朱瑞利，毛琳琳，王 龍，易可可，孫靜文

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081）

磷是植物生長發(fā)育所必需的大量營養(yǎng)元素之一，參與植物體內(nèi)光合作用、能量代謝、酶促反應(yīng)和信號(hào)傳導(dǎo)等過程[1]。然而，土壤中的磷酸鹽容易被鐵鋁氧化物和氫氧化物以及Ca2+吸附，形成難溶性化合物，導(dǎo)致土壤中的有效磷含量很難滿足植物正常的生長需求[2]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，為提高農(nóng)作物產(chǎn)量，大量的磷肥被施入農(nóng)田。但是過量的、不合理的磷肥施用，導(dǎo)致磷肥利用率降低、磷礦資源日漸枯竭和環(huán)境污染等一系列問題[3-5]。綠肥通過吸收和活化土壤中的礦物質(zhì)為作物提供養(yǎng)分，其還田后能有效提高土壤肥力、降低肥料用量和改善土壤質(zhì)量[6]。綠肥是生態(tài)農(nóng)業(yè)的重要組成部分，發(fā)展綠肥產(chǎn)業(yè)符合綠色發(fā)展理念，對(duì)于推動(dòng)化肥減量增效、提升耕地質(zhì)量和促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展有著重要意義[7]。當(dāng)前綠肥作物的研究熱點(diǎn)集中在綠肥養(yǎng)分釋放規(guī)律、綠肥專性根瘤菌以及綠肥環(huán)境效益評(píng)價(jià)等方面?？傮w來說，綠肥作物研究側(cè)重于氮素養(yǎng)分方面，對(duì)磷素養(yǎng)分方面的關(guān)注較少。

毛葉苕子（Vicia villosa）是三大豆科綠肥作物之一，具有地域適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)草量高、營養(yǎng)價(jià)值高等特點(diǎn)，且其根瘤具有固氮作用。毛葉苕子在田間腐解速度快，在翻壓112 d后其植株中的氮、磷和鉀釋放量分別可達(dá)其總量的91.8%、95.1%和90.0%[8-10]，毛葉苕子還田能顯著提高土壤肥力，但是毛葉苕子對(duì)磷肥敏感，吸收利用土壤中難溶性磷酸鹽的能力較差[11]。因此，挖掘毛葉苕子高效利用磷的潛力，選育耐低磷、磷高效的品種，對(duì)減少磷肥施用量和促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

篩選和應(yīng)用耐低磷和磷高效品種，是提高作物磷素利用效率的有效途徑之一[12-13]。已有研究表明，植物耐低磷品種的篩選評(píng)價(jià)指標(biāo)有很多，如生物量[14]、根長[15]、酸性磷酸酶活性[16]、磷累積量[17]等。然而，目前植物耐低磷品種的篩選及耐低磷相關(guān)生理特性的研究主要集中在水稻[18]、玉米[16]、大豆[19]、苜蓿[20]和紫云英[21]等植物上，有關(guān)毛葉苕子耐低磷品種的篩選則少有報(bào)道。故本研究采用水培試驗(yàn)的方法，分析22個(gè)毛葉苕子品種在正常供磷和低磷脅迫下的主根長、株高、地上部干重、根系干重、地上部全磷含量和磷累積量的差異，通過各指標(biāo)權(quán)重和磷效率綜合值，確立毛葉苕子品種磷素利用的評(píng)價(jià)指標(biāo)體系，評(píng)估毛葉苕子品種的耐低磷特性并劃分不同磷效率類型。進(jìn)一步挑選2個(gè)耐低磷及2個(gè)低磷敏感品種進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，驗(yàn)證水培篩選結(jié)果的可靠性。本文旨在篩選出耐低磷且磷高效的品種，優(yōu)化篩選指標(biāo)，為選育毛葉苕子磷高效品種和研究綠肥作物耐低磷脅迫的生理機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為生長在中國北方的22個(gè)毛葉苕子品種（新疆毛苕、1399毛苕、內(nèi)毛葉苕、徐苕2號(hào)、特早熟毛苕、徐苕1號(hào)、81-244毛苕、法國毛苕、滬3-1毛苕、78-103毛苕、關(guān)中毛苕、蘇聯(lián)苕子、74-60毛苕、葡萄牙苕子、徐苕3號(hào)、81-84毛苕、78-171毛苕、山東早熟苕、81-243毛苕、81-245毛苕、青苕1號(hào)、土庫曼毛苕），由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所曹衛(wèi)東研究員提供。

供試土壤為輕質(zhì)潮土，采于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院德州鹽堿土改良實(shí)驗(yàn)站禹城試驗(yàn)基地（36°49′ N，116°34′ E）中未施磷肥的試驗(yàn)地。其基本理化性質(zhì)：全氮1.07 g/kg，有效磷3.7 mg/kg，速效鉀206.70 mg/kg，有機(jī)質(zhì)8.93 g/kg，pH 7.61。

1.2 試驗(yàn)方法

耐低磷品種的篩選試驗(yàn)于2020年進(jìn)行。篩選試驗(yàn)設(shè)置2個(gè)處理：1）正常磷（NP，200 μmol/L Pi），2）低磷（LP，2 μmol/L Pi），每個(gè)處理重復(fù)3次。在智能光照培養(yǎng)箱（型號(hào)：PRX-1000DLED-30）中，采用漂浮育苗的方法，在Hoagland改良營養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，營養(yǎng)液pH統(tǒng)一調(diào)為6.3±0.1，試驗(yàn)每隔3 d更換1次營養(yǎng)液。具體步驟如下：1）稱取0.3～0.4 g飽滿的毛葉苕子種子，用75%的酒精消毒后晾干，置于含有紗布的培養(yǎng)皿中，在25℃光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行催芽；2）待胚根露出3 cm后，移至1/2 Hoagland營養(yǎng)液中培養(yǎng)7 d，再移至不同磷濃度（NP，200 μmol/L Pi；LP，2 μmol/L Pi）的營養(yǎng)液中培養(yǎng)；3）連續(xù)處理14 d后分別測(cè)定正常磷和低磷條件下毛葉苕子的主根長、株高、地上部干重、根系干重和地上部全磷含量。光照培養(yǎng)箱條件為：12 h光照，25℃，光照強(qiáng)度30000 LX；12 h黑暗，22℃；60%濕度。正常磷條件下營養(yǎng)液組分為1.3 mmol/L NH4NO3、0.19 mmol/L K2SO4、200 μmol/L NaH2PO4·2H2O、0.37 mmol/L CaCl2·2H2O、0.38 mmol/L MgSO4·7H2O、50 μmol/L H3BO3、10 μmol/L MnCl2·4H2O、0.76 μmol/L ZnSO4·7H2O、0.32 μmol/L CuSO4·5H2O、0.016 μmol/L（NH4）6MO7O24·4H2O、77 μmol/L Na2Fe-EDTA。低磷處理營養(yǎng)液中NaH2PO4·2H2O為2 μmol/L，其余養(yǎng)分含量與正常磷處理相同。

盆栽試驗(yàn)于2021年進(jìn)行。將備好的營養(yǎng)液作為基肥添加到低磷土壤中，添加量如下：50 mg/kg N，100 mg/kg K2O。試驗(yàn)采用雙因素隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)置兩個(gè)磷水平：1）正常磷（NP，添加200 mg/kg P2O5），2）低磷（LP，添加 0 mg/kg P2O5）；4個(gè)毛葉苕子品種，5次重復(fù)，共種植40盆，試驗(yàn)于溫室進(jìn)行。具體步驟如下：1）土壤經(jīng)過風(fēng)干后過2 mm土篩，過篩后混合均勻，每盆放入2 kg風(fēng)干土；2）每盆土澆灌含氮、磷、鉀養(yǎng)分的營養(yǎng)液800 mL[NP處理：0.2 g CO（NH2）2、0.4 g K2SO4、2 g CaH2PO4；LP處理：0.2 g CO（NH2）2、0.4 g K2SO4]，使?fàn)I養(yǎng)液完全浸潤土壤；3）毛葉苕子種子放于培養(yǎng)箱進(jìn)行催芽；4）每盆種植5株長勢(shì)一致的毛葉苕子，并于表面覆蓋100 g干土；5）種植30 d后分別測(cè)定正常磷和低磷條件下毛葉苕子的株高、地上部干重和地上部全磷含量。試驗(yàn)期間，土壤含水量保持在田間持水量的20%左右。

1.3 測(cè)定指標(biāo)

取不同供磷條件下水培培養(yǎng)14 d的毛葉苕子幼苗，每組取10株植株測(cè)量株高及主根長；取毛葉苕子根和地上部，105℃下殺青30 min，80℃烘干至恒重后，分別稱量地上部及根干重，并計(jì)算根冠比；采用H2SO4-H2O2消煮法和鉬銻抗比色法測(cè)定毛葉苕子地上部全磷含量[22]。

取盆栽條件下培養(yǎng)30 d的毛葉苕子植株，每組取5株植株進(jìn)行株高、地上部干重和全磷含量的測(cè)定。

涉及公式如下：

耐低磷系數(shù)=低磷處理下某性狀測(cè)定值/正常磷處理下某性狀測(cè)定值；

根冠比=根系干重/地上部干重；

地上部磷累積量=地上部干重×地上部全磷含量；地上部磷利用率=地上部干重/地上部磷累積量[23]。

1.4 指標(biāo)權(quán)重計(jì)算公式

式中：Wj為指標(biāo)權(quán)重；Wj*為權(quán)重分配系數(shù)；Fp為主成分p的方差貢獻(xiàn)率占總貢獻(xiàn)率的比重[13]。

1.5 磷效率綜合值計(jì)算

利用隸屬函數(shù)法[24-25]，以磷效率綜合值[26]來表示不同供磷條件下不同毛葉苕子品種的磷素營養(yǎng)狀況[13]。隸屬函數(shù)值計(jì)算：

式中，Uij表示i品種j評(píng)價(jià)指標(biāo)磷效率隸屬函數(shù)值；Xij表示i品種j評(píng)價(jià)指標(biāo)的綜合值；Xjmin、Xjmax分別表示j綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)的最小、最大綜合值。

各綜合指標(biāo)權(quán)重：

式中，Wj表示第j個(gè)綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)在所有綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)中的重要程度，即權(quán)重；rj表示各基因型第j個(gè)綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率。

磷效率綜合值計(jì)算：

式中，D表示不同毛葉苕子品種的磷效率綜合值。

1.6 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2019和SPSS 22進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，利用最大方差正交旋轉(zhuǎn)法進(jìn)行主成分分析，運(yùn)用Rstudio 和GraphPad Prism 8進(jìn)行聚類熱圖分析，并繪制散點(diǎn)圖和柱形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 低磷脅迫對(duì)不同毛葉苕子品種苗期性狀的影響

如表1所示，毛葉苕子株高的耐低磷系數(shù)變化范圍為0.55～0.95，所有品種都小于1；地上部干重的耐低磷系數(shù)變化范圍為0.41～1.23，其中有17個(gè)品種小于1，這說明低磷脅迫明顯降低了毛葉苕子的地上部干重和株高。根冠比和根系干重的耐低磷系數(shù)變化范圍分別為0.66～3.22和0.46～1.61，其中分別有15個(gè)和11個(gè)品種大于1，這表明了低磷脅迫可以促進(jìn)毛葉苕子的根系生長；主根長的耐低磷系數(shù)變化范圍為0.44～1.18，其中僅僅有2個(gè)品種大于1；地上部全磷含量和磷累積量的耐低磷系數(shù)均小于1，變化范圍分別為0.19～0.91和0.09～0.91。

表1 不同毛葉苕子品種各性狀指標(biāo)的耐低磷系數(shù)

如表2所示，在低磷條件下，變異系數(shù)表現(xiàn)為地上部磷累積量＞地上部干重＞根系干重＞根冠比＞地上部全磷含量＞主根長＞株高；在正常磷條件下，變異系數(shù)表現(xiàn)為地上部磷累積量＞地上部全磷含量＞地上部干重＞根冠比＞根系干重＞主根長＞株高。綜合分析，不同供磷水平下，地上部干重和地上部磷累積量的變異系數(shù)較大，在不同品種間存在顯著性差異。因此，初步選擇這2個(gè)指標(biāo)作為篩選毛葉苕子耐低磷品種的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

表2 不同供磷水平下毛葉苕子各性狀指標(biāo)的變異系數(shù)

2.2 毛葉苕子苗期各性狀的主成分分析

對(duì)上述7個(gè)指標(biāo)的耐低磷系數(shù)進(jìn)行主成分分析，利用最大方差正交旋轉(zhuǎn)法提取3個(gè)主成分，其貢獻(xiàn)率分別為37.612%、24.701%和16.490%（表3）。其中第1主成分的特征值為2.633，對(duì)應(yīng)較大的特征向量是地上部全磷含量和地上部干重；第2主成分特征值為1.729，載荷較高的是地上部磷累積量和根系干重；第3主成分特征值為1.154，載荷較高的是主根長和株高。將7個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)轉(zhuǎn)化為3個(gè)相互獨(dú)立的綜合指標(biāo)，這些綜合指標(biāo)可以代表原始指標(biāo)78.803%的信息。分析各指標(biāo)權(quán)重發(fā)現(xiàn)，地上部干重和磷累積量這2個(gè)指標(biāo)的權(quán)重較大，因此選用這2個(gè)指標(biāo)作為毛葉苕子耐低磷能力的評(píng)價(jià)指標(biāo)，這與通過變異系數(shù)篩選出的指標(biāo)相一致。

表3 毛葉苕子苗期各性狀指標(biāo)的主成分分析

2.3 毛葉苕子耐低磷品種篩選及其磷效率類型評(píng)價(jià)

2.3.1 不同毛葉苕子品種的聚類分析

將不同供磷水平下毛葉苕子的地上部干重和磷積累量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后，采用平方歐式距離法將22個(gè)毛葉苕子品種聚類劃分為3類：A類屬于低磷敏感型品種，包括81-245毛苕、青苕1號(hào)、蘇聯(lián)苕子和毛苕74-60，其地上部干重和磷積累量在不同供磷條件下均偏低；B類屬于中間型品種，有12個(gè)，表現(xiàn)出地上部干重和磷積累量在不同供磷條件下處于中等水平；C類屬于耐低磷型品種，分別為徐苕3號(hào)、法國毛苕、78-171毛苕、山東早熟苕、滬3-1毛苕和78-103毛苕，其地上部干重和磷累積量在不同供磷條件下均較高（圖1）。

圖1 不同基因型毛葉苕子聚類熱圖

2.3.2 不同毛葉苕子品種的磷效率類型評(píng)價(jià)

根據(jù)磷效率綜合值，將不同基因型的毛葉苕子分成4類（圖2）：第Ⅰ類屬于正常磷低效低磷高效型（低磷高效型），有5個(gè)品種；第Ⅱ類屬于正常磷高效低磷高效型（雙高效型），包括徐苕3號(hào)、法國毛苕、徐苕2號(hào)、滬3-1毛苕、特早熟毛苕和山東早熟苕；第Ⅲ類屬于正常磷低效低磷低效型（雙低效型），包括葡萄牙毛苕、蘇聯(lián)苕子、81-243毛苕、新疆毛苕、青苕1號(hào)、內(nèi)毛葉苕、關(guān)中毛苕、81-84毛苕和81-245毛苕；第Ⅳ類屬于正常磷高效低磷低效型（正常磷高效型），包括毛苕74-60和78-171毛苕。

圖2 不同供磷水平下毛葉苕子磷效率綜合值散點(diǎn)圖

2.4 不同供磷水平對(duì)盆栽毛葉苕子苗期性狀的影響

挑選耐低磷品種（法國毛苕、徐苕3號(hào)），低磷敏感品種（81-245毛苕、青苕1號(hào)）進(jìn)行不同供磷水平下的盆栽試驗(yàn)。如圖3A和B所示，同一供磷水平下，不同毛葉苕子品種地上部長勢(shì)差異明顯，而耐低磷品種的株高在不同供磷水平下無顯著差異。在正常磷及低磷脅迫條件下，法國毛苕的株高較青苕1號(hào)分別增加16.54%和22.83%，這表明青苕1號(hào)受到低磷脅迫的抑制作用較大，對(duì)低磷處理較敏感。如圖3C所示，與低磷條件相比，在正常磷條件下，徐苕3號(hào)和法國毛苕的地上部干重分別增加了60.80%和62.83%，青苕1號(hào)和81-245毛苕的地上部干重分別增加了41.34%和56.01%。在正常磷條件下，徐苕3號(hào)和法國毛苕的地上部干重較青苕1號(hào)分別高44.15%和55.30%，這表明徐苕3號(hào)和法國毛苕在養(yǎng)分充足時(shí)能高效利用磷養(yǎng)分。如圖3D所示，在正常供磷條件下，法國毛苕和徐苕3號(hào)的地上部磷累積量顯著高于青苕1號(hào)和81-245毛苕，而在低磷條件下，各品種間地上部磷累積量沒有顯著差異，這表明徐苕3號(hào)和法國毛苕有較強(qiáng)吸收磷素的能力。如圖3E可知，與正常磷相比，低磷脅迫會(huì)提高植物的磷利用率，法國毛苕和徐苕3號(hào)在低磷條件下的地上部磷利用率分別增加了64.39%和68.64%，青苕1號(hào)和81-245毛苕的地上部磷利用率分別增加了62.87%和51.35%。在低磷條件下，徐苕3號(hào)和法國毛苕的磷利用率較青苕1號(hào)分別高出40.99%和25.29%。綜上，法國毛苕和徐苕3號(hào)屬于磷高效型品種，青苕1號(hào)和81-245毛苕屬于磷低效型品種，該結(jié)果也證明了利用地上部干重和磷累積量對(duì)不同毛葉苕子品種的篩選評(píng)價(jià)是有效且可信的。

圖3 毛葉苕子各品種在不同供磷水平下的苗期表型及性狀變化

3 討論

植物的生命活動(dòng)離不開磷素，低磷脅迫會(huì)阻礙植物的生長發(fā)育，降低植物的凈光合速率，從而出現(xiàn)植株生長遲緩、矮小，地上部生物量減少和全磷含量降低等現(xiàn)象[20，27-31]。植物根系是吸收養(yǎng)分的主要器官，所以在應(yīng)對(duì)低磷脅迫時(shí)植物通常采用增加根冠比、促進(jìn)主根生長和刺激側(cè)根發(fā)育等策略來擴(kuò)大吸收磷的表面積，以吸收更多的磷[32]。低磷脅迫對(duì)耐低磷小麥的長勢(shì)、地上部干重影響較小，而對(duì)磷敏感材料的生長抑制作用較大[33]。所以植株形態(tài)、地上部干重、生物量分配和全磷含量等指標(biāo)對(duì)揭示品種間耐低磷特性具有重要意義。曾進(jìn)等[23]通過測(cè)定地上部干重、根系干重、根冠比、地上全磷含量及磷積累量等14個(gè)指標(biāo)篩選出耐低磷油茶，劉允熙等[34]利用干重和全磷含量篩選出磷高效型柱花草。因此本研究選用主根長、株高、地上部干重、根系干重、地上部全磷含量和磷累積量作為毛葉苕子篩選的評(píng)價(jià)指標(biāo)。在不同磷濃度條件下，毛葉苕子的生長發(fā)育發(fā)生了一系列變化（表1），低磷脅迫降低了毛葉苕子的株高、地上部干重、地上部全磷含量和磷累積量，增加了根冠比，而對(duì)不同毛葉苕子品種的主根長和根干重有抑制或促進(jìn)兩種不同影響，可能的原因是低磷對(duì)不同毛葉苕子品種根系發(fā)育的影響程度不同，這與禾本科植物在低磷條件下的響應(yīng)相一致[35]。

由于植物應(yīng)對(duì)低磷脅迫是由多個(gè)基因參與的，為避免采用單一指標(biāo)無法準(zhǔn)確反映植物耐低磷特性，本文通過主成分分析將7個(gè)毛葉苕子篩選指標(biāo)轉(zhuǎn)化為3個(gè)綜合指標(biāo)，并分析各指標(biāo)權(quán)重，發(fā)現(xiàn)地上部干重和磷累積量的權(quán)重較大（表3）。此外本研究也發(fā)現(xiàn)毛葉苕子在不同供磷水平下，地上部干重和磷累積量的變異系數(shù)較大，在不同品種間存在顯著差異（表2）。結(jié)合苑乂川等[35]、劉允熙等[34]和龔絲雨等[13]采用低磷脅迫時(shí)的生物量和磷累積量等指標(biāo)作為植物耐低磷能力評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)，最終確定地上部干重和磷累積量可作為毛葉苕子耐低磷的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

植物磷效率包含兩種含義，一種是在低磷條件下植物能夠利用有限的磷養(yǎng)分維持正常生長的能力，即耐低磷；另一種是在正常供磷條件下，植物吸收磷素并轉(zhuǎn)化為干物質(zhì)的能力，即磷高效[36]。本文對(duì)耐低磷評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行聚類分析，將22個(gè)毛葉苕子品種對(duì)低磷脅迫的耐受性劃分為低磷敏感型，中間型和耐低磷型3類（圖1）。已有研究表明水稻[18]、玉米[16]和大豆[19]等作物不同基因型品種的磷素利用效率存在顯著差異，本研究依據(jù)磷效率綜合值，將22個(gè)毛葉苕子品種的磷效率類型劃分為正常磷高效低磷高效型（雙高效型）、正常磷低效低磷低效型（雙低效型）、正常磷高效低磷低效型和正常磷低效低磷高效型4類（圖2）。綜合耐低磷品種的聚類分析與磷效率類型劃分結(jié)果表明：1）在耐低磷型品種中，有4個(gè)雙高效型品種（徐苕3號(hào)、法國毛苕、滬3-1毛苕和山東早熟苕）；2）在不耐低磷型品種中，有3個(gè)雙低效型品種（81-245毛苕、青苕1號(hào)和蘇聯(lián)苕子）。耐低磷能力強(qiáng)的品種在磷素供應(yīng)不足時(shí)能維持正常生長，如磷高效且耐低磷型的玉米表現(xiàn)出較強(qiáng)的吸收磷素的能力，并能對(duì)體內(nèi)的磷進(jìn)行有效分配，磷利用效率高，在低磷條件下仍能保持較高的生物量[37]。本文盆栽試驗(yàn)結(jié)果也表明，在正常磷處理下，磷高效品種徐苕3號(hào)和法國毛苕的株高、地上部干重和地上部磷累積量均顯著高于磷低效品種青苕1號(hào)和81-245毛苕；在低磷脅迫下，耐低磷品種徐苕3號(hào)和法國毛苕的地上部干重和磷利用率顯著高于低磷敏感品種青苕1號(hào)和81-245毛苕（圖3）。

4 結(jié)論

本研究對(duì)22個(gè)毛葉苕子品種進(jìn)行耐低磷性及磷效率的篩選和評(píng)價(jià)，綜合低磷篩選指標(biāo)的聚類分析及磷效率類型的評(píng)價(jià)結(jié)果，最終篩選出徐苕3號(hào)、法國毛苕、滬3-1毛苕和山東早熟苕為耐低磷且磷高效型品種，81-245毛苕、青苕1號(hào)和蘇聯(lián)苕子為低磷敏感且磷低效品種。地上部干重和磷累積量可作為苗期篩選耐低磷毛葉苕子品種的參考指標(biāo)。