韋柳丹，鄭亞楠，王 丹

(南寧師范大學(xué) 化學(xué)與材料學(xué)院，廣西 南寧 530001)

0 引言

汞已被廣泛應(yīng)用于汽車(chē)制造、煉油、電力、能源電池等多個(gè)行業(yè)[1-4]。工業(yè)大生產(chǎn)導(dǎo)致大量汞隨工業(yè)廢水排放到自然環(huán)境中，排放的汞污染隨著生物鏈極易進(jìn)入人體，并在人體內(nèi)不斷累積，導(dǎo)致嚴(yán)重的腦損傷和腎臟疾病[5-8]。為了有效防御汞污染的暴露對(duì)人類(lèi)的危害，開(kāi)發(fā)經(jīng)濟(jì)、實(shí)用、實(shí)時(shí)的汞污染現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)技術(shù)極為重要。目前，檢測(cè)汞離子的常用技術(shù)手段有原子吸收光譜法(AAS)、原子熒光光譜法(AFS)、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)等[9-12]。這些方法具有良好的靈敏度和選擇性，但是在使用這些檢測(cè)方法時(shí)也存在很多局限性。比如，儀器維護(hù)成本高、預(yù)處理復(fù)雜、工作環(huán)境要求高、依賴專(zhuān)業(yè)的操作人員等缺點(diǎn)，極大地限制了它們作為野外便攜式設(shè)備用于自然環(huán)境中汞污染的簡(jiǎn)單和快速分析。

熒光光譜分析法是檢測(cè)重金屬的有力工具。迄今為止，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了大量的熒光探針用于檢測(cè)金屬離子，包括納米粒子、生物分子、化學(xué)小分子和高分子聚合物等[13-16]。其中，熒光蛋白可利用其固有的或者構(gòu)建的金屬離子結(jié)合特性，有效地檢測(cè)金屬離子[17-22]。此外，由于可遺傳編碼的特性，熒光蛋白在追蹤活細(xì)胞內(nèi)的金屬動(dòng)力學(xué)方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[23]。然而，由于制備和保存的困難，它們?cè)趯?shí)踐中幾乎沒(méi)有應(yīng)用于金屬污染的檢測(cè)。因此，值得嘗試去克服這些限制，將熒光蛋白應(yīng)用于工業(yè)廢水中重金屬離子的現(xiàn)場(chǎng)可視化檢測(cè)。

本項(xiàng)研究成功設(shè)計(jì)了能夠響應(yīng)Hg2+信號(hào)的熒光蛋白突變體 (mCherry L199C)。如圖1，變體蛋白mCherry L199C是通過(guò)在熒光蛋白發(fā)射團(tuán)附近引入一個(gè)半胱氨酸，Hg2+與半胱氨酸殘基的結(jié)合會(huì)改變發(fā)色團(tuán)周?chē)h(huán)境的對(duì)稱(chēng)性，進(jìn)而促使熒光發(fā)生猝滅。經(jīng)性能測(cè)試分析發(fā)現(xiàn)，隨著Hg2+濃度的增加該熒光生物傳感器的熒光強(qiáng)度不斷降低，而在加入Hg2+的螯合劑EDTA以后，其熒光強(qiáng)度又可以很大程度的恢復(fù)。其次，該熒光生物傳感器對(duì)目標(biāo)金屬離子Hg2+的響應(yīng)程度遠(yuǎn)高于其它金屬離子，并且在干擾離子存在的情況下其對(duì)Hg2+的響應(yīng)程度基本不受影響?；谠摕晒馍飩鞲衅髁己玫捻憫?yīng)性能，利用蛋白質(zhì)固定化技術(shù)開(kāi)發(fā)了一種蛋白-瓊脂糖凝膠試紙，實(shí)現(xiàn)了水環(huán)境中汞污染的簡(jiǎn)單、便捷和快速的可視化檢測(cè)。

圖1 熒光蛋白mCherry發(fā)色團(tuán)的周?chē)h(huán)境及突變體L199C的響應(yīng)機(jī)理

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑和儀器

本試驗(yàn)所用的酶購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司，所涉及到的引物合成及測(cè)序均由上海生工生物工程有限公司完成，所有化學(xué)試劑均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技有限公司，配制緩沖液的試劑除特殊說(shuō)明均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭Ｋ褂脙x器主要包括熒光分光光度計(jì)(日本島津，RF-6000)、紫外分光光度計(jì)(日本島津，UV-3600PLUS)、圓二色光譜儀(英國(guó)應(yīng)用光物理，Chirascan)和紫外暗室分析儀(上海寶山谷村電光儀器廠，ZF-20D)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 熒光生物傳感器表達(dá)載體的構(gòu)建

通過(guò)分子克隆和定點(diǎn)突變技術(shù)把mCherry及突變體mCherryL199C的基因片段克隆至質(zhì)粒pET28α中，獲得mCherry及突變體mCherryL199C的表達(dá)載體。具體流程如下：首先利用PCR技術(shù)從模板質(zhì)粒上大量擴(kuò)增mCherry基因片段；接著，利用限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI對(duì)載體質(zhì)粒pET28α和目的基因mCherry片段分別進(jìn)行雙酶切，從而使它們各自帶有相同的粘性末端；最后，使用T4 DNA連接酶將載體質(zhì)粒pET28α和目的基因片段mCherry連接，實(shí)現(xiàn)mCherry-pET28α表達(dá)載體的構(gòu)建。構(gòu)建的載體經(jīng)PCR初步鑒定成功后送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，以確?；蛐蛄型耆_。以mCherry-pET28α重組質(zhì)粒為模板，使用 PCR定點(diǎn)突變技術(shù)，獲得突變體mCherryL199C-pET28α的表達(dá)載體。將這些表達(dá)載體通過(guò)化學(xué)法分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)菌株中，用于后續(xù)的誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 熒光生物傳感器的體內(nèi)表征實(shí)驗(yàn)

將構(gòu)建好的表達(dá)菌株mCherry-pET28α(對(duì)照組)和mCherryL199C-pET28α(實(shí)驗(yàn)組)分別接種至含30 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，在溫度為37℃轉(zhuǎn)速為250 r/min的條件下過(guò)夜培養(yǎng)。過(guò)夜培養(yǎng)的菌液和培養(yǎng)基按1∶100的比例進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，直至菌液的濁度值OD600=0.5～0.6時(shí)，加入終濃度0.5 mM的IPTG在16°C進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)12 h。將表達(dá)目的蛋白的菌液濁度值調(diào)至OD600=1后，按8 mL/管進(jìn)行分裝并通過(guò)高速離心的方式進(jìn)行收集。菌餅用10 mM的PBS緩沖液洗滌兩次后，使用1 mL的10 mM的PBS緩沖液重懸。向重懸的菌液中加入不同濃度的Hg2+后，在室溫避光條件下在搖床上孵育1.5 h，之后使用熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光值。本實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各平行做四組，結(jié)果取四組數(shù)據(jù)的平均值。

1.2.3 熒光生物傳感器的表達(dá)及純化

將構(gòu)建好的表達(dá)載體mCherryL199C-pET28α按1.2.2步驟中所述的方式進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)12 h后，通過(guò)高速離心的方式進(jìn)行收集。菌餅使用10 mM的PBS緩沖液重懸洗滌兩次，再經(jīng)10 mL 超聲裂解液(10 mM Tris-HCl，200 mM NaCl，25 mM咪唑，5% 甘油)重懸后超聲30 min(超3 s，停5 s，功率為25%)。超聲破碎的細(xì)胞離心后獲得上清溶液，并使用0.22 μm的濾膜進(jìn)行過(guò)濾。把含有目的蛋白的上清溶液置Ni-NTA金屬螯合層析柱上，利用親和層析法對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化。目的蛋白最終在不斷提高咪唑濃度(75～200 mM)的緩沖液中進(jìn)行線性洗脫，最終獲得含有His-標(biāo)簽的目的蛋白mCherry L199C。目的蛋白經(jīng)蛋白酶HRV3C過(guò)夜低溫酶切后去除標(biāo)簽，最終獲得不帶標(biāo)簽的mCherry L199C，用于后續(xù)的性能表征實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 汞離子熒光生物傳感器的性能測(cè)試實(shí)驗(yàn)

為了測(cè)定熒光蛋白生物傳感器對(duì)Hg2+響應(yīng)的靈敏度，將不同濃度的Hg2+(0～10 μM)加入到純化后的蛋白溶液中，室溫避光條件下放置搖床上孵育0.5 h后，用熒光分光光度計(jì)測(cè)定蛋白樣品的熒光強(qiáng)度。近一步，向加入Hg2+以后熒光強(qiáng)度發(fā)生變化的蛋白質(zhì)樣品中，再添加不同濃度的金屬螯合劑EDTA孵育0.5 h后測(cè)熒光，觀察熒光是否能夠恢復(fù)。

為了測(cè)定熒光蛋白生物傳感器對(duì)Hg2+響應(yīng)的特異性，分別將8種金屬離子(Cr3+，Cd2+，Pb2+，Ni2+，Cu2+，Zn2+，Ag+和Fe3+)添加到純化后的蛋白溶液中，用上述同樣的方式處理后測(cè)定樣品熒光值。為了測(cè)定熒光蛋白生物傳感器識(shí)別Hg2 +的抗干擾性能。將1 μM Hg2+和5 μM其他金屬離子(Cr3+，Cd2+，Pb2+，Ni2+，Cu2+，Zn2+，Ag+和Fe3+)的混合物分別添加到蛋白溶液中，用上述同樣的方式處理后測(cè)定樣品熒光值。

為了研究Hg2+對(duì)傳感器二級(jí)結(jié)構(gòu)及發(fā)色團(tuán)環(huán)境的影響，將不同濃度的Hg2+(0～3.33 μM)添加到蛋白溶液中，室溫黑暗條件下放置搖床孵育0.5 h，分別使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)和圓二色光譜儀(CD)測(cè)定其吸收光譜。

1.2.5 蛋白-瓊脂糖凝膠試紙的制備及對(duì)Hg2+的檢測(cè)

為了實(shí)現(xiàn)對(duì)Hg2+的簡(jiǎn)單、便捷和快速的可視化檢測(cè)，我們利用熱可逆的凝膠瓊脂糖凝膠封裝熒光蛋白制備了蛋白-瓊脂糖凝膠試紙，并使用智能手機(jī)的內(nèi)置攝像頭與紫外暗箱燈開(kāi)發(fā)了在線檢測(cè)Hg2+濃度的便攜式設(shè)備。具體制備過(guò)程為：將加熱熔化的瓊脂糖溶液(0.75%)逐漸冷卻至37℃，然后與熒光蛋白溶液按體積比為5∶3的比例均勻混合。取450 μL混合液放在模具中冷卻定型，并將定型后的凝膠固定在試紙條上。滴加30 μL不同濃度Hg2+溶液在凝膠中心。然后將放置凝膠試紙條放入紫外暗室分析儀，在室溫下孵育5 min后，利用1600萬(wàn)像素的智能手機(jī)在365 nm紫外光照射下拍攝。最后，使用ImageJ軟件對(duì)捕獲圖片中每個(gè)凝膠小球的亮度進(jìn)行量化，計(jì)算出強(qiáng)度值用作數(shù)據(jù)分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 熒光生物傳感器的體內(nèi)表征實(shí)驗(yàn)

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明(圖2)，在0～100 μM Hg2+濃度范圍內(nèi)，mCherry的熒光值幾乎沒(méi)有任何變化。但是，所設(shè)計(jì)的熒光生物傳感器mCherry L199C在濃度為10 μM Hg2+的存在下，熒光發(fā)生明顯的下降。繼續(xù)增加Hg2+濃度至100 μM后，所設(shè)計(jì)的傳感器mCherry L199C熒光幾乎完全淬滅。由此可知，通過(guò)分子設(shè)計(jì)改構(gòu)的熒光蛋白突變體mCherry L199C可響應(yīng)Hg2+的信號(hào)。

圖2 對(duì)照組mCherry和實(shí)驗(yàn)組mCherry L199C對(duì)Hg2+響應(yīng)

2.2 熒光生物傳感器響應(yīng)靈敏度及可逆性響應(yīng)能力

為了便于分析，將測(cè)定的熒光值運(yùn)用ΔF/ΔFmax值擬合，繪制熒光猝滅曲線(圖3)。如圖所示，在0～10 μM Hg2+濃度范圍內(nèi)，隨著Hg2+濃度的增加，體系熒光值不斷下降，在Hg2+濃度達(dá)到10 μM的溶液中，約99%的熒光被猝滅且淬滅非常迅速，在約0.5 min內(nèi)能夠達(dá)到平穩(wěn)。并且傳感器的熒光在完全猝滅情況下，隨著金屬螯合劑EDTA濃度的不斷增加，其熒光也得到逐漸的恢復(fù)，能恢復(fù)到其原始熒光的80%。綜上表明，本設(shè)計(jì)的熒光生物傳感器可快速的響應(yīng)Hg2+的信號(hào)，并且Hg2+與該傳感器的結(jié)合具有可逆性，在一定濃度的強(qiáng)絡(luò)合物條件下其熒光可很大程度的恢復(fù)。

圖3 熒光生物傳感器的猝滅曲線及熒光恢復(fù)柱狀圖

2.3 熒光生物傳感器的選擇性及抗干擾能力

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出(圖4)，濃度為5 μM的金屬離子(Cr3+，Ni2+，Pb2+，Cd2+，Cu2+，Zn2+，Ag+和Fe3+)對(duì)傳感器的熒光幾乎沒(méi)有影響。而向上述溶液添加濃度為5 μM Hg2+后，傳感器的熒光猝滅程度達(dá)到98%，猝滅程度與單獨(dú)加入Hg2+的溶液相比并沒(méi)有太大的差異。結(jié)果表明，在Hg2+與其他金屬混合的條件下，蛋白對(duì)汞離子的識(shí)別不會(huì)受到其他金屬離子影響,證實(shí)了該傳感器對(duì)目標(biāo)金屬離子Hg2+具有良好的選擇性，并且在有其它金屬離子存在時(shí)，其對(duì)Hg2+的特異性響應(yīng)不受影響，具有較強(qiáng)的抗干擾能力。

圖4 熒光生物傳感器對(duì)單一金屬和混合金屬的選擇性測(cè)定

2.4 熒光生物傳感器的響應(yīng)機(jī)理研究

圖5 熒光生物傳感器的圓二色光譜和紫外光譜表征

紫外-可見(jiàn)光譜分析表明，加入Hg2+，熒光生物傳感器mCherry L199C去質(zhì)子化發(fā)色團(tuán)在波長(zhǎng)584 nm處的出現(xiàn)峰值吸收下降。當(dāng)在1 μM傳感器溶液中添加終濃度3.33 μM Hg2+后，在584 nm處的吸光度降低了5倍。同時(shí)，在質(zhì)子化發(fā)色團(tuán)在450 nm處的吸光度隨著Hg2+濃度的提高不斷上升，并且在500 nm波長(zhǎng)處達(dá)到等值吸收。與紫外吸收光譜對(duì)應(yīng)，該傳感器圓二色光譜的近紫外范圍內(nèi)也出現(xiàn)兩個(gè)相應(yīng)的負(fù)峰。以上實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象表明，Hg2+與傳感器發(fā)色團(tuán)周?chē)?99位引入的半胱氨酸殘基配位后，將改變發(fā)色團(tuán)環(huán)境的對(duì)稱(chēng)性,破壞發(fā)色團(tuán)激發(fā)過(guò)程中的質(zhì)子轉(zhuǎn)移過(guò)程，從而使質(zhì)子化的發(fā)色團(tuán)比例下降，進(jìn)而促使熒光發(fā)生猝滅。

2.5 蛋白-瓊脂糖凝膠試紙對(duì)Hg2+的檢測(cè)

通過(guò)對(duì)蛋白-瓊脂糖凝膠試紙的分析(圖6)，可以發(fā)現(xiàn)試紙的熒光強(qiáng)度隨著Hg2+濃度的增加而降低。當(dāng)Hg2+濃度達(dá)到10 μM時(shí)，蛋白的熒光立即被淬滅。用Image J分析可知，熒光強(qiáng)度隨著Hg2+的增加在0～10 μM的濃度范圍內(nèi)線性減小，數(shù)據(jù)顯示出良好的線性相關(guān)性(R2= 0.996)(數(shù)據(jù)點(diǎn)代表至少3個(gè)獨(dú)立平行實(shí)驗(yàn)的平均值)。當(dāng)?shù)渭訚舛葹?0 μM其他金屬離子時(shí)，試紙的熒光強(qiáng)度與滴加Hg2+的形成較大反差，未發(fā)生明顯變化。由此證明了蛋白-瓊脂糖凝膠試紙可以作為高通量篩選工具用于初步檢測(cè)自然界中汞污染的存在，通過(guò)這種策略可以實(shí)現(xiàn)對(duì)Hg2+的現(xiàn)場(chǎng)快速可視化檢測(cè)。

圖6 蛋白-瓊脂糖凝膠試紙檢測(cè)性能測(cè)試結(jié)果圖

3 結(jié)論

本研究成功利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)，在粉紅色熒光蛋白mCherry的發(fā)色團(tuán)附近引入易于Hg2+配位的半胱氨酸殘基，通過(guò)Hg2+與半胱氨酸殘基結(jié)合后對(duì)發(fā)色團(tuán)環(huán)境的改變，設(shè)計(jì)出熒光猝滅型的生物傳感器。該傳感器可以快速可逆的響應(yīng)微摩爾濃度的Hg2+信號(hào)，并且對(duì)Hg2+的響應(yīng)具有良好特異性和抗干擾能力。此外，利用蛋白質(zhì)固定化技術(shù)制備的凝膠試紙，不但操作過(guò)程簡(jiǎn)單、成本廉價(jià)、所需時(shí)間較短，還可以實(shí)現(xiàn)汞污染的現(xiàn)場(chǎng)可視化檢測(cè)，有應(yīng)用價(jià)值。