胡婧 李愛紅 馮金榮

(1. 南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，南通 226001；2. 南通大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，南通 226001)

真菌感染臨床常見，主要包括淺部感染和深部感染，一般侵犯皮膚黏膜、指甲等，組織反應(yīng)較輕，但嚴重時可侵染組織和內(nèi)臟，引起全身播散性感染，甚至引起免疫受損人群的死亡[1]。白念珠菌是一種常見的真菌病原，其導(dǎo)致的感染占所有念珠菌屬感染的50%左右[2]。研究發(fā)現(xiàn)，白念珠菌的致病性與多種致病因子相關(guān)，包括黏附分子(纖連蛋白)、形態(tài)改變(單細胞酵母細胞和菌絲態(tài)細胞的轉(zhuǎn)換)、菌體分泌蛋白水解酶類(天冬酰胺蛋白酶、磷脂酶)、生物膜的形成等[3]。

研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)的翻譯后修飾與白念珠菌的形態(tài)調(diào)控存在密切聯(lián)系。其中，SUMO(small ubiquitin-like modifier)是一種小分子泛素樣修飾蛋白，作為翻譯后修飾的重要手段，可在不同生理條件下與蛋白質(zhì)進行共價連接，以調(diào)節(jié)其生物學(xué)功能。釀酒酵母中，SMT3是SUMO家族的唯一成員，為必需基因，但通過表達人類SUMO-1可以回復(fù)SMT3純合子缺失突變體的致死性[4]。釀酒酵母SUMO蛋白酶Ulp2的缺失會逆轉(zhuǎn)SUMO蛋白的修飾作用，嚴重影響細胞的適應(yīng)性[5]。白念珠菌中，SUMO連接酶(E3)Wos1與細胞白-灰轉(zhuǎn)換調(diào)節(jié)因子Wor1相互作用并調(diào)節(jié)Wor1的SUMO化修飾[6]。目前，白念珠菌中單一的SUMO編碼基因SMT3已被鑒定，其缺失影響細胞形態(tài)，對氧化脅迫和細胞壁脅迫敏感。但SMT3的這些生物學(xué)功能對其在致病性過程中的影響卻尚未知[7]。

白念珠菌毒力研究常用的動物模型包括小鼠、線蟲等。近來，大蠟螟(Galleriamellonella)幼蟲作為宿主研究病原體的致病作用，逐漸受到學(xué)者的重視[8]。相對于小鼠等，大蠟螟具有操作簡便、購買便捷且價格低廉、生命周期短等優(yōu)勢，且其毒力實驗結(jié)果與哺乳動物模型有很好的均一性。目前，大蠟螟幼蟲作為宿主研究病原體的致病作用已在國際上有較多報道[9-11]，但國內(nèi)學(xué)者利用大蠟螟模型研究白念珠菌的致病作用卻相對較少。本文主要建立大蠟螟感染白念珠菌模型，并探索SMT3基因在白念珠菌致病性調(diào)控中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株與質(zhì)粒 白念珠菌野生型菌株SN148、pV1093和pFA-HA-ARG4質(zhì)粒由加拿大康考迪亞大學(xué)Whiteway教授饋贈。

培養(yǎng)基 酵母浸膏蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基(yeast extract pentose dextrose medium，YPD medium)、酵母氮源培養(yǎng)基(yeast nitrogen base medium，YNB medium)和合成培養(yǎng)基(synthetic defined medium，SD medium)等均按標準配方配制；固體培養(yǎng)基中添加2%瓊脂粉。SD-Arg-Ura選擇性培養(yǎng)基中缺少精氨酸、尿嘧啶。

主要試劑 常規(guī)Taq酶購自北京全式金生物技術(shù)公司；OneTaq購自NEB公司，StuⅠ內(nèi)切酶購自TAKARA公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自北京天漠生物科技公司；LiAC、ssDNA等常規(guī)生化試劑購自上海生工生物工程股份有限公司；DNA Marker購自上海捷瑞生物工程公司；大蠟螟購自河南科云生物公司。

1.2 方法

引物設(shè)計與合成 白念珠菌SMT3基因核酸序列來自白念珠菌基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.candidagenome.org/)，序列分析和引物設(shè)計經(jīng)由Benchling網(wǎng)站(http://www.benchling.com)在線分析完成。引物由上海捷瑞生物工程公司合成。本研究相關(guān)引物見表1。

表1 引物序列

白念珠菌的轉(zhuǎn)化 參考前文方法[12]，將白念珠菌野生型菌株SN148過夜培養(yǎng)后用于轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化子涂布于固體SD-Arg選擇培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)2～3 d后檢查轉(zhuǎn)化子生長情況。

白念珠菌菌落PCR 挑取純化后的新鮮轉(zhuǎn)化子，采用NEB公司的OneTaq酶直接進行PCR反應(yīng)。

SMT3基因缺失菌株的構(gòu)建 采用瞬時CRISPR/Cas9 系統(tǒng)構(gòu)建SMT3缺失菌株：利用引物P7和P8，以pV1093質(zhì)粒為模板，PCR擴增Ca9基因；利用引物P1和SMT3-sg-R擴增sgRNA-1片段，利用引物SMT3-sg-F和P4擴增sgRNA-2片段，并以sgRNA-1和sgRNA-2片段為模板，以P5和P6為引物，PCR擴增完整的sgRNA片段；以pFA-HA-ARG4為模板，SMT3-Re-F和SMT3-Re-R為引物，PCR擴增出修復(fù)片段。將Cas9、sgRNA和修復(fù)片段共轉(zhuǎn)化白念珠菌野生型菌株，將轉(zhuǎn)化子純化后，利用SMT3-Te-F和SMT3-Te-R進行菌落PCR檢測。

SMT3基因缺失菌株的形態(tài)檢測 將白念珠菌野生型菌株SN148和SMT3缺失株分別接種至YPD液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)至穩(wěn)定期后于光鏡下觀察菌體形態(tài)。同時，將菌液進行1/10梯度稀釋，分別取3 μL原液、10-1、10-2、10-3、10-4梯度稀釋液點接到Y(jié)PD固體培養(yǎng)基上，于30℃培養(yǎng)2～3 d，觀察菌株生長情況。隨后，用流水沿平板表面緩慢沖洗(不直接沖洗菌落)，直至無明顯菌體被洗下，檢查菌體侵入培養(yǎng)基的情況。

SMT3基因缺失株的生物被膜形成試驗 根據(jù)前文方法[13]，檢測白念珠菌野生型SN148和SMT3缺失株的生物被膜形成情況。

毒力實驗 本實驗使用的大蠟螟幼蟲體重均為300～400 mg，舍棄活力較弱有黑色斑點的不健康幼蟲，保留體態(tài)勻稱、色澤瑩白的健康幼蟲。隨機挑選10條健康幼蟲置于同一培養(yǎng)皿中為一組。將白念珠菌過夜培養(yǎng)物，進行超聲處理以離散黏連細胞，并用生理鹽水稀釋后涂布YPD固體培養(yǎng)基，于30 ℃培養(yǎng)2～3 d后進行菌落計數(shù)，并將原液用生理鹽水稀釋至5×107CFU/mL。微量注射器(高鴿，25 μL)用75%乙醇浸泡滅菌10 min，用無菌水沖洗3次。用微量注射器吸取10 μL白念珠菌懸液，從大蠟螟幼蟲倒數(shù)第二足刺入完成注射。注射后觀察幼蟲，如出現(xiàn)5～8 h內(nèi)迅速惡化的幼蟲則視為注射失敗并剔除出實驗。注射完成后，將幼蟲置于30 ℃避光培養(yǎng)，每天觀察生存情況并記錄。將瀕死蟲體置于10%中性福爾馬林固定液中浸泡48 h，取出后置于30%蔗糖溶液中脫水48 h，進行冰凍切片，并利用PAS糖原染色試劑盒(北京索萊寶)進行染色。

大蠟螟幼蟲血細胞分析 為觀察大蠟螟血細胞中白念珠菌，利用CAI4-GFP (ura3::imm434/ura3::imm434 pAM5.6)菌株，其自身已攜帶GFP綠色熒光標記。為研究白念珠菌感染大蠟螟幼蟲后的血細胞，隨機挑選4條健康幼蟲于同一培養(yǎng)皿中為一組，分別將10 μL白念珠菌野生型菌株SN148、SMT3缺失株懸液(5×107CFU/mL)注射大蠟螟幼蟲，20 h后取血淋巴。將20 μL血淋巴與20 μL的臺酚藍染液混勻，于光鏡下用血球計數(shù)板進行血細胞計數(shù)并分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 SMT3基因缺失菌株構(gòu)建

采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除SMT3基因[12]：分別于體外擴增Cas9基因、SMT3基因sgRNA和帶有ARG4標記的修復(fù)DNA片段，轉(zhuǎn)化后通過菌落PCR直接鑒定轉(zhuǎn)化子基因型(見圖1A)。利用檢測引物SMT3-Te-F和SMT3-Te-R，在野生型菌株中能擴出約1.0 kb條帶，而SMT3基因被ARG4替換后，則能擴出約3.0 kb的片段。如圖1A所示，1～4泳道中轉(zhuǎn)化子能擴出單一的約3.0 kb片段，表明SMT3基因敲除成功。

2.2 SMT3基因缺失對形態(tài)發(fā)生和生物被膜形成的影響

研究表明，SMT3基因缺失導(dǎo)致液體培養(yǎng)基中白念珠菌呈菌絲狀生長[7]，本實驗進一步檢測了SMT3基因缺失株在固體培養(yǎng)基中的侵入生長能力。在YPD液體培養(yǎng)基中，SMT3缺失株細胞串珠樣比例明顯上升，細胞普遍伸長；而野生型菌株在鏡下呈典型的酵母態(tài)(見圖1B)。在YPD固體培養(yǎng)基上，野生型菌株SN148菌落較為平整；而SMT3缺失株菌落表面和邊緣粗糙；用流水緩慢沖洗后，SMT3缺失株幾乎不能被洗去，呈現(xiàn)較強的侵入生長能力(見圖1C)。

鑒于白念珠菌菌絲態(tài)生長和生物被膜形成有一定的相關(guān)性，本實驗通過生物被膜形成實驗發(fā)現(xiàn)，與野生型菌株相比，SMT3缺失株的生物被膜形成能力明顯增強，A595值=1.0，約為野生型菌株的2.5倍(見圖1D)。

圖1 SMT3缺失株的基因型檢測及形態(tài)分析. A. SMT3敲除與檢測; B. 液體培養(yǎng)基中SMT3缺失株的形態(tài); C. SMT3缺失株在固體培養(yǎng)基上的浸入生長分析; D. SMT3缺失株的生物被膜形成實驗(成對樣本t檢測)

2.3 SMT3基因缺失菌株的毒力檢測

為檢測SMT3基因缺失對白念珠菌毒力的影響，本研究建立了大蠟螟感染模型，檢測了SMT3缺失株的毒力，并以野生型菌株為對照。注射10 d后，生理鹽水組大蠟螟幼蟲(n=5)全部保持存活，表明注射不會明顯傷及大蠟螟的存活；感染野生型菌株的幼蟲注射后逐漸死亡，10 d時仍有3只蟲體保持存活，平均存活期為8.5 d；注射SMT3缺失株的幼蟲9 d時全部死亡，平均存活期僅為3.5 d(見圖2A、2B)。這一結(jié)果表明，SMT3基因的缺失導(dǎo)致白念珠菌致病能力上升。通過組織切片也發(fā)現(xiàn)(見圖2C)，白念珠菌SMT3缺失株和野生型菌株均能在大蠟螟幼蟲體內(nèi)以菌絲態(tài)形式存在。

圖2 SMT3基因缺失對白念珠菌致病性的影響. A. 感染白念珠菌大蠟螟幼蟲的生存曲線； B. 受感染大蠟螟幼蟲的存活情況； C. 受感染大蠟螟幼蟲組織切片(糖原染色) 圖3 SMT3缺失對血細胞的破壞作用. A大蠟螟血細胞與白念珠菌互作； B. 大蠟螟幼蟲血細胞總數(shù)測定(成對樣本t檢測)

2.4 SMT3缺失對大蠟螟血細胞的破壞作用檢測

為進一步分析SMT3缺失株對大蠟螟的致病作用，我們檢測了感染白念珠菌后大蠟螟血細胞的存活情況。將帶有GFP熒光標記的白念珠菌野生型菌株注射大蠟螟后，發(fā)現(xiàn)其血細胞中帶有綠色熒光信號；隨著感染時間延長，較多數(shù)量的血細胞攜帶綠色熒光信號，說明大蠟螟血細胞可以吞噬白念珠菌(見圖3A)。隨后，我們分析了感染白念珠菌野生型菌株和SMT3缺失株后大蠟螟的血細胞數(shù)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染SMT3缺失株的大蠟螟幼蟲中存活的血細胞數(shù)約為1.4×107/mL，明顯低于野生型組(2.9×107/mL,P<0.05)，說明SMT3缺失導(dǎo)致白念珠菌對大蠟螟幼蟲血細胞的破壞作用增強(見圖3B)。

3 討 論

白念珠菌的菌體形態(tài)與其致病性存在密切聯(lián)系，探索其形態(tài)發(fā)生機制對闡明白念珠菌的致病機理及臨床白念珠菌病的防治具有重要的指導(dǎo)意義。本實驗通過CRISPR/Cas9基因敲除系統(tǒng)快速構(gòu)建了SMT3純合子缺失菌株，發(fā)現(xiàn)SMT3基因缺失導(dǎo)致細胞在液體培養(yǎng)基中呈菌絲狀生長，在固體培養(yǎng)基中呈現(xiàn)侵入生長，這一結(jié)果與SUMO聚合酶UBC9和連接酶MMS21等基因缺失株細胞形態(tài)類似，說明SUMO修飾相關(guān)基因在形態(tài)調(diào)控中發(fā)揮類似的作用[13-14]。但迄今未有對SUMO修飾相關(guān)基因在白念珠菌致病性調(diào)控中的作用進行研究。本文發(fā)現(xiàn)SMT3缺失導(dǎo)致白念珠菌在大蠟螟模型中毒力顯著增強，通過分析大蠟螟血細胞發(fā)現(xiàn)，其對血細胞的破壞作用也顯著增強。白念珠菌的菌絲狀生長對于其逃逸宿主免疫細胞的殺傷以及深部感染有重要作用[15]。本文發(fā)現(xiàn)，SMT3缺失導(dǎo)致細胞呈菌絲狀生長，可能增強了其通過菌體延伸逃逸并破壞大蠟螟血細胞的作用，表現(xiàn)出毒力增強。實驗中，SMT3缺失導(dǎo)致血細胞數(shù)量減少也進一步驗證了這一推測。需要指出的是，由于SMT3缺失株呈現(xiàn)菌絲狀生長，導(dǎo)致細胞黏連，難以通過常規(guī)的血球計數(shù)板進行計數(shù)，而通過平板CFU計數(shù)可能會導(dǎo)致細胞數(shù)偏大，部分影響其毒力情況。此外，本實驗中敲除SMT3基因時引入了ARG4標記，也可能會對毒力實驗結(jié)果造成一定的影響。后續(xù)仍需進一步驗證SUMO修飾其他相關(guān)基因如SUMO聚合酶UBC9、SUMO連接酶MMS21、SIZ1等在致病性調(diào)控中的作用，以明確SUMO修飾相關(guān)途徑對白念珠菌致病性的調(diào)控作用。

哺乳動物的先天免疫反應(yīng)與真菌病原體的防御有關(guān)，這種免疫反應(yīng)也同樣存在于昆蟲體內(nèi)，因此分析昆蟲對真菌病原體的應(yīng)答對研究真菌毒力有一定意義[16]。相對于小鼠等動物模型，大蠟螟幼蟲易于購買和接種，無需投入大量資金和進行復(fù)雜操作；由于幼蟲體積小、生命周期短，它們易于處理且能在短期內(nèi)提供結(jié)果；幼蟲的死亡率、血細胞(免疫細胞)數(shù)量的變化及幼蟲血細胞內(nèi)病原體的增殖程度，都是檢測菌體毒性和蟲體免疫反應(yīng)的良好指標。因此，大蠟螟幼蟲為測定微生物毒性提供了一種簡便快速的方法，也成為了此類實驗中哺乳動物模型的有效替代品[8,17]。本文的結(jié)果，對進一步將大蠟螟模型廣泛應(yīng)用于白念珠菌及其他致病微生物毒力和致病機制研究具有一定的指導(dǎo)意義。