付雅麗 彭萬里 林雙君 鄧子新 梁如冰

（上海交通大學生命科學技術學院 微生物代謝國家重點實驗室，上海 200240）

環(huán)境雌激素包括天然雌激素和合成雌激素，來源廣泛，包括畜牧業(yè)廢物、人類排泄物、個人護理品與藥廠廢水等［1］。環(huán)境雌激素在極低濃度（低至ng/L）條件下即會對生物體的生理代謝造成嚴重影響，三致效應強，是一類嚴重的環(huán)境污染物［2-3］。17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）是天然雌激素中雌激素活性最高的物質(zhì)，對生物體影響最大［4］。

微生物修復因效率高、成本低、環(huán)境影響小等優(yōu)點，被認為是去除環(huán)境雌激素污染的有效策略［5］。在細菌、真菌和藻類中均發(fā)現(xiàn)一些微生物，它們能以雌激素為碳源或能源，通過一系列復雜的生理代謝活動，降低雌激素毒性，并最終將其完全轉(zhuǎn)化為無害的終產(chǎn)物［6-13］。其中，細菌降解類固醇類化合物的分子機制被認為包括9，10-seco途徑、4，5-seco途徑或2，3-seco途徑。睪丸酮叢毛單胞菌（Comamonas testosterone）通過9，10 -seco途徑降解雄激素［3］；利用2，3-seco途徑，反硝化鏈球菌（Sterolibacterium denitrificans）可實現(xiàn)厭氧條件下的睪酮降解［14］。鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas spp.）KC8則利用4-羥基雌酮-4、5-雙加氧酶，通過4，5-seco途徑來代謝雌二醇［6］。17β-雌二醇向雌酮的轉(zhuǎn)化是雌激素代謝的第一步與限速步驟，相關酶是啟動雌二醇降解的關鍵酶；短鏈脫氫酶（short chain dehydrogenase/reductase，SDR）被認為是啟動細菌類固醇激素降解的主要酶，已有不同來源的SDR被證實催化了雌激素的首步轉(zhuǎn)化反應［15-18］，另外，一些調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子被鑒定出來［15，19］。該氧化還原酶超家族依賴于NAD（P）+，具有典型的βαβ折疊模式與保守Rossmann fold基序及由高度保守氨基酸構(gòu)成的催化中心［20-21］。然而，因目前已測序的雌激素降解菌株與鑒定的雌激素降解酶較少，細菌降解雌激素的途徑、關鍵酶及其催化機制仍不十分清楚。

我們前期分離鑒定了一株雌激素降解菌，香茅醇假單胞菌（Pseudomonas citronellolis）SJTE-3，并測定了其全基因組序列［22］。該菌株可利用17β-雌二醇（estradiol，E2）、雌酮（estrone，E1）、17α-炔雌醇（17α-ethinylestradiol，EE2）和睪酮（testosterone，TES）等類固醇激素及多環(huán)芳烴；24 h內(nèi)菌株可降解92%的雌二醇（10 μg/mL），其產(chǎn)物為雌酮。本研究從該菌株中分離篩選了一個短鏈脫氫酶SDR-X1，可有效催化雌二醇向雌酮的轉(zhuǎn)化，并對其催化功能與酶學性質(zhì)進行了解析，旨為豐富雌激素降解酶的資源庫，推進細菌代謝雌激素的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 香茅醇假單胞菌SJTE-3為本實驗室分離獲得，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（保藏編號為CGMCC No. 12720）［22］。 大 腸 桿 菌 菌 株 DH5α 購 自 美 國Invitrogen公司，菌株BL21（DE3）和質(zhì)粒pET-28a均購自美國Novagen公司。

1.1.2 培養(yǎng)基與化學試劑 17β-雌二醇（C18H24O2，Mw=272.38， 純 度 ＞99%）， 雌 酮（C18H22O2，Mw=270.37，純度＞99%），睪酮（TES，C19H28O2，Mw=288.42，純度 ＞99%）和 17α-炔雌醇（C20H24O2，Mw=296.40，純度＞99%）均購自美國Sigma-Aldrich公司；其儲存液以DMSO溶解，濃度為10 mg/mL，-20℃保存。乙腈和乙酸乙酯（HPLC級）購自美國EMD公司。其它化學試劑均購自上海國藥集團化學試劑有限公司。微生物培養(yǎng)使用液體LB培養(yǎng)基（胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，NaCl 8.0 g/L，pH 7.2）和無機鹽MM培養(yǎng)基（KH2PO44.5g/L，K2HPO4·3H2O 13.75 g/L，（NH4）2·SO42.0 g/L，pH 7.4）；固體LB培養(yǎng)基是在液體LB培養(yǎng)基中加入15.0 g/L的瓊脂粉。細菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒與凝膠回收純化試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司。限制性內(nèi)切酶與T4 DNA連接酶購自美國賽默飛世爾科技ThermoFisher Scientific有限公司；DNA聚合酶、RNA提取試劑、PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒和Premix Ex Taq（Probe qPCR）試劑盒均購自寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司（TaKaRa中國）。親和層析Ni-NTA樹脂和BCA蛋白檢測試劑盒購自美國Bio-Rad公司。DNA引物合成與DNA序列測定由上海派森諾生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析 利用BlastP和Blast分別查找與確定香茅醇假單胞菌SJTE-3（GenBank序號：NZ_CP015878.1）中短鏈脫氫酶SDR-X1（ANI14060.1/WP_043267487.1）序列及其編碼基因sdr-x1（A9C11_RS08750，1947150...1947896）序列。利用DNAMAN 6.0軟件，對短鏈脫氫酶SDR-X1和其它12個不同來源的短鏈脫氫酶進行多序列比對分析，并利用MAGE 7.0.26軟件構(gòu)建進化樹［23］；所有參數(shù)設置為默認值。

1.2.2 高 效 液 相 色 譜 （high performance liquid chromatography，HPLC）測定雌激素物質(zhì)性質(zhì)與含量 利用乙腈溶解17β-雌二醇、雌酮、睪酮和17α-炔雌醇的標準品，設置不同濃度（1 μg/mL、10 μg/mL、25 μg/mL 和 50 μg/mL），測定標準曲線。HPLC測定條件為：儀器為美國安捷倫公司的色譜儀Agilent 1260，使用Agilent exclip plus C18色譜柱（3.5 μm，4.6 mm×150.0 mm）和FLD熒光檢測器，流動相為乙腈和水（1∶1，V/V），流速為1 mL/min，溫控為30℃。每個標品設3個平行，每組實驗重復3次，利用峰面積計算不同類固醇激素的含量；標準曲線R2值＞0.99。

1.2.3 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR反應 將香茅醇假單胞菌SJTE-3在LB固體平板上劃線過夜培養(yǎng)，挑取單菌落接種在含10 μg/mL不同碳源（葡萄糖、乙醇、17β-雌二醇、雌酮、睪酮或17α-炔雌醇）的無機鹽MM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)6、12、18和24 h取樣。利用RNA提取試劑提取總RNA，通過Nanodrop紫外光譜儀（Nanodrop Technologies，美國）確定RNA含量。之后，利用PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒對總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應，反應體系為20 μL，總RNA投入量為1 μg。熒光定量PCR反應使用Premix Ex Taq（Probe qPCR）試劑盒；內(nèi)參基因為16S rRNA編碼基因，sdr-x1基因的引物為sdr-x1-QF/QR（5′-CATTGTTCACCAGCACGTCG-3′/5′-ATGCCGTCGCCATCAACTAT-3′）。熒光定量 PCR反應在定量PCR儀qTOWER3G touch中進行（德國耶拿analytikjena）；測定樣本的閾值周期Cq 值，采用 2-ΔΔCt法計算轉(zhuǎn)錄水平的相對倍數(shù)變化［24］；每個樣本設3個平行，每組實驗重復3次，計算平均值和標準誤差。

1.2.4 表達SDR-X1的重組質(zhì)粒的構(gòu)建 提取香茅醇假單胞菌SJTE-3基因組DNA，以其為模板，利用引物 sdr-x1-F/R（5′-ggggggAAGCTTGCATGACGTTT ACCCGCCCTA-3′/5′-ggggggGAATTCGACATGCGCAAA GTCATGCTG-3′）擴增獲得基因sdr-x1片段；PCR 擴增條件為95℃ 3 min，變性95℃ 30 s，退火 55℃ 30 s，延伸 72℃ 1 min，30 個循環(huán)，72℃ 2 min，4℃ 5 min；電泳和DNA片段測序鑒定PCR產(chǎn)物。用限制性內(nèi)切酶（EcoR I和Hind III）處理PCR片段和質(zhì)粒pET28a后，用T4 DNA連接酶連接；轉(zhuǎn)化產(chǎn)物化學轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α菌株中，在含50 μg/mL卡那霉素的LB平板（LBK50）上涂布過夜培養(yǎng)后，獲得重組克??；提取質(zhì)粒后，測序鑒定重組質(zhì)粒序列，命名為質(zhì)粒pET-sdr-x1。

1.2.5 重組菌株BL21-SDR-X1對雌二醇的轉(zhuǎn)化測定 將重組質(zhì)粒pET-sdr-x1化學轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）菌株中，構(gòu)建重組菌株BL21-SDR-X1。挑取菌株BL21-SDR-X1單菌落，接種到含50 μg/mL卡那霉素的3 mL LB 培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)物按1∶100比例接種到新鮮的含50 μg/mL卡那霉素的10 mL LB培養(yǎng)基中搖培至OD600約0.6，加入0.1 mmol/L的異丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導培養(yǎng)5 h。4℃，8 000 r/min，離心5 min收集菌體，用無機鹽MM培養(yǎng)基洗滌3次，轉(zhuǎn)入100 mL 含10 μg/mL 17β-雌二醇或0.1%乙醇的無機鹽MM培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min搖培；分別在3 h、6 h、9 h、12 h、18 h、24 h取樣1 mL。每個樣品中加入1/3體積的乙腈震蕩，用0.22 μm有機濾器過濾后，HPLC測定其17β-雌二醇的殘留量與轉(zhuǎn)化產(chǎn)物（方法見1.2.2）；每個樣本設3個平行，每組實驗重復3次，計算平均值和標準誤差。

1.2.6 重組蛋白SDR-X1的表達純化 按照方法1.2.5，在200 mL LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組菌株BL21-SDR-X1，并用IPTG誘導蛋白SDR-X1表達。收集菌體后加入40 mL預冷的裂解緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，5 mmol/L 咪 唑，5 mmol/L β-巰基乙醇，1 mmol/L 苯甲基磺酰氟，10% 甘油，pH 8.0）重懸菌體。冰上超聲破碎菌體后，于4℃，12 000 r/min，離心40 min收集上清。將上清加入平衡緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，5 mmol/L 咪唑，10% 甘油，pH 8.0）平衡后的鎳柱中，孵育30 min后流出；利用60 mL洗滌緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑，10% 甘油，pH 8.0）洗去雜蛋白，用3 mL洗脫緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，150 mmol/L 咪唑，10% 甘油，pH 8.0）洗脫目標蛋白。15% SDS-PAGE蛋白電泳檢測純化的重組蛋白SDR-X1；利用BCA 蛋白檢測試劑盒測定重組蛋白SDR-X1濃度。

1.2.7 重組蛋白SDR-X1的酶學性質(zhì)測定 設計反應體系，測定重組蛋白SDR-X1轉(zhuǎn)化不同類固醇激素等物質(zhì)的性質(zhì)。反應體系包括反應緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，30 mmol/L NaCl）、200 μmol/L NAD+、不同濃度的重組蛋白SDR-X1、不同類固醇激素底物（17β-雌二醇、雌酮、17α-炔雌醇、睪酮或雙酚A）與多環(huán)芳烴底物（芴、蒽、萘或菲）；反應體系為200 μL，對照為不含酶的反應混合物。根據(jù)NADH產(chǎn)量表征底物的轉(zhuǎn)化情況，利用酶標儀（Tecan，上海，中國）測定NADH的產(chǎn)量，檢測激發(fā)波長為355 nm，發(fā)射波長為460 nm［25］。測定重組蛋白SDR-X1轉(zhuǎn)化17β-雌二醇的Km值和Vmax及其催化性質(zhì)，包括最適反應溫度與溫度耐受性（30℃-60℃），最適反應pH（pH 4-11）及二價金屬離子的作用（Zn2+，Mn2+，Mg2+，Ni2+，Ca2+和 Cu2+）等。在含 17β-雌二醇（0.1 mmol/L）的重組蛋白SDR-X1反應體系中，加入1/3體積的乙腈震蕩并用0.22 μm有機濾器過濾；利用HPLC方法，測定重組蛋白SDR-X1體外轉(zhuǎn)化17β-雌二醇的效率及轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。每組實驗設3個平行，重復3次，計算平均值和標準誤差。

2 結(jié)果

2.1 香茅醇假單胞菌SJTE-3中的蛋白WP_043267 487.1為短鏈脫氫酶

通過對香茅醇假單胞菌SJTE-3基因組的注釋和挖掘，我們發(fā)現(xiàn)其基因組中的基因A9C11_RS08750（1947150..1947896）編碼了一個屬于短鏈脫氫酶超家族的氧化還原酶（WP_043267487.1）；該基因被命名為sdr-x1，其編碼產(chǎn)物命名為SDR-X1。蛋白SDR-X1全長248個氨基酸，多序列比對顯示，蛋白SDR-X1與不同來源的SDR序列具有相似的二級結(jié)構(gòu)，其二級結(jié)構(gòu)含兩個SDR家族的保守基序，與輔因子結(jié)合的Rossmann-fold區(qū)域GXXXGXG（9-15 aa）和活性位點區(qū)域YXXXK（157-161 aa），其中第157位酪氨酸殘基為質(zhì)子受體，催化中心由高度保守的Tyr157、Ser143、Asn112和Lys161組成（圖1-A）。以來自于Polaromonas sp. JS666的SDR蛋白（4iqg.1.A）為模型，利用SWISSMODEL對蛋白SDR-X1 的同源建模結(jié)果顯示，蛋白SDR-X1的三維模型與蛋白4iqg.1.A的高級結(jié)構(gòu)十分類似（圖1-B）。進化分析顯示，蛋白SDR-X1與來源于睪丸酮單胞菌（C. testosteroni）P19的 FabG（WP_057091786.1）和赤紅球菌（Rhodococcus ruber）P14的短鏈脫氫酶（WP_010595922.1）進化距離較接近（圖1-C）。因此，香茅醇假單胞菌SJTE-3中的蛋白SDR-X1為一個典型短鏈脫氫酶。

圖1 蛋白SDR-X1的多序列比對、高級結(jié)構(gòu)模型與進化分析Fig.1 Multiple sequence alignment，advanced structural model and evolutionary analysis of SDR-X1 protein

2.2 17β-雌二醇可誘導基因sdr-x1的轉(zhuǎn)錄

香茅醇假單胞菌SJTE-3可利用17β-雌二醇、雌酮、17α-炔雌醇和睪酮等典型類固醇激素和多環(huán)芳烴［22］。因此，我們檢測了不同類固醇激素和多環(huán)芳烴對基因sdr-x1轉(zhuǎn)錄的誘導情況。與以乙醇為碳源的組別相比，當培養(yǎng)基中含有10 μg/mL的E2、E1和TES時，菌株SJTE-3中基因sdr-x1的轉(zhuǎn)錄水平可在24 h或18 h被誘導上調(diào)2倍以上；而10 μg/mL的EE2可在培養(yǎng)6 h后誘導基因sdr-x1的轉(zhuǎn)錄上調(diào)約1.6倍（圖2）。這些結(jié)果表明，香茅醇假單胞菌SJTE-3中的蛋白SDR-X1可能參與了這些激素物質(zhì)的降解。

圖2 基因sdr-x1在菌株SJTE-3以不同激素為碳源時的轉(zhuǎn)錄水平Fig.2 Transcription levels of the gene sdr-x1 in strain SJTE-3 with different steroid hormones as carbon sources

2.3 重組BL21-SDR-X1菌株與SDR-X1蛋白均可有效轉(zhuǎn)化17β-雌二醇

以10 μg/mL的E2為唯一碳源，培養(yǎng)菌株可高表達基因sdr-x1的重組菌株BL21-SDR-X1，利用HPLC檢測了其對E2的轉(zhuǎn)化效能。結(jié)果表明，重組菌株BL21-SDR-X1在3 h即可轉(zhuǎn)化超過40%的E2，24 h重組菌株對E2的轉(zhuǎn)化達到58.83%（圖3-A）。由于E2可被吸附到細胞表面，因此盡管對照組菌株BL21-pET28a對E2無降解作用，但溶液中的E2含量也有一定程度降低。這說明高表達基因sdr-x1可促進菌株對E2的降解。

通過異源表達與親和純化，我們獲得了重組蛋白SDR-X1。該蛋白大小為30.2 kD，蛋白產(chǎn)量約35 mg/L，純度不低于95%（圖3-B）。體外酶學反應結(jié)果顯示，蛋白SDR-X1以NAD+/NADH為反應輔因子，NADP+/NAD（P）H不能啟動其反應。通過檢測NADH產(chǎn)量測定重組蛋白SDR-X1對不同激素物質(zhì)和多環(huán)芳烴類的轉(zhuǎn)化效能，結(jié)果顯示該蛋白可在2 min內(nèi)轉(zhuǎn)化接近80%的E2或15%的睪丸酮，但對E1、E3、EE3及多環(huán)芳烴等均無反應。這說明重組蛋白SDR-X1對雌二醇與睪丸酮有較好的轉(zhuǎn)化效能；與已報道的睪丸酮叢毛單胞菌（C. testosterone）的SDR相比，該酶的轉(zhuǎn)化率更高，周期更短［17］。進一步測定了蛋白SDR-X1轉(zhuǎn)化E2的動力學常數(shù)。結(jié)果表明，該酶對E2轉(zhuǎn)化反應的 Km值為（0.039 86±0.004 061）mmol/L，Vmax值為（3.168±0.135）mmol/L/min/mg；其kcat值為1 595.06 /s，kcat/K比值為40 016.64/mmol/L/s（圖3-C）。這說明重組酶SDR-X1對E2的催化反應具有較高的特異性與轉(zhuǎn)化效能。

圖3 重組菌株BL21-SDR-X1對E2的轉(zhuǎn)化與重組蛋白SDR-X1純化及其對E2的轉(zhuǎn)化反應Fig.3 Efficacy determination of recombinant strain BL21-SDR-X1 for transforming E2，purification of recombinant protein SDR-X1 and its transformation reaction to E2

2.4 重組酶SDR-X1可穩(wěn)定高效轉(zhuǎn)化17β-雌二醇為雌酮

我們測定了重組酶SDR-X1的酶學性質(zhì)，包括最適溫度、最適pH、溫度耐受性與二價離子選擇性等；根據(jù)NADH的產(chǎn)量來表征該酶對底物的轉(zhuǎn)化情況［25］。最適溫度實驗是在不同溫度下反應15 min，測定酶SDR-X1對雌二醇的轉(zhuǎn)化效率。結(jié)果顯示，重組酶SDR-X1在30℃-60℃均可催化E2的氧化反應。在反應溫度不高于50℃ 時，該酶對E2的轉(zhuǎn)化效率隨溫度升高而提高；在50℃時反應15 min，該酶可轉(zhuǎn)化約60%的E2；但當反應溫度達到60℃，該酶對E2的轉(zhuǎn)化效率下降（圖4-A）。溫度耐受性實驗則是將酶在不同溫度下處理不同時間，再于37℃反應15 min測定酶SDR-X1對雌二醇的轉(zhuǎn)化效率。結(jié)果表明，在37℃條件下，隨著反應時間增加，該酶對E2的轉(zhuǎn)化率增加；在42℃和50℃條件下處理 30 min，對酶SDR-X1轉(zhuǎn)化E2的效率影響不顯著，但隨時間延長，其催化活性有所降低，說明該SDR-X1酶對溫度具有一定耐受性（圖4-B）。反應pH測定結(jié)果顯示，重組酶SDR-X1在pH 4-11時均可有效氧化E2，但在pH大于8的條件下效果較酸性條件好；但在偏酸與偏堿環(huán)境下，酶活性波動較大，測定誤差較大，因此后續(xù)測定選擇了pH 8.0的條件（圖4-C）。不同二價離子對該酶活性的影響結(jié)果如圖4-D所示，Zn2+，Cu2+對重組酶SDR-X1的活性具有顯著抑制作用，Ni2+也有一定的抑制作用；Mn2+，Mg2+，Ca2+可明顯促進該酶對E2的轉(zhuǎn)化。進一步，我們利用HPLC檢測了該酶催化雌二醇轉(zhuǎn)化反應的產(chǎn)物，結(jié)果顯示，重組酶SDR-X1對E2轉(zhuǎn)化反應的產(chǎn)物為E1；根據(jù)E2峰面積變化值來計算重組酶SDR-X1的轉(zhuǎn)化效率，該酶可在15 min內(nèi)將超過61.75%的E2轉(zhuǎn)化成E1（圖5）。利用HPLC方法測定雌二醇轉(zhuǎn)化效率較利用熒光檢測NADH產(chǎn)量表征的方法稍高，可能是由于溶液中NAD+/NADH平衡態(tài)所致誤差及熒光檢測誤差所致；故熒光檢測NADH產(chǎn)量可用于定性，HPLC檢測方法可更準確定量。因此，該重組酶SDR-X1可在較高溫度和較高pH條件下有效轉(zhuǎn)化E2為E1，降解效能穩(wěn)定。

圖4 重組酶SDR-X1轉(zhuǎn)化E2的酶學性質(zhì)測定Fig.4 Determination of the enzymatic properties of E2 transformed by recombinant enzyme SDR-X1

圖5 HPLC分析重組酶SDR-X1轉(zhuǎn)化E2的反應產(chǎn)物Fig. 5 HPLC analysis of reaction products of conversion of E2 by recombinase SDR-X1

3 討論

隨著工業(yè)與社會的發(fā)展，環(huán)境雌激素污染日益嚴重，已成為威脅人類社會與生物圈的重大環(huán)境問題之一。微生物降解是去除環(huán)境雌激素、修復污染環(huán)境的有效手段，但至今微生物降解雌激素的機制仍不明確。本研究鑒定了雌激素降解菌香茅醇假單胞菌SJTE-3中的短鏈脫氫酶SDR-X1，證實其具有SDR的保守結(jié)構(gòu)，屬于SDR超家族［26］；體內(nèi)和體外實驗表明該酶可被雌二醇誘導轉(zhuǎn)錄，有效轉(zhuǎn)化雌二醇為雌酮，確定了其底物譜與催化動力學常數(shù)及酶學性質(zhì)。

雌二醇向雌酮的轉(zhuǎn)化被認為是生物體啟動雌激素降解的首個步驟；細菌SDR超家族的氧化還原酶被發(fā)現(xiàn)可催化睪酮和17β雌二醇的氧化反應，是微生物降解類固醇激素的關鍵酶［8-11，15-18，25］。香茅醇假單胞菌SJTE-3能利用多種雌激素物質(zhì)（17β-雌二醇、雌酮、雌三醇和17α-炔雌醇）和一些多環(huán)芳烴（萘、菲、蒽）為碳源，將其有效降解［22］。本研究中鑒定的短鏈脫氫酶SDR-X1可被17β-雌二醇誘導轉(zhuǎn)錄，催化雌二醇的C17位氧化反應，其催化活性相似或高于已報道的雌激素降解SDR［11，14-17］。如紅球菌P14中17β-HSD 轉(zhuǎn)化E2的Km值和Vmax分別為 18.9 μmol/L 和 12.5 μmol/min/mg，惡臭假單胞菌SJTE-1中的17β-HSD催化E2轉(zhuǎn)化的Km值和Vmax分別為0.068 mmol/L和52.26 μmol/min/mg；本文鑒定的香茅醇假單胞菌SJTE-3中SDR-X1酶的Km值為（0.039 86±0.004 061）mmol/L，Vmax為（3.168±0.135）mmol/L/min/mg，高于紅球菌P14的17β-HSD活性，低于惡臭假單胞菌的17β-HSD活性，這和不同菌株對雌二醇的降解效能有關。降解酶的活性與穩(wěn)定性易受溫度、pH、離子條件等外界因素影響。該SDR-X1酶的降解效能穩(wěn)定，溫度耐受性較好，催化溫度范圍較其他短鏈脫氫酶較廣［15-16］。與已有的SDR類似，偏堿性環(huán)境有利于SDR-X1酶的反應［15，27］，這可能與偏堿性環(huán)境下雌二醇更易解離從而被轉(zhuǎn)化有關。有研究表明，添加鐵元素可以增強厭氧顆粒污泥（AnGS）對17β-雌二醇（E2）向雌酮的轉(zhuǎn)化，促進其去除［28］；本研究也發(fā)現(xiàn)部分二價金屬離子如Mn2+，Mg2+，Ca2+對該SDR-X1酶的活性具有顯著促進作用。因此，這說明香茅醇假單胞菌SJTE-3中的SDR-X1酶可穩(wěn)定有效轉(zhuǎn)化雌二醇，啟動該菌株對雌激素的代謝過程。本工作的完成可推動微生物中雌激素降解關鍵酶的功能研究與降解途徑解析。

4 結(jié)論

鑒定了香茅醇假單胞菌SJTE-3中的短鏈脫氫酶SDR-X1，該酶參與了菌株對雌激素的降解。SDR-X1酶屬于典型的短鏈脫氫酶超家族，可轉(zhuǎn)化17β-雌二醇為雌酮，轉(zhuǎn)化效率高，對溫度和pH具有一定耐受性，Mn2+、Mg2+和Ca2+可提升酶活性。