虞菊萍，劉 瑋，葉 萌，唐東洋，高向東

（中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南京 211198）

透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）由于其獨特的黏彈性、生物相容性和非免疫原性，已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和化妝品工業(yè)［1］。HA在體內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)活性依賴于其相對分子質(zhì)量和均一性，高相對分子質(zhì)量HA 在細(xì)胞外基質(zhì)維持細(xì)胞完整性［2］和保水能力，而低相對分子質(zhì)量HA 則廣泛應(yīng)用于藥物遞送［3］、組織工程［4］和腫瘤治療［5］等領(lǐng)域。HA由葡萄糖醛酸（GlcUA）與N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）雙糖單位構(gòu)成［6］。HA 傳統(tǒng)生產(chǎn)方式是動物組織提取或經(jīng)C族鏈球菌發(fā)酵提取，但傳統(tǒng)制備工藝比較復(fù)雜且存在很大安全隱患，為此，Jing等［7］率先采用化學(xué)-酶合成法成功實現(xiàn)了均一特定相對分子質(zhì)量HA 的合成。然而該方法仍存在局限性，如單糖前體價格過于昂貴、反應(yīng)體系不易放大。隨著HA 合成通路的揭示及合成生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究者們開始嘗試在安全性的微生物宿主中構(gòu)建HA 代謝通路，進(jìn)行HA 的異源表達(dá)。目前公認(rèn)的安全菌株有大腸埃希菌［8］、枯草芽孢桿菌［9］、畢赤酵母［10］和乳酸乳球菌［11］，均已被成功用作異源表達(dá)系統(tǒng)。Jia等［12］設(shè)計了分別包含透明質(zhì)酸合成酶或透明質(zhì)酸前體合成相關(guān)酶基因的可誘導(dǎo)基因表達(dá)簇，利用重組枯草芽孢桿菌對HA 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，成功獲得了均一相對分子質(zhì)量HA。

已有研究者闡明的鏈球菌透明質(zhì)酸合成途徑［13］顯示，產(chǎn)生透明質(zhì)酸二糖單元需要葡萄糖、輔酶Ⅰ（NAD+）、核苷三磷酸（NTPs）和乙酰輔酶A，該過程會產(chǎn)生尿苷二磷酸（UDP）。有研究表明，細(xì)胞內(nèi)代謝中間體UDP-N-乙酰半乳糖胺、UDP-半乳糖醛酸、UDP和尿苷三磷酸（UTP）均可抑制Ⅰ類透明質(zhì)酸合酶的活性，其中UDP 的抑制活性最高［14］。不過，堿性磷酸酶可以水解HA 合成過程中產(chǎn)生的UDP，加入堿性磷酸酶后透明質(zhì)酸聚合反應(yīng)的動力學(xué)則基本恢復(fù)線性［15］。因此，本研究推測UDP 的積累對Ⅱ類透明質(zhì)酸合成酶也有類似的抑制作用，UDP 濃度的降低有利于胞內(nèi)透明質(zhì)酸的合成。核苷二磷酸激酶（NDK）是一種高度保守的酶，可以催化核苷二磷酸（NDP）和核苷三磷酸（NTP）的相互轉(zhuǎn)化［16］。在HA 生物合成過程中，核苷二磷酸激酶基因（ndk）的過表達(dá)將促進(jìn)UDP 向UTP 的轉(zhuǎn)化，從而提供充足的生成活化UDP-單糖前體所不可缺少的UTP。因此，ndk基因在HA 合成過程中可能起著至關(guān)重要的作用。

為了提高重組枯草芽孢桿菌中HA 的產(chǎn)量和相對分子質(zhì)量，同時考察UDP 蓄積對Ⅱ型透明質(zhì)酸合成酶的影響，本研究將ndk基因以及透明質(zhì)酸合成酶基因（多殺性巴氏桿菌透明質(zhì)酸合酶、4-UDP-葡萄糖焦磷酸化酶和UDP-葡萄糖脫氫酶）導(dǎo)入枯草芽孢桿菌中進(jìn)行了過表達(dá)。這是首次將ndk基因應(yīng)用于HA生物合成系統(tǒng)以評估UDP的積累對Ⅱ類透明質(zhì)酸合成酶的影響，也為其他糖類藥物研發(fā)及產(chǎn)量和相對分子質(zhì)量提高提供了新的思路。

1 材 料

1.1 試 劑

細(xì)菌基因組提取試劑盒，高純度質(zhì)粒小提試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；LATaq聚合酶和限制性內(nèi)切酶（大連TAKARA 公司）；EasyPureTMRNA 提取試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；實時熒光定量PCR 試劑盒SYBR Green PCR Mastermix（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)ABI公司）；引物［美國英杰（上海）生命技術(shù)公司］；聚苯乙烯硫酸酯鈉鹽標(biāo)準(zhǔn)品（北京龍智達(dá)公司）；透明質(zhì)酸標(biāo)準(zhǔn)品（山東焦點生物科技公司）；全染色劑Stains-All 染料（美國Sigma 公司）。其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀 器

PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）；StepOne 實時熒光定量PCR 儀、H-1650 型臺式高速離心機(jī)（美國Thermo Fisher 公司）；AV-300 MHz 核磁共振儀（TMS 內(nèi)標(biāo)）、Bruker Rapid scan tensor 27 紅外光譜儀（德國Bruker 公司）；Avanti J-26 XP 高速冷凍離心機(jī)（美國Beckman公司）；ZHWY-100B搖床（上海智誠分析儀器有限公司）。

1.3 菌 株

Escherichia coliDH5α 菌株（本實驗室保存）；Bacillus subtilisWB800 菌 株（美 國BGSC 保 藏中心）。

2 方 法

2.1 基因擴(kuò)增與表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建

本研究選擇將Ⅱ類透明質(zhì)酸合成酶基因（Pm?HAS）置于基因組整合型的木糖誘導(dǎo)啟動子下，同時選擇含有IPTG誘導(dǎo)的乳糖利用操縱子的低拷貝附加型游離質(zhì)粒pHCMC05 負(fù)責(zé)HA 合成關(guān)鍵酶基因?；蚩寺∷璧南盗幸镄畔⒁姳?。多殺性巴氏桿菌透明質(zhì)酸合酶（PmHAS）基因從多殺性巴氏桿菌P-1059（ATCC#15742）中擴(kuò)增獲得，UDP-葡萄糖脫氫酶基因（tuaD）、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因（gtaB）、核苷二磷酸激酶基因（ndk）從枯草芽孢桿菌168 中擴(kuò)增獲得?；虮磉_(dá)組裝的詳細(xì)信息如圖1-A 和表2 所示。含有pSG1729-PmHAS和pHCMC05-tuaD-gtaB的菌株被命名為Hp8tg，攜帶有pSG1729-PmHAS-ndk和pHCMC05-tuaD-gtaB的菌株被命名為Pn8tg。利用含有100 mg/L 壯觀霉素和25 mg/L 氯霉素的LB 瓊脂平板（含20 g/L 瓊脂的LB 培養(yǎng)基）篩選枯草芽孢桿菌的重組菌株。將陽性菌株接種到含有10 g/L 可溶性淀粉的LB 瓊脂平板上進(jìn)一步培養(yǎng)，然后經(jīng)碘溶液染色處理，驗證構(gòu)建的質(zhì)粒是否成功整合到特定的amyE位點。

Table 1 Primers used in this study

2.2 PmHAS活性測定

收集重組菌株用于體外評估透明質(zhì)酸合成酶（PmHAS）活性。用已預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2）洗滌菌體3次，然后將其重懸于含有10 g/L溶菌酶的PBS 中，于冰浴條件下超聲處理。酶反應(yīng)的條件參見文獻(xiàn)［14］。將樣品加至含有20 g/L聚丙烯酰胺的Tris-硼酸-EDTA 凝膠上，用Stains-All 染料對凝膠進(jìn)行避光染色，然后通過10%乙醇溶液進(jìn)行脫色處理。

2.3 RT-PCR分析

用EasyPure RNA 提取試劑盒提取重組菌株的總RNA，并測定RNA 的濃度。選擇PrimeScriptⅡ第一鏈cDNA 合成試劑盒合成第一鏈cDNA。用SYBR Green熒光染料進(jìn)行定量RT-PCR。

2.4 HA的發(fā)酵

有研究表明，PmHAS 的聚合活性取決于二價陽離子，二價陽離子有利于單糖前體的結(jié)合［17］，因此選擇Mg2+作為PmHAS的輔因子加入培養(yǎng)基。本研究以HA 產(chǎn)量為考察指標(biāo)對LB 培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，選擇初始葡萄糖濃度、金屬離子濃度、初始磷濃度進(jìn)行單因素考察，然后通過響應(yīng)面分析試驗確定了工程菌株的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方。將重組枯草芽孢桿菌按1%比例接種于含有壯觀霉素和氯霉素的培養(yǎng)基中。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基至初始pH 為7.2，培養(yǎng)條件為37 ℃，220 r/min，培養(yǎng)過程中對培養(yǎng)基pH 進(jìn)行監(jiān)測使其保持在7.2 左右。接種后2 h加入誘導(dǎo)劑木糖（xylose）至終濃度為1 mmol/L，接種后4 h 加入誘導(dǎo)劑β-D-異丙基硫代半乳糖（IPTG）至終濃度7.5 g/L。

2.5 HA的提取純化和鑒定

培養(yǎng)結(jié)束后對培養(yǎng)物進(jìn)行離心分離，收集上清液，經(jīng)無水乙醇醇沉得到HA 沉淀。沉淀用蒸餾水重溶，利用截留相對分子質(zhì)量為8 000 ~ 14 000的透析袋進(jìn)行透析處理，透析液凍干后即獲得HA粗品。通過DEAE-Sepharose Fast Flow 對其進(jìn)一步純化，詳細(xì)操作見文獻(xiàn)［18］，收集具有高濃度目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫液，經(jīng)透析并凍干后即得HA樣品。

以D-葡萄糖醛酸作標(biāo)準(zhǔn)品，選擇硫酸咔唑法對純化后的樣品進(jìn)行定量測定，并計算HA 的產(chǎn)量。HA 的相對分子質(zhì)量通過高效液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行測定，色譜柱為Shodex OHpak SB-806 HQ，流動相為0.2 mol/L 氯化鈉（35 ℃，0.5 mL/min）。通過相對分子質(zhì)量已知的聚苯乙烯硫酸酯鈉鹽標(biāo)準(zhǔn)品在高效液相色譜上的保留時間擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的保留時間計算出樣品的相對分子質(zhì)量分布。

Table 2 Plasmids used in this study

通過PMP-RP-HPLC-DAD 方法分析HA 的單糖組成。詳細(xì)步驟參考文獻(xiàn)［12］。通過傅里葉紅外光譜法及核磁共振波譜法進(jìn)一步表征HA樣品。

3 結(jié) 果

3.1 枯草芽孢桿菌中HA生物合成途徑的構(gòu)建

本研究構(gòu)建了兩種類型的誘導(dǎo)型操縱子（圖1）。可溶性淀粉瓊脂平板上菌株培養(yǎng)結(jié)果驗證了基因在amyE位點的整合成功，圖1-C 顯示宿主菌株不能被染色，但是Hp8tg和Pn8tg可以被染色，這表明相關(guān)基因成功整合。通過PCR 對重組菌株基因組以及質(zhì)粒的進(jìn)一步分析結(jié)果表明，所有被改造成操縱子的基因均保持完整。體外PmHAS 的活性測試實驗表明PmHAS 在重組菌株中成功表達(dá)。

Figure 1 Description and verification of the successful construction of recombinant system

通過單因素考察和響應(yīng)面分析試驗，確定了工程菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：1%蛋白胨、0.5%酵母粉、1% NaCl、37.86 g/L 葡萄糖、47.19 mmol/L Mg2+及77.02 mmol/L PO3-4。對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行的單糖組成分析、FT-IR 和1H NMR 分析結(jié)果表明，重組枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的多糖為HA。單糖組成分析如圖2所示，通過與已知單糖的高效液相色譜圖比較，表明樣品中單糖組成為GlcN 和GlcUA，且物質(zhì)的量比為1∶1，兩種單糖構(gòu)成發(fā)酵產(chǎn)物的骨架。

Figure 2 HPLC spectra of PMP derivatives of hyaluronic acid(HA)sample

發(fā)酵產(chǎn)物與HA 標(biāo)準(zhǔn)品的紅外光譜比對結(jié)果顯示，兩個光譜中的主峰重疊。吸收峰歸屬如下：3 419.51 cm-1處的寬帶可歸因于-OH 伸縮振動，2 926.25 cm-1可 歸 因 于-CH 伸 縮 振 動，1 652.94 cm-1和1 544.23 cm-1伸縮振動歸因于-NHCOCH3基團(tuán)的存在，1 403.21 cm-1是-COOH 的特征峰，-CO的伸縮振動在1 076.62 cm-1。此外，發(fā)酵產(chǎn)物的1H NMR 和峰歸屬分別見圖3 和表3。根據(jù)單糖組成分析、FT-IR 譜和1H NMR 譜結(jié)果提示，重組菌株產(chǎn)生的產(chǎn)物可鑒定為HA。單糖組成分析中的GlcN 應(yīng)為GlcNAc 在HA 水解過程中脫乙?；a(chǎn)生的。綜上所述，HA 產(chǎn)生菌Hp8tg（Bacillus subtilisWB800 pSG1729-PmHAS/pHCMC05-tuaD-gtaB）及Pn8tg（Bacillus subtilisWB800 pSG1729-PmHASndk/pHCMC05-tuaD-gtaB）已成功構(gòu)建。

Figure 3 1H NMR spectra of produced HA(A)and standard HA(B)

3.2 核苷二磷酸激酶過表達(dá)增加HA 的產(chǎn)量和相對分子質(zhì)量

由于透明質(zhì)酸生物合成過程中UDP 的不斷產(chǎn)生和單糖前體的大量消耗，ndk基因被引入HA 合成系統(tǒng)。通過定量RT-PCR計算ndk基因的相對轉(zhuǎn)錄水平。用木糖誘導(dǎo)后，可以觀察到Hp8tg 和Pn8tg 之間ndkmRNA 水平的顯著差異（圖4-A），證明木糖啟動子可以有效控制以及ndk過表達(dá)菌株成功構(gòu)建。

通過測定發(fā)酵液的A600來監(jiān)測Hp8tg 和Pn8tg的生長。如圖4-B所示，Pn8tg可以達(dá)到比Hp8tg更高的干細(xì)胞重量（0.90±0.02 g/L、0.76±0.03 g/L）。此外，Pn8tg 的最大比生長率為（0.57±0.02）h-1，而Hp8tg 的最大比生長率僅為（0.34±0.03）h-1（圖4-C）。Hp8tg和Pn8tg的生長結(jié)果對比表明，ndk過表達(dá)能促進(jìn)細(xì)菌生長。

圖4-D 顯示兩種工程菌株的產(chǎn)量與培養(yǎng)時間呈正相關(guān)。在發(fā)酵的第1和第3個24 h觀察到類似的緩慢增加，在第2個24 h觀察到相對急劇的增加。因此，在接下來的研究中選擇48 h 作為發(fā)酵的終點。結(jié)果表明，發(fā)酵48 h后，菌株P(guān)n8tg的HA 產(chǎn)量比Hp8tg高33.81%，分別為（321.0±10.2）mg/L和（239.9±11.1）mg/L，這說明ndk基因的過表達(dá)使得HA 產(chǎn)量提高了約1.3 倍。HA 的產(chǎn)量和生產(chǎn)率分別為（356.7±11.3）mg/g細(xì)胞、（6.7±0.2）mg·L-1·h-1和（315.7 ± 14.6）mg/g 細(xì) 胞、（5.0 ± 0.2）mg·L-1·h-1。收集工程菌株不同時間點產(chǎn)生的HA，測定其相對分子質(zhì)量。圖4-E 顯示，Pn8tg 在8 h 和12 h 產(chǎn)生的HA 相對分子質(zhì)量均低于Hp8tg，而在24、36和48 h時，Pn8tg 產(chǎn)生的HA 相對分子質(zhì)量均較Hp8tg 更高，約提高了1.1 倍。這可能是由于發(fā)酵早期Pn8tg 的生長率高于Hp8tg，在此期間，大量UDP-單糖前體被用于細(xì)胞生長，導(dǎo)致HA 生物合成過程中可用的UDP-單糖前體減少。兩種工程菌株在12 h 獲得的HA 相對分子質(zhì)量均低于8 h，這可能是由于生長率突然上升所致。此外，48 h收集的HA 相對分子質(zhì)量低于36 h，這與培養(yǎng)時間的延長有利于相對分子質(zhì)量增加的傳統(tǒng)觀點相反［8］?？紤]到培養(yǎng)基的酸堿度（數(shù)據(jù)未顯示），說明發(fā)酵后期相對分子質(zhì)量增加趨勢的反轉(zhuǎn)可歸因于培養(yǎng)基酸堿度的升高，因為長期停留在堿性條件下不利于HA相對分子質(zhì)量的增加。

Table 3 Analysis of 1H NMR of HA sample

Figure 4 Characterization of Hp8tg and Pn8tg（± s,n = 3）

4 討 論

本研究可以證實，與Ⅰ類透明質(zhì)酸合成酶類似，UDP 的積累對Ⅱ類透明質(zhì)酸合成酶Pm?HAS也有抑制作用。因此，將核苷二磷酸激酶基因ndk以及透明質(zhì)酸合成酶基因，包括多殺性巴氏桿菌HA 合酶基因（PmHAS）、4-UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因（gtaB）和UDP-葡萄糖脫氫酶基因（tuaD）共同引入枯草芽孢桿菌細(xì)胞中進(jìn)行過表達(dá)，可以促使UDP 轉(zhuǎn)化為UTP，防止UDP 蓄積，同時削弱了Ⅱ類透明質(zhì)酸合成酶的活性抑制，而UTP 則進(jìn)一步參與合成HA 的活化單糖前體。不過，可能由于UTP 的濃度升高及其他中間代謝物對PmHAS 的活性也有一定抑制作用，從而造成HA 的產(chǎn)量提高有限。實驗結(jié)果表明，ndk基因的過度表達(dá)可以提高HA 的產(chǎn)量和相對分子質(zhì)量。其原因包括以下兩個方面：一是隨著ndk基因過度表達(dá)，細(xì)胞密度增加；二是NDK 催化UDP向UTP 的轉(zhuǎn)化，解除了UDP 積累對PmHAS 的抑制作用。

總之，本研究首次將ndk基因引入HA 生物合成系統(tǒng)，揭示了UDP 的積累對體內(nèi)Ⅱ類透明質(zhì)酸合酶的活性具有抑制作用，從而降低HA 的相對分子質(zhì)量和產(chǎn)量。因此，可以通過解除副產(chǎn)物抑制效應(yīng)以及維持細(xì)胞間能量平衡的策略來提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量。此外，本研究所提供的策略可為工業(yè)化制品產(chǎn)生菌的改良提供參考。