在乳腺組織中呈現(xiàn)特異性高表達［16］。上述研究結(jié)果說明Vps28基因?qū)δ膛５漠a(chǎn)奶性狀表型發(fā)揮了重要作用，與奶牛的泌乳過程密切相關(guān)，是產(chǎn)奶性狀的重要候選功能基因。為了進一步研究Vps28基因?qū)γ谌樾誀畹淖饔煤凸δ埽狙芯坷肅RISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了Vps28基因敲除小鼠，并對小鼠的泌乳性狀及相關(guān)表型進行了研究，旨在進一步驗證Vps28基因體內(nèi)的功能和作用，為我國奶牛分子育種提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 材料

4-6周齡SPF級小鼠（遺傳背景為C57BL/6J）購自南京集萃藥康生物有限公司。嚴格按照SPF級動物飼養(yǎng)標準對小鼠進行飼養(yǎng)，環(huán)境溫度控制在25℃左右，濕度控制在70%左右，光照周期為12 h/12 h。小鼠的飼料、墊料和飲用水均經(jīng)過高溫高壓滅菌處理。對小鼠實行自由采食和飲水。小鼠所用墊料每周更換2次。動物實驗按照科技部（中國北京）制定的《實驗動物指南》進行。動物實驗方案經(jīng)中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物倫理審查委員會批準（倫理審查證號 ：DK996）。

體外轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTMRT reagent Kit）和定量試劑盒（TB Green? Fast qPCR Mix）購自大連寶生物有限公司；所有引物均由上海生工生物公司合成；DNA提取試劑盒、2X Taq PCR mix，DNA marker購自北京天根生化科技有限公司；Vps28抗體購自上海艾比瑪特生物醫(yī)藥有限公司；β-actin抗體，HRP標記二抗購自美國Abcam公司；Trizol購自美國Invitrogen公司；蛋白marker、ECL發(fā)光液試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific；蛋白提取試劑盒和蛋白質(zhì)定量試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建Vps28基因敲除小鼠

1.2.1.1 F0代小鼠的獲得和鑒定 從NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）網(wǎng)站上獲得小鼠基因組中Vps28（Gene ID 66914）基因的序列和結(jié)構(gòu)信息，在基因的編碼區(qū)域設(shè)計sgRNA，本研究中選擇Vps28基因的第3外顯子到下游第7外顯子作為設(shè)計靶點（圖1）。利用CRISPR Design軟件設(shè)計sgRNA（http://crispr.mit.edu/），序列見表1。合成sgRNA1和sgRNA2后，利用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒對合成的DNA分子進行轉(zhuǎn)錄，分別得到sgRNA1溶液和sgRNA2溶液。sgRNA1和sgRNA2均由各自靶序列轉(zhuǎn)錄的RNA與sgRNA的骨架序列［17］連接而成。體外轉(zhuǎn)錄Cas9 mRNA和sgRNA，共注射到雄性小鼠C57BL/6J的精子和雌性小鼠C57BL/6J的卵子體外受精0.5 d的受精卵中。取注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠體內(nèi)，胚胎移植的小鼠出生即為F0代Vps28基因突變的嵌合體小鼠。待小鼠長至3周齡時，取小鼠尾部組織，提取DNA，設(shè)計引物（表2）進行降落PCR擴增，然后通過瓊脂糖凝膠電泳和PCR產(chǎn)物測序驗證小鼠已缺失Vps28基因。PCR體系為12.5 μL 2X PCR mix，8.5 μL ddH2O，1 μL 上游引物，1 μL 下游引物，2 μL DNA模板，總體積為25 μL。降落PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，98℃變性30 s；65℃退火30 s，72℃延伸45 s，從變性到延伸共20個循環(huán)；98℃變性30 s；55℃退火30 s，72℃延伸45 s，從變性到延伸共20個循環(huán)；最后再72℃延伸5 min，之后4℃保存。

表2 引物序列Table 2 Primer sequence

圖1 CRISPR/Cas9設(shè)計策略Fig. 1 CRISPR / Cas9 design strategy

表1 sgRNA序列Table 1 sgRNA sequence

1.2.1.2 繁育Vps28基因敲除純和型突變小鼠 將F0代嵌合體小鼠與野生型C57BL/6J小鼠進行繁育，得到F1代小鼠。通過基因型鑒定篩選出F1代雜合子小鼠（鑒定方法與F0代相同），并用其作為親本，交配并繁育F2代。根據(jù)孟德爾經(jīng)典遺傳學(xué)規(guī)律，在沒有伴性遺傳和胚胎致死的情況下，得到的F2代小鼠中將有1/4的純和型Vps28基因缺失小鼠（Vps28-/-）。利用PCR產(chǎn)物測序方法對得到的所有F2代小鼠進行基因型鑒定。

1.2.2 qPCR檢測基因敲除鼠乳腺和脾臟組織中Vps28基因的表達 為了驗證Vps28基因的敲除效果，本研究選取了小鼠的乳腺和脾臟組織，用傳統(tǒng)Trizol法提取組織RNA，反轉(zhuǎn)錄后使用TaKaRa公司的TB Green? Fast qPCR Mix 試劑盒進行qPCR試驗，檢測野生型（WT）和敲除型（KO）小鼠中不同組織Vps28基因 mRNA的表達量（引物信息見表3）。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT法計算Vps28基因的相對表達量。

表3 qPCR引物序列Table 3 Sequences of qPCR primers

1.2.3 Western blot檢測基因敲除小鼠Vps28蛋白表達 選取同窩對照的2月齡雌性野生型小鼠和敲除型小鼠采集乳腺和脾臟組織，使用RIPA（含1%蛋白酶抑制劑PMSF）提取總蛋白，并進行蛋白定量。取50 μg蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠4%，分離膠12%恒壓90 V電泳30 min，后120V電泳2 h。電泳結(jié)束后，恒流300 mA，轉(zhuǎn)膜2 h，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂牛奶封閉1 h后，分別加入 Vps28一抗（1∶1 000）和 β-actin一抗（1∶1 000）4℃過夜。使用1×TBST洗滌4次，每次10 min。之后二抗（1∶3 000）孵育1 h，1×TBST洗滌3次。加入ECL化學(xué)發(fā)光液，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進行拍照。

1.2.4 母鼠乳房形態(tài)鑒定 對野生型雌鼠和基因敲除型雌鼠的乳房組織進行形態(tài)鑒定，用體視鏡對泌乳期母鼠乳頭進行拍照。

1.2.5 母鼠泌乳量的測定 為了驗證Vps28基因?qū)γ谌榈挠绊?，本研究在母鼠泌乳期的?-10天測定母鼠泌乳量，但由于母鼠的泌乳量很難直接測定，因此本研究用仔鼠體重來間接反映母鼠泌乳情況。仔鼠出生后第4-10天稱重，以窩為單位。每天上午9點將母鼠與仔鼠分離，把一窩仔鼠一起稱重，稱重后放回籠中，記錄體重數(shù)據(jù)。

1.2.6 母鼠血常規(guī)測定 取泌乳期第16天的母鼠血液進行血常規(guī)測定。采血時間為上午8點，采血前12 h開始斷食，采用眼眶后靜脈叢取血。利用Drew Scientific 200106 FS-PAK試劑盒和Hemavet 950 FS血常規(guī)儀（Drew Scientific，英國）測定血液中的血紅蛋白濃度、白細胞數(shù)量、紅細胞數(shù)量、中性粒細胞數(shù)量、淋巴細胞數(shù)量、中間細胞數(shù)量等指標。

1.2.7 數(shù)據(jù)與分析 所有實驗數(shù)據(jù)均為3次獨立重復(fù)實驗結(jié)果，以平均值±標準差表示，利用統(tǒng)計分析SPSS軟件（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）對兩組數(shù)據(jù)差異進行t檢驗。P＜0.05和P＜0.01分別作為兩組數(shù)據(jù)差異顯著和極顯著的顯著性閾值。

2 結(jié)果

2.1 F0代小鼠基因型鑒定結(jié)果

取F0代小鼠的鼠尾提取DNA，采用PCR擴增的方法檢測Vps28基因目的片段，基因型鑒定結(jié)果如圖2，使用引物對（3025-Vps28-5S-OuttF1和3025-Vps28-3S-OuttR2）檢測時，WT個體沒有條帶，KO個體條帶為920 bp。在920 bp處有條帶的個 體 7#，8#，9#，15#，16#，19#，21#和 22#為Vps28基因敲除個體，其余為野生型個體。使用引物對（3025-Vps28-5S-intF1和 3025-Vps28-3S-intR2）檢測時，WT個體條帶為521 bp，KO個體沒有條帶，表明獲得的個體為雜合型。經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)，共有4種刪除片段，分別是-1 872 bp（7#個體）、-1 882 bp（8#，9#，16#，23#個 體 ）、-1 872 bp（15#個體）和-1 963 bp同時引入了8個堿基（19#個體），其中-1 882 bp個體敲除效果最好，DNA測序結(jié)果如圖3。選取Vps28基因敲除-1 882 bp個體進行后續(xù)試驗。

圖2 Vps28敲除小鼠F0代基因型鑒定Fig. 2 Genotype identification of F0 generation of Vps28-knockout mice

圖3 Vps28敲除小鼠F0代基因型（-1 882 bp）測序結(jié)果Fig. 3 Genotype sequencing results of F0 generation（-1 882 bp）of Vps28-knockout mice

2.2 F1代小鼠基因型鑒定結(jié)果

將F0代小鼠與野生型C57BL/6小鼠進行繁育，得到F1代小鼠。提取小鼠尾部DNA樣本，采用PCR擴增的方法檢測Vps28基因目的片段。使用引物對（3025-Vps28-5S-OuttF1和3025-Vps28-3S-OuttR2）檢測時，在920 bp處有條帶的個體48#，49#，53#，54#，57#，58#，59#，60#和 62#為Vps28基因敲除個體，其余為野生型個體。使用引物對（3025-Vps28-5S-intF1和 3025-Vps28-5S-intR2）檢測時，WT個體條帶為521 bp，KO個體沒有條帶，表明獲得的個體為雜合型（圖4）。結(jié)果顯示，48#，49#，53#，54#，57#，58#，59#，60# 和 62#為Vps28基因敲除雜合個體，其余為野生型小鼠。

圖4 Vps28敲除小鼠F1代基因型鑒定Fig. 4 Genotype identification of Vps28-knockout mice in F1 generation

2.3 純合型Vps28基因敲除小鼠的繁育

用雄性的F1代Vps28 KO雜合小鼠與雌性的F1代Vps28基因KO雜合小鼠交配。對所得子代小鼠性別分析結(jié)果顯示，雌雄比例為30∶28，說明Vps28基因敲除后對小鼠的性別無顯著影。對子代小鼠進行基因型鑒定，結(jié)果顯示只得到雜合子和野生型小鼠，其比例為40∶18，接近2∶1，符合孟德爾遺傳定律，但未獲得純合子基因敲除小鼠。重復(fù)實驗進行F1代KO雜合雌雄小鼠交配，仍未獲得基因敲除純合子個體，推測Vps28基因的純合缺失可能造成小鼠胚胎致死。因此本研究僅獲得Vps28基因缺失的雜合子小鼠用于后續(xù)研究。

2.4 qPCR和Western blot驗證Vps28基因敲除效果

提取野生型和基因敲除型小鼠（泌乳期第10天）乳腺組織和脾臟組織的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，以GAPDH為內(nèi)參進行qPCR檢測，結(jié)果顯示基因敲除型小鼠脾臟組織中Vps28 mRNA表達水平顯著低于野生型小鼠（P＜0.001），進一步使用Western blot方法驗證Vps28的蛋白水平，結(jié)果與mRNA表達一致（圖5-A）；Vps28基因敲除（KO）小鼠乳腺組織中Vps28 mRNA表達水平顯著低于野生型小鼠（P＜0.001），進一步使用Western blot方法驗證Vps28的蛋白水平，結(jié)果與mRNA表達一致（圖5-B）。研究結(jié)果表明Vps28在敲除鼠的乳腺和脾臟組織表達均出現(xiàn)顯著下調(diào)。

圖5 Vps28基因在脾臟和乳腺中的敲除效果Fig. 5 mRNA and protein expresion of Vps28 in mouse spleen and mammary gland

2.5 母鼠泌乳量的測定

本研究共測定16窩野生型母鼠后代仔鼠（69只）和11窩Vps28敲除型母鼠后代仔鼠（70只）的體重。從小鼠出生后第4天開始在每天上午9點分別稱取每窩小鼠的重量，直到第10天。研究發(fā)現(xiàn)野生型母鼠后代體重的增長明顯快于基因敲除鼠的后代，仔鼠日平均體重折線圖見圖6-A。在母鼠泌乳期的第8-10天，野生型母鼠后代的日增重明顯高于基因敲除母鼠后代的日增重，仔鼠體重差異達到顯著水平（P＜0.05）。同時對小鼠每日增重進行計算（圖6-B），結(jié)果表明在Day4-Day5，Day5-Day6，小鼠日增重沒有顯著差異；而在Day6-Day7、Day7-Day8、Day8-Day9、Day9-Day10小鼠日增重差異顯著。小鼠前期日平均體重和日增重無明顯差異，表明小鼠沒有因為基因敲除導(dǎo)致初生體重存在差異，因此推測Vps28基因的敲除會導(dǎo)致母鼠的泌乳量或泌乳質(zhì)量下降，從而導(dǎo)致基因敲除鼠后代的日增重較野生型母鼠后代緩慢。

圖6 母鼠后代仔鼠的體重及日增重Fig.6 Average body weight and daily gain weight of offspring of WT and KT female rats

2.6 母鼠乳房形態(tài)

對野生型和基因敲除母鼠的乳腺組織進行觀察，發(fā)現(xiàn)兩種類型的母鼠乳頭形態(tài)存在較大差異。野生型小鼠的乳頭正常（圖7-A），Vps28基因敲除鼠的乳頭凹陷（7-B），提示Vps28基因的敲除通過影響母鼠的乳腺發(fā)育，從而導(dǎo)致母鼠的泌乳功能受到影響。

圖7 Vps28基因敲除母鼠和野生型母鼠乳腺組織形態(tài)Fig. 7 Structural morphology of mammary glands in WT-mice and Vps28-knockout mice

2.7 母鼠血常規(guī)測定

在驗證Vps28基因?qū)δ甘竺谌榱康挠绊懼螅狙芯坷^續(xù)探究了該基因?qū)δ甘竺庖咝誀畹挠绊?。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)一些與免疫相關(guān)的細胞因子，如白細胞數(shù)量（P＜0.001，圖 8-A）、中性粒細胞數(shù)量（P＜0.001，圖8-D）、淋巴細胞數(shù)量（P＜0.001，圖8-E）、中間細胞數(shù)量（P＜0.001，圖8-F）在野生型（WT）小鼠血液中顯著高于敲除型（KO）小鼠。而紅細胞（圖8-B）和血紅蛋白濃度（圖8-C）在兩種類型小鼠之間無顯著差異。

圖8 野生型小鼠和Vps28基因敲除小鼠血常規(guī)指標的比較Fig. 8 Comparison of blood routine indexes between WT- mice and Vps28-knockout mice

3 討論

在人以及小鼠等哺乳動物中關(guān)于Vps28的研究表明，Vps28是內(nèi)體蛋白分選轉(zhuǎn)運裝置ESCTR-I的一個亞單位。ESCRT-I與 ESCRT- 0、ESCRT-II和ESCRT-III共同組成ESCTR復(fù)合體［18］。ESCRT復(fù)合物是將蛋白質(zhì)分選成多泡體（MVBs）和包膜病毒（如HIV-1）出芽所必須的。ESCRT復(fù)合體與細胞中的蛋白酶體及溶酶體共同組成泛素-溶酶體/蛋白酶體系統(tǒng)，在降解泛素化膜蛋白和胞質(zhì)蛋白中發(fā)揮重要作用［1，19］。哺乳動物中Vps蛋白通過識別泛素并去除內(nèi)體蛋白泛素結(jié)合物，因此Vps的突變會導(dǎo)致細胞內(nèi)泛素化蛋白的積累并且導(dǎo)致個體出現(xiàn)異常表型［20］。Bishop等［21］的研究證明 Vps28與 TSG101直接相互作用并參與細胞內(nèi)體分選過程。

本課題組前期GWAS結(jié)果顯示，Vps28基因與奶牛的產(chǎn)奶量、乳脂率、乳蛋白率均顯著相關(guān)［15］，是奶牛產(chǎn)奶性狀的重要候選功能基因。然而該基因?qū)γ谌樾誀畹墓δ苎芯磕壳皟H停留在細胞水平上［22］，并未進行體內(nèi)功能驗證。研究發(fā)現(xiàn)干擾奶牛乳腺上皮細胞中Vps28基因的表達后，乳腺上皮細胞乳脂合成相關(guān)基因表達受到影響［22］。本研究基于上述研究背景首次利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了Vps28基因敲除小鼠，在個體水平對該基因展開一系列功能研究。雖然經(jīng)過多次實驗，但本研究最終未獲得Vps28基因敲除純合子小鼠，推測該基因的純合缺失會導(dǎo)致小鼠胚胎發(fā)育終止或死亡。這一發(fā)現(xiàn)在前人對果蠅的研究中得到了證實。2005年，Sevrioukov等［13］在對同源基因Vps28突變的果蠅進行研究時，發(fā)現(xiàn)Vps28基因是個體發(fā)育所必須的。Vps28基因純合突變體果蠅在從一齡到二齡的過渡期死亡。并且發(fā)現(xiàn)母系提供的Vps28是早期胚胎發(fā)生所必需的，去除母體貢獻的Vps28可導(dǎo)致早期胚胎死亡。在缺乏Vps28的胚胎中，需要肌動蛋白細胞骨架的幾個重要發(fā)育過程受到干擾，包括細胞核軸向遷移、合胞體胚胎皮質(zhì)分裂期間形成短暫的溝以及隨后的細胞化。此外，在Vps28基因突變果蠅睪丸的精子個體化過程中，肌動蛋白細胞骨架組織的缺陷也變得明顯。有研究報道來自敲除小鼠的Tsg101（ESCRT-I的另一個重要成員）突變細胞同樣表現(xiàn)出的表型是早期細胞周期停滯［23-24］。并且，VPS28A和VPS28B在液泡形成、質(zhì)膜蛋白內(nèi)質(zhì)體分類和生長素介導(dǎo)的植物發(fā)育中起著重要作用［25］。上述研究結(jié)果證明Vps28以及ESCRT-1成員對早期胚胎發(fā)育和細胞周期具有重要作用。此外，本研究的結(jié)果表明Vps28基因?qū)δ甘蟮拿谌榱坑兄匾绊懀憩F(xiàn)為基因敲除母鼠后代生長速度明顯比野生型母鼠后代緩慢。同時，本研究發(fā)現(xiàn)Vps28基因敲除母鼠的乳腺組織發(fā)育不完善，從表型上驗證了Vps28基因?qū)θ橄俳M織發(fā)育的功能。因此，本研究通過構(gòu)建基因敲除小鼠模型對Vps28基因影響產(chǎn)奶性狀表型進行了初步的體內(nèi)功能驗證。

血液由血漿和血細胞兩大部分組成，位于動物機體的循環(huán)系統(tǒng)中，參與動物機體的代謝及相關(guān)免疫機能活動，因此與機體的免疫功能密切相關(guān)。利用血液常規(guī)指標進行臨床醫(yī)學(xué)疾病診斷在人類中已經(jīng)廣泛應(yīng)用，它是反應(yīng)人體免疫狀態(tài)、健康情況的重要基礎(chǔ)指標。白細胞在動物血液中是有核細胞，主要包括中性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞［26］。白細胞參與機體對細菌、病毒等入侵時的反應(yīng)過程，并反映在白細胞數(shù)量的變化上。中性粒細胞占白細胞的50%以上，是外周血循環(huán)和免疫系統(tǒng)中含量最豐富的白細胞，具有較強的趨化作用、吞噬作用和殺菌作用，因此對動物機體的免疫發(fā)揮著重要作用［26］。當機體受到細菌性感染或其他刺激時，中性粒細胞數(shù)量會升高。而一些疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、自身免疫性疾病、感染性疾病、血液系統(tǒng)疾病等，也會引起中性粒細胞大量減少，從而使機體患上粒細胞缺乏癥。淋巴細胞是體積最小的白細胞，主要在淋巴管中循環(huán)，是機體免疫應(yīng)答功能的重要細胞成分［27］。淋巴細胞具有免疫識別功能，是淋巴系統(tǒng)免疫功能主要的執(zhí)行者。中間細胞也是白細胞中一個重要的細胞群，主要包括單核細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞。本研究發(fā)現(xiàn)Vps28基因和蛋白在基因敲除鼠的脾臟組織中表達量顯著降低，同時Vps28基因敲除小鼠血液常規(guī)指標中的白細胞數(shù)量、中性粒細胞數(shù)量、淋巴細胞數(shù)量和中間細胞數(shù)量均顯著低于野生型小鼠，暗示Vps28基因影響小鼠相關(guān)免疫性狀。前人的研究也發(fā)現(xiàn)Vps28與一些免疫過程有關(guān)。例如，Cornet 等［28］發(fā)現(xiàn)Vps28可以與Vps32一起作用于酵母菌的細胞內(nèi)吞和PH信號通路，敲除這兩個基因后會導(dǎo)致酵母菌更容易受到白色念珠菌的侵襲。最近，Dionisio-Vicu?a等［29］的研究發(fā)現(xiàn)Vps28基因與細胞的有絲分裂有關(guān)，定位于有絲分裂的微管，Vps28基因的缺失會導(dǎo)致有絲分裂過程中紡錘絲形成的異常。

4 結(jié)論

本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建Vps28基因敲除小鼠模型，研究未獲得Vps28基因敲除純合子個體，推測Vps28純合缺失會導(dǎo)致小鼠胚胎死亡，提示Vps28基因?qū)υ缙谂咛グl(fā)育或細胞周期具有重要意義。Vps28基因敲除雜合子小鼠乳腺組織發(fā)育存在缺陷，同時該基因在Vps28敲除雜合子小鼠的乳腺組織和脾臟組織中表達量顯著降低，表明Vps28基因敲除小鼠模型成功構(gòu)建?；谠撔∈竽Ｐ停狙芯吭隗w內(nèi)驗證了Vps28基因?qū)Ξa(chǎn)奶性狀和免疫性狀的影響，并為后續(xù)相關(guān)研究的開展提供了重要的動物模型。