徐鳳嬌 婁新宇 王遠(yuǎn)舟 韓子宇 仲國維

(1.南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，南京 211166；2.南京市雨花臺(tái)區(qū)疾控中心檢驗(yàn)科，南京 210012)

煙曲霉(Aspergillusfumigatus)是環(huán)境中常見的一種條件致病真菌，可引起免疫正常人群過敏癥狀，免疫功能低下人群可進(jìn)展為侵襲性肺曲霉病，有一定的死亡率[1]。巨噬細(xì)胞可吞噬并清除入侵的分生孢子。該過程主要依靠巨噬細(xì)胞膜表面受體與孢子細(xì)胞壁表面的β-(1，3)葡聚糖配體的相互識(shí)別[2]，其中涉及到的受體有Toll樣受體(Toll like receptors, TLRs)、樹突狀細(xì)胞相關(guān)C型植物凝集素1(dectin-1)、銜接蛋白髓樣分化因子88(MyD88)等[3]。受體對(duì)配體的識(shí)別迅速觸發(fā)了巨噬細(xì)胞對(duì)煙曲霉分生孢子的吞噬作用[4-5]。吞噬作用通常依賴肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白等運(yùn)動(dòng)蛋白以及酪氨酸激酶和磷酸肌醇-3-磷酸激酶等介導(dǎo)的細(xì)胞骨架系統(tǒng)局部重排，形成吞噬杯對(duì)孢子進(jìn)行吞噬[6]。

巨噬細(xì)胞對(duì)吞噬后的孢子發(fā)揮殺滅作用依賴于免疫通路誘導(dǎo)的細(xì)胞因子的釋放以及其自身產(chǎn)生的活性氧中間體。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠肺泡巨噬細(xì)胞表面受體TLR2、TLR4均能介導(dǎo)核因子(nuclear factor-κB, NF-κB)的活化，核因子可進(jìn)一步通過激活轉(zhuǎn)錄并釋放白介素IL-1β和腫瘤壞死因子α(TNF-α)[7]。酵母中dectin-1能與TLR2協(xié)同誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞系TNF-α、IL-1β、IL-12以及趨化因子MIP-2等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，另外還可誘導(dǎo)NADPH氧化酶(NOX)的活化來調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫應(yīng)答[8]。煙曲霉孢子侵染巨噬細(xì)胞系也會(huì)激活NADPH氧化酶，產(chǎn)生活性氧簇ROS，而ROS可通過誘導(dǎo)自噬降解細(xì)胞內(nèi)的煙曲霉孢子[9]。

我們通過小鼠骨髓源巨噬細(xì)胞(bone marrow-derived macrophages, BMMs)來進(jìn)一步研究發(fā)掘巨噬細(xì)胞響應(yīng)煙曲霉孢子侵染過程中發(fā)揮重要作用的基因，首先提取了小鼠原代骨髓細(xì)胞并在體外將其培養(yǎng)誘導(dǎo)分化成BMMs；其次，用煙曲霉A1160c菌株的孢子去侵染BMMs；最后，將感染組與未感染對(duì)照組的BMMs進(jìn)行RNA測(cè)序和比較分析，尋找感染過程中和孢子吞噬、免疫信號(hào)通路以及孢子清除相關(guān)的重要差異表達(dá)基因。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所用材料及來源如下：生物安全柜、細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)，RPMI1640培養(yǎng)液和胎牛血清(Gibco)，青霉素-鏈霉素、胰蛋白酶(Beyotime)，TRIzol reagent、MCSF(Invitrogen)，C57BL/6小鼠(Slaccas)。煙曲霉野生型對(duì)照菌株為A1160c株，來自于本實(shí)驗(yàn)室菌庫。本研究所用培養(yǎng)基為YAG豐富培養(yǎng)基，具體配制見參考文獻(xiàn)[10]。將A1160c孢子接種到Y(jié)AG平板上，37℃培養(yǎng)2 d左右，用含有0.02%吐溫-80水溶液收集孢子，40 μm濾膜過濾掉菌絲，PBS洗兩次，血球計(jì)數(shù)板調(diào)整計(jì)數(shù)后待用。

1.2 BMMs的分離、培養(yǎng)和感染

依據(jù)之前報(bào)道[11-12]的方法。從8至12周齡的C57BL/6小鼠獲得股骨和脛骨，75%乙醇消毒并用PBS沖洗，剪斷骨兩端。用1 mL注射器吸取RPMI 1640完全培養(yǎng)基沖洗取出骨髓細(xì)胞，吹散并過200目細(xì)胞篩，離心棄上清。加入2 mL紅細(xì)胞裂解液重懸靜置5 min，離心棄上清。沉淀用PBS清洗兩次，將骨髓細(xì)胞重懸于含有2 mmol/L L-谷氨酸、50 mg/L慶大霉素、100 U/mL青霉素/鏈霉素、10%胎牛血清和20 ng/mL巨噬細(xì)胞集落刺激因子(MCSF)的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，分裝于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(1×106個(gè)細(xì)胞/孔)中，置于37℃和5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第3天補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基。細(xì)胞孵育6 d后進(jìn)行孢子感染實(shí)驗(yàn)。感染時(shí)，用1×107個(gè)孢子/孔的數(shù)量來感染BMMs(分生孢子與BMMs的比例為10∶1)作為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)未做感染處理的細(xì)胞作為對(duì)照組，每組樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，同時(shí)孵育8 h。之后通過用冰冷的PBS洗滌BMMs來停止感染，收集細(xì)胞，迅速液氮淬滅。

1.3 文庫構(gòu)建和上機(jī)測(cè)序

用TRIzol?Reagent從樣品中分離總RNA，Nanodrop 2000檢測(cè)RNA的濃度和純度。建庫試劑盒為NEBNext?UltraTM RNA Library Prep Kit。通過 Oligo(dT)磁珠富集帶有polyA尾的mRNA。加入NEB Fragmentation Buffer用二價(jià)陽離子將得到的mRNA隨機(jī)打斷成200 bp左右的小片段。以片段化mRNA為模版，用M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物合成cDNA第一條鏈。隨后RNase H降解RNA鏈并合成cDNA第二條鏈。純化后的雙鏈cDNA經(jīng)過加入End Repair Mix將其補(bǔ)成平末端、3'末端加A尾并連接測(cè)序接頭adapter。用AMPure XP beads篩選350 bp左右的cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并再次使用AMPure XP beads純化PCR產(chǎn)物，最終獲得文庫。文庫定量并稀釋至1.5 ng/μL。使用HiSeq PE Cluster Kit v4-cBot-HS在cBot Cluster Generation System上進(jìn)行樣本聚類。在聚類完成后，把不同文庫按照有效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量pooling后進(jìn)行Illumina測(cè)序(Illumina Hiseq X-Ten,Origin-gene Bio-pharm)。

1.4 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)生成和分析

首先用Cutadap修剪reads中的adapter序列、5'端含有非AGCT的堿基、測(cè)序質(zhì)量值小于Q20的reads、含N的比例達(dá)到10%的reads以及長度小于25 bp的小片段。用FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)對(duì)修剪后的序列進(jìn)行質(zhì)量驗(yàn)證。用Hisat2將所得的reads與參考基因組小鼠GRCm38(Ensemble92)比對(duì)，將比對(duì)到參考基因組上的數(shù)據(jù)用StringTie裝配。

在用edgeR package篩選差異表達(dá)基因檢測(cè)過程中，以1

2 結(jié) 果

2.1 煙曲霉A1160c孢子感染BMMs

將獲取的C57BL/6小鼠骨髓細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后，在第6天通過光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。從圖1可以看出，未被分生孢子感染的對(duì)照組BMMs形態(tài)多樣且呈不規(guī)則形(見圖1a)，說明巨噬細(xì)胞分化和貼壁生長狀態(tài)良好；而被煙曲霉A1160c分生孢子侵染8 h的BMMs，由于吸附和吞噬了大量煙曲霉分生孢子，細(xì)胞形態(tài)膨脹成圓形(見圖1b)。

圖1 煙曲霉A1160c分生孢子侵染BMMs. a. 對(duì)照未處理BMMs； b. A1160c分生孢子侵染8 h(分生孢子與巨噬細(xì)胞的比例為10∶1)之后的BMMs(比例尺為100 μm) 圖2 對(duì)照組BMMs與A1160c感染組BMMs之間差異基因表達(dá)統(tǒng)計(jì). a. 差異基因表達(dá)的火山圖：紅色代表上調(diào)，藍(lán)色代表下調(diào)，黑色代表不顯著；b. 差異表達(dá)基因的分層聚類樹狀圖：紅色代表上調(diào)，綠色代表下調(diào)

2.2 BMMs感染組與對(duì)照組間的差異表達(dá)基因數(shù)量

將A1160c分生孢子感染組的BMMs與未處理組BMMs的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析比較，總共有4 870個(gè)基因被鑒定為DEGs (differentially expressed genes)(P<0.05，-1>log2FC> 1)，包括1 787個(gè)上調(diào)基因和3 093個(gè)下調(diào)的基因，下調(diào)DEGs數(shù)量明顯多于上調(diào)DEGs數(shù)量(見圖2和https://github.com/eWingEye/CNN_Aspergillus)。

2.3 與吞噬、免疫和ROS產(chǎn)生相關(guān)基因的改變

本次結(jié)果中，BMMs與煙曲霉分生孢子識(shí)別相關(guān)的細(xì)胞表面Toll樣受體Tlr2及其互作基因Tollip分別上調(diào)2.94和4.26倍；C型植物凝集素受體Clec4e和Clec5a的表達(dá)分別上調(diào)31.40和2.43倍。而與BMMs吞噬孢子相關(guān)的差異表達(dá)基因有Src和Myh10，分別上升4.36倍和2.40倍。

基于KEGG通路注釋，BMMs響應(yīng)分生孢子侵染過程中的免疫信號(hào)通路包括Toll樣受體信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路(見圖3)、Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(Janus kinase/signal transducers and activators of transcription, JAK/STAT)信號(hào)通路、B細(xì)胞受體和T細(xì)胞受體信號(hào)通路均被不同程度地激活。

圖3 NF-κB通路差異表達(dá)基因 KEGG通路注釋圖。圖中有紅色/藍(lán)色邊框的基因?qū)儆诓町惐磉_(dá)基因，其中紅色代表上調(diào)基因，藍(lán)色代表下調(diào)基因

分析上述免疫通路中表達(dá)上調(diào)的基因，其中起免疫正調(diào)控的基因有白介素及其受體如Il1a、Il1b、Il7r等，分別上調(diào)72.29、8.42和7.29倍；腫瘤壞死因子TNF家族中的Tnf、Traf1、Tnfsf14(Light)、Tnfrsf13c、Ltb等，分別上調(diào)53.57、7.95、3.85、3.73和3.49倍；酪氨酸激酶中的Lck和Tec都上調(diào)3.31倍；T-細(xì)胞激活連接蛋白Lat上升13.23倍；核因子NF-κB家族中的Nfκb1(p50)和Relb分別上調(diào)2.20和2.34倍；黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤轉(zhuǎn)位基因Malt1上升14.27倍；生長抑制DNA損傷基因Gadd45b升高44.97倍；環(huán)氧化酶Ptgs2(cox-2)升高340.07倍；原癌基因Jun升高17.36倍；糖原合成酶激酶Gsk3b升高2.06倍；細(xì)胞表面抗原Cd83、Cd200、Cd40、Cd109和Cd28等，分別上調(diào)19.52、16.77、9.82、9.18和7.67倍。發(fā)揮免疫負(fù)調(diào)控作用的基因如Il1rn、Tnfaip3、Socs1、Socs3、Cish、Ctla4、Cblb、Cdkn1a、Lilrb4、Nfκbia(Iκba)等，分別上調(diào)31.88、16.05、4.50、4.35、4.39、4.12、3.83、3.45、3.27和3.64倍。此外，趨化因子及其受體受體Cxcl1、Cxcl2、Cxcl10、Ccl2、Ccl3、Ccl4、Cxcr5、Ccrl2、Ccr6和Ccr7等的表達(dá)也分別增加了136.93、825.54、14.21、19.36、81.10、130.43、4.62、78.17、4.93和4.90倍。

與活性氧簇ROS產(chǎn)生的相關(guān)基因中，Nos2、Nlrp3、Hif1a和Bax，分別上調(diào)24.15、4.47、2.01和2.34倍；Glul和Nostrin都降低了55%?？沟蛲鲆蜃覤cl2、Bcl2l1和Mcl1的表達(dá)水平也均上調(diào)。

3 討 論

巨噬細(xì)胞通過表面模式識(shí)別受體如TLRs和dectin-1識(shí)別煙曲霉孢子細(xì)胞壁上的β-(1，3)葡聚糖，并對(duì)細(xì)胞骨架進(jìn)行重組，從而產(chǎn)生依賴?yán)野彼峒っ负土姿峒〈?3-磷酸激酶活性的孢子吞噬，進(jìn)一步通過相關(guān)細(xì)胞因子的分泌和天然免疫應(yīng)答對(duì)真菌產(chǎn)生免疫響應(yīng)[13]。本研究顯示，煙曲霉孢子激活了BMMs的Toll樣受體基因Tlr2、C型凝集素受體基因Clec4e和Clec5a。這說明Tlr2、Clec4e和Clec5a是本研究中BMMs的主要識(shí)別受體，尤其是Clec4e基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)了31.40倍。另外，非受體酪氨酸激酶Src和肌球蛋白Myh10表達(dá)上調(diào)，說明巨噬細(xì)胞對(duì)煙曲霉孢子產(chǎn)生了吞噬作用[6]。

BMMs接觸孢子后，信號(hào)被細(xì)胞表面受體傳至NF-κB、JAK-STAT、B細(xì)胞和T細(xì)胞受體等免疫信號(hào)通路，導(dǎo)致這些通路在不同程度上被激活。免疫調(diào)控基因如白介素Il1、腫瘤壞死因子Tnf家族、酪氨酸激酶、NF-κB家族和細(xì)胞表面抗原等轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)，都表明煙曲霉孢子的侵染引發(fā)了BMMs的強(qiáng)烈免疫響應(yīng)。其中，被激活的核因子NF-κB可將刺激信號(hào)傳遞到細(xì)胞核中激活Tnf和Il1b等細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平，Il1b能夠促進(jìn)產(chǎn)生趨化因子及其受體，而Tnf可以活化和調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞提高其清除病原的能力以及增強(qiáng)超氧陰離子產(chǎn)生等[14](見圖3)。另外，NF-κB通路抑制基因Nfκbia(Iκba)、Nfκbie和Nfκbib的轉(zhuǎn)錄水平也上調(diào)，這表明該通路同時(shí)被負(fù)調(diào)控，對(duì)維持細(xì)胞穩(wěn)定性起重要作用。

缺氧狀態(tài)下，缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄[15]。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中Hif1a的上調(diào)說明BMMs內(nèi)有可刺激細(xì)胞產(chǎn)生ROS的低氧環(huán)境。一氧化氮合酶編碼基因Nos2轉(zhuǎn)錄上調(diào)，推測(cè)可直接合成NO輔助殺菌。NO可促進(jìn)促凋亡蛋白BAX的表達(dá)[16]，而ROS可以作為NLRP3炎癥小體被激活的信號(hào)[17-19]。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中也發(fā)現(xiàn)了Bax和Nlrp3基因的上調(diào)，這間接提示BMMs內(nèi)有NO生成。一氧化氮合酶運(yùn)輸因子NOSTRIN能將一氧化氮合酶從質(zhì)膜運(yùn)輸?shù)侥遗葜校瑥亩鴾p少NO的釋放[20]。谷氨酰胺能夠抑制NO的過度產(chǎn)生[21]。測(cè)序結(jié)果顯示Nostrin和谷氨酰胺合成酶Glul基因下調(diào)，說明BMMs需要NO來引發(fā)炎癥反應(yīng)和對(duì)煙曲霉孢子的殺滅。綜上，我們的研究增加了對(duì)煙曲霉感染過程中小鼠骨髓源巨噬細(xì)胞基因表達(dá)和信號(hào)通路調(diào)控的認(rèn)識(shí)。