秦建兵，李 雯，單伯權(quán)，何 輝，金國(guó)華*

(南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)系，南通 226001)

神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有增殖和分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的多向分化潛能的細(xì)胞[1]。如何誘導(dǎo)NSCs更多地向神經(jīng)元或特定表型神經(jīng)元分化，在NSCs 經(jīng)不同因素誘導(dǎo)其分化后，如何快速準(zhǔn)確地計(jì)數(shù)NSCs誘導(dǎo)分化后的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量及比例已成為當(dāng)今生命科學(xué)領(lǐng)域的熱門(mén)研究[2-3]，本研究為NSCs的研究提供一個(gè)新的實(shí)驗(yàn)方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 SD 大鼠及孕鼠(南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)、NeuroTrace Nissl 530/615 紅色熒光染色劑(Thermo)、豚鼠抗神經(jīng)元核心抗原(neuronal nuclei,NeuN)多克隆抗體(Merck)、山羊抗豚鼠IgG(Ivitrogen)、Alexa 647 標(biāo)記膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)單克隆抗體(BD)、DMEM/F12 培養(yǎng)基(Corning)、胎牛血清、胰酶(Gibco)、20×磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered solution,PBS)(上海生工生物)、智能油型激光共聚焦顯微鏡(Olympus FV10I)、流式細(xì)胞儀(BD FACS Calibur)。

1.2 大鼠灌注、固定、取材、冰凍切片 取成年SD大鼠，麻醉后經(jīng)心臟生理鹽水沖洗后用4%多聚甲醛(0.1 mol/L PBS)灌注固定，取脊髓組織后固定，20%蔗糖脫水沉底后行冰凍切片，縱向片厚25 μm，粘貼于涂有多聚賴(lài)氨酸的載玻片。實(shí)驗(yàn)方案通過(guò)南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物倫理原則(S20210424-005)。

1.3 大鼠NSCs 培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化 參照王珊珊等[4]的方法提取和誘導(dǎo)NSCs 分化，孕15 d SD 大鼠腹腔麻醉后無(wú)菌條件下取胚胎置無(wú)血清的杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium,DMEM)中，剔除腦膜，分離海馬組織，用機(jī)械法將組織制成單細(xì)胞懸液，用增殖培養(yǎng)液[DMEM/F12，2%B27，20 μg/L 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)，20 μg/L 表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)]重懸，經(jīng)孔徑40 μm的篩網(wǎng)過(guò)濾后，種植于T25 培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將第0 代(passage 0,P0)神經(jīng)球消化成單細(xì)胞傳代，再將第1 代(passage 1,P1)神經(jīng)球消化，以密度2×104細(xì)胞/cm2種植于24 孔、6 孔培養(yǎng)板中，加入分化培養(yǎng)液(DMEM/F12,2% FBS) 貼壁分化3 d 后觀察分化結(jié)果。

1.4 NeuN 免疫熒光及Nissl 熒光染色 0.01 mol/L PBS 清洗切片3 遍入含10%山羊血清封閉1 h，去除封閉液，豚鼠抗NeuN 多克隆抗體4 ℃孵育過(guò)夜，0.01 mol/L PBS 清洗3 遍后滴加山羊抗豚鼠IgG室溫2 h，0.01 mol/L PBS 清洗3 遍，滴入NeuroTrace Nissl 530/615 紅色熒光染色劑和Hoechst33342 室溫孵育20 min，0.01 mol/L PBS 清洗3 遍，蓋上蓋玻片，共聚焦顯微鏡觀察。

1.5 GFAP 免疫熒光及Nissl 熒光標(biāo)記細(xì)胞滴片觀察及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 將NSCs 誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞懸液封閉液室溫封閉15 min，1 000 r/min 離心5 min，去除封閉液后加入Alexa 647 標(biāo)記的GFAP 單克隆抗體室溫孵育1 h，1 000 r/min 離心5 min，破膜清洗液洗2 遍后加NeuroTrace Nissl 530/615 紅色熒光染色劑室溫孵育10 min，去除染液，用0.1 mol/L PBS 0.5 mL 重懸細(xì)胞，取50 μL 滴在載玻片上蓋上蓋玻片，共聚焦顯微鏡觀察，其余用于流式細(xì)胞術(shù)上樣。

2 結(jié) 果

2.1 體內(nèi)NeuN 免疫熒光和Nissl 熒光染色 由圖1(見(jiàn)封二)可見(jiàn)，NeuroTrace Nissl 530/615 紅色熒光染色劑，除了特異性結(jié)合大鼠脊髓NeuN 陽(yáng)性神經(jīng)元胞質(zhì)中的尼氏小體外，亦能與嗜堿性的細(xì)胞核結(jié)合，所以神經(jīng)元的胞質(zhì)和胞核均被標(biāo)記為紅色，而NeuN陰性的膠質(zhì)細(xì)胞僅有胞核標(biāo)記為紅色。

圖1 大鼠脊髓縱向切片NeuN 免疫熒光及Nissl 熒光染色

2.2 NSCs 體外誘導(dǎo)分化后NeuN 免疫熒光和Nissl熒光染色 由圖2(見(jiàn)封二)可見(jiàn)，體外實(shí)驗(yàn)的觀察與體內(nèi)一致，NeuroTrace Nissl 530/615 紅色熒光染色劑對(duì)誘導(dǎo)分化為NeuN 陽(yáng)性的神經(jīng)元胞質(zhì)中的尼氏小體和胞核均標(biāo)記紅色熒光，而NeuN 陰性的膠質(zhì)細(xì)胞僅有細(xì)胞核標(biāo)記紅色。

圖2 大鼠NSCs 誘導(dǎo)分化3 d 后NeuN 免疫熒光及Nissl 熒光染色

2.3 NSCs 體外誘導(dǎo)分化后細(xì)胞懸液GFAP 免疫熒光和Nissl 熒光染色細(xì)胞滴片 由圖3(見(jiàn)封二)可見(jiàn)，NSCs 經(jīng)體外誘導(dǎo)分化3 d 后，經(jīng)兩種熒光共標(biāo)記，神經(jīng)元胞質(zhì)中的尼氏小體及細(xì)胞核均被Neuro－Trance Nissl 530/615 紅色熒光染色劑標(biāo)記為紅色，而GFAP 陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)被標(biāo)記為藍(lán)色，只有細(xì)胞核標(biāo)記成紅色。因此，細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)時(shí)，通過(guò)紅色熒光信號(hào)的高度和面積，可將神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞區(qū)分開(kāi)。

圖3 大鼠NSCs 誘導(dǎo)分化3 d 后細(xì)胞懸液滴片GFAP 免疫熒光及Nissl 熒光染色

2.4 NSCs 體外誘導(dǎo)分化后細(xì)胞流式分析 NSCs 經(jīng)體外誘導(dǎo)分化3 d 后，流式細(xì)胞術(shù)通過(guò)收集細(xì)胞的散點(diǎn)圖(圖4A,見(jiàn)封二)分析，用Nissl 單標(biāo)記熒光信號(hào)的高度或面積與前向散射光散點(diǎn)圖(圖4B、E,見(jiàn)封二)，或Nissl 單標(biāo)記的直方圖(圖4C,見(jiàn)封二)均見(jiàn)Nissl陽(yáng)性細(xì)胞群與陰性細(xì)胞靠的比較近，對(duì)分析結(jié)果的判斷可因圈門(mén)的差異帶來(lái)人為的誤差。而采用Nissl 與GFAP 兩個(gè)熒光通道的散點(diǎn)圖(圖4D、F,見(jiàn)封二)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)論用Nissl 信號(hào)的高度還是面積分析，均能完全清晰地將NSCs 經(jīng)誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元的細(xì)胞群體展示出來(lái)，兩種方法對(duì)分析結(jié)果的差異性不大。

圖4 大鼠NSCs 誘導(dǎo)分化3 d 后細(xì)胞懸液GFAP 免疫熒光及Nissl 熒光染色結(jié)果流式分析圖

3 討 論

NSCs 移植后，部分環(huán)路和功能的重建是修復(fù)和代替受損腦組織的有效途徑，已被廣泛地用于神經(jīng)退行性疾病(如阿爾茲海默病、帕金森病等)、卒中、脊髓損傷及中樞神經(jīng)系統(tǒng)遺傳疾病等動(dòng)物模型或臨床的治療研究，且取得了較好的效果[5]。在自然條件下，NSCs 主要分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞，因此如何促進(jìn)NSCs 更多地向神經(jīng)元分化則是研究者的興趣所在，他們通過(guò)微環(huán)境和細(xì)胞因子等研究NSCs 分化的機(jī)制，來(lái)探討如何誘導(dǎo)NSCs 更多地向神經(jīng)元分化。

誘導(dǎo)NSCs 分化后的細(xì)胞類(lèi)型鑒定目前常用的有免疫熒光、Western Blot、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及流式細(xì)胞術(shù)等[6-10]，大部分學(xué)者都采用免疫熒光染色后顯微鏡觀察、圖像處理計(jì)數(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)，但由于實(shí)驗(yàn)樣本的量及圖像處理統(tǒng)計(jì)的手段容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的繁雜和誤差的產(chǎn)生。流式細(xì)胞術(shù)樣品是將組織或細(xì)胞的整體細(xì)胞懸液樣本進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，避免了免疫熒光圖片人工選取視野的抽樣誤差。但細(xì)胞標(biāo)志物的選擇是流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的難題，由于還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)用于神經(jīng)元檢測(cè)的細(xì)胞表面標(biāo)志物，只能通過(guò)固定、破膜后檢測(cè)細(xì)胞胞質(zhì)中不同類(lèi)型細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，由于這些標(biāo)志物表達(dá)的時(shí)間和表達(dá)量的不同，給檢測(cè)帶來(lái)困難，造成諸如陽(yáng)性細(xì)胞群體與陰性細(xì)胞群體不能完全區(qū)分開(kāi)等，從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差。因此，尋找快速準(zhǔn)確的計(jì)數(shù)NSCs 誘導(dǎo)分化后的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量及比例的方法顯得十分必要。

尼氏染色[11-12]是一種標(biāo)準(zhǔn)組織學(xué)方法，用于顯示腦和脊髓中的神經(jīng)元。尼氏小體是神經(jīng)元胞體或樹(shù)突內(nèi)特有的大的嗜堿性團(tuán)塊和顆粒，又名“嗜染質(zhì)”，為F.NISSL 1892 年首次發(fā)現(xiàn)，由發(fā)達(dá)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和游離核糖體構(gòu)成，具有合成更新細(xì)胞器所需的結(jié)構(gòu)蛋白、神經(jīng)遞質(zhì)所需的酶類(lèi)以及肽類(lèi)的神經(jīng)調(diào)質(zhì)功能，其形狀、數(shù)量和分布隨不同的神經(jīng)元而異。NeuroTrace Nissl 530/615 紅色熒光染色劑對(duì)神經(jīng)元特有的Nissl 物質(zhì)具有選擇性，比甲苯胺藍(lán)或甲酚紫等傳統(tǒng)組織學(xué)染料更靈敏。本研究表明，在體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)中，NeuroTrace 530/615 紅色熒光染色劑均能明顯區(qū)分出神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)元的胞體和核被紅色熒光標(biāo)記，而膠質(zhì)細(xì)胞只能標(biāo)記酸性的細(xì)胞核。流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，僅通過(guò)分析尼氏染色紅色熒光通道，是不能完全將神經(jīng)元細(xì)胞群與膠質(zhì)細(xì)胞群分開(kāi)的。而加上星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物GFAP 后，通過(guò)尼氏染色紅色熒光通道和GFAP 藍(lán)色熒光通道的散點(diǎn)圖，能完全地將神經(jīng)元細(xì)胞群和星形膠質(zhì)細(xì)胞群區(qū)分開(kāi)來(lái)，而且在陽(yáng)性的神經(jīng)元細(xì)胞群下方還觀察到可能是少突膠質(zhì)細(xì)胞或未分化細(xì)胞的細(xì)胞群。此實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)便易行，圖像展示結(jié)果清晰，數(shù)據(jù)分析結(jié)果可靠，可提供NSCs 研究者選用。