張秋玉，陳晶，周雪妹，龔漢雨，余光輝

（中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院&中國(guó)莼菜研究所&武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430074）

莼菜（Brasenia schreberi），睡蓮科莼屬，為多年生浮葉植物，是中國(guó)傳統(tǒng)的藥食兼用型珍貴蔬菜.我國(guó)莼菜以湖北利川、浙江杭州的莼菜最為著名［1］.莼菜嫩芽外包被有一層透明膠質(zhì)，其主要成分是多糖［2］，也是莼菜嫩芽藥用價(jià)值的主要來(lái)源.目前莼菜種群多為人工維護(hù)的半自然栽培種群，為中國(guó)國(guó)家Ⅰ級(jí)保護(hù)瀕危野生植物.

目前關(guān)于內(nèi)生菌的研究，多數(shù)為土壤根際間微生物的群落結(jié)構(gòu)分析.內(nèi)共生菌的種類豐富度因環(huán)境的變化和植物體不同器官呈動(dòng)態(tài)變化特征.BERTANI等［3］從淹水和干旱條件下的水稻根、葉和莖中分離得到內(nèi)生菌，發(fā)現(xiàn)淹水條件下的水稻比干旱條件下的水稻體內(nèi)具有更多的內(nèi)生菌.

莼菜作為水生浮葉植物，其不同組織間的內(nèi)生細(xì)菌群以及和水中的微生物群間的對(duì)比未有報(bào)道.莼菜對(duì)生存環(huán)境有著較高的要求和獨(dú)特的適應(yīng)力，與其對(duì)內(nèi)生細(xì)菌種群的選擇有著密切的關(guān)系.本文擬對(duì)莼菜不同組織內(nèi)生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步分析，探討莼菜環(huán)境適應(yīng)的機(jī)理.

1 材料與方法

1.1 樣品采集

樣品采自湖北省利川市佛寶山莼菜種植基地.在莼菜生長(zhǎng)旺盛期采集其嫩芽、莖、葉組織及種植田水樣（莼菜生長(zhǎng)環(huán)境）各4個(gè)樣品，共16個(gè)樣品.水樣采用三點(diǎn)取樣法取樣，取中層水.組織樣品分別放入無(wú)菌袋，封裝，低溫保鮮帶回實(shí)驗(yàn)室.采集的三點(diǎn)水樣混合搖勻后取80 mL分裝在兩個(gè)50 mL的離心管.液氮速凍，-80℃保存.

1.2 莼菜樣品表面無(wú)菌化處理

將莼菜嫩芽，莖，葉用無(wú)菌水緩流沖洗2 min，75%乙醇洗滌3 min，再用無(wú)菌水洗滌植物組織6次，分別保存于無(wú)菌管中，標(biāo)記為莼菜嫩芽（bud）、莼菜莖（stem）、莼菜葉（leaf）、種植水樣（water），每種樣品4次重復(fù)，-80℃保存.將最后一次洗滌水取100μL涂無(wú)抗LB平板，28℃，光照12 h/d培養(yǎng)，用以檢測(cè)滅菌效果.

1.3 微生物DNA提取和測(cè)序

主要流程為：（1）提取莼菜樣本微生物組總DNA，同時(shí)采用Nanodrop對(duì)DNA進(jìn)行定量，并通過(guò)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量.（2）選擇16S rRNA基因V3-V4區(qū)，以5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′為正向引物序列，5′-GGACTACHVGGGTWTCTAA-3′為反向引物序列，并添加樣本特異性Barcode序列和全式金公司的Pfu高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增.（3）PCR產(chǎn)物使用磁珠（Vazyme VAHTSTM DNA Clean Beads）進(jìn)行純化，保存在干凈的1.5 mL離心管中.（4）將PCR擴(kuò)增回收產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量，熒光試劑為Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit，定量?jī)x器為Microplate reader（FLx800，BioTek）.根據(jù)熒光定量結(jié)果，按照每個(gè)樣本的測(cè)序量需求，對(duì)各樣本按相應(yīng)比例進(jìn)行混合.（5）使用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit構(gòu)建文庫(kù)，并進(jìn)行質(zhì)檢.（6）合格的文庫(kù)使用MiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行雙端測(cè)序.莼菜樣本測(cè)序由上海派森諾完成.

1.4 生物信息分析

測(cè)序原始數(shù)據(jù)以FASTQ格式保存.使用DADA2方法［4］對(duì)所有樣品的全部原始序列（Input）進(jìn)行矯正.采用Vsearch軟件，按照97%的相似性閾值將序列劃分為不同的分類單元（operational taxonomic units，OTU），從每個(gè)OTU中選擇一條作為代表序列，通常被視為一個(gè)微生物物種［5-6］.采用稀疏（Rarefaction）的方法進(jìn)行抽平，深度設(shè)為最低樣本序列量的95%.在QIIME2軟件中選用Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//greengenes.secondgenome.com/）進(jìn)行物種注釋［7］.使用QIIME2軟件計(jì)算Alpha多樣性指數(shù)，Beta多樣性距離矩陣，通過(guò)非量度多維尺度分析（Non-quantitative multidimensional scaling analysis，NMDS）方法評(píng)估Beta多樣性差異.利用QIIME2軟件、R軟件繪制分類水平下的共生菌菌群的相對(duì)豐度柱形圖，分析群落結(jié)構(gòu)組成.利用PICRUSt2（Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States）對(duì)內(nèi)生菌進(jìn)行功能預(yù)測(cè)分析，通過(guò)對(duì)比數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.kegg.jp/），使用MinPath推斷代謝通路的存在，進(jìn)而獲得各樣本代謝通路中相關(guān)基因的豐度數(shù)據(jù).

2 結(jié)果

2.1 16S rRNA序列測(cè)定數(shù)據(jù)質(zhì)量

所有植物樣品的對(duì)照平板培養(yǎng)一周后沒(méi)有菌落長(zhǎng)出，說(shuō)明樣品表面消毒徹底.通過(guò)質(zhì)量初篩的原始序列按照Index和Barcode信息進(jìn)行文庫(kù)和樣本劃分，并去除Brcode序列后，16個(gè)樣品測(cè)序后得到1254273條序列，對(duì)所有樣品的全部原始序列（Input）進(jìn)行質(zhì)量控制（Filtered），去噪（Denoised），連接（Merged）并且去嵌合體（Non-chimeric），獲得高質(zhì)量序列1124709條.莼菜微生物總DNA經(jīng)16S rRNA V3-V4區(qū)特異性PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物測(cè)得的序列在刪掉兩端引物序列和結(jié)合不好的序列后，序列長(zhǎng)度為410 bp.由圖1可見，總體符合擴(kuò)增序列長(zhǎng)度，且集中度較好.

圖1 莼菜微生物擴(kuò)增序列長(zhǎng)度特征Fig.1 Length characteristics of sequences of entophytic bacteria of Brasenia schreberi

2.2 莼菜內(nèi)生細(xì)菌菌群多樣性分析

基于97%相似性的分類水平，由圖2可見，從樣品中共獲得1391個(gè)細(xì)菌OTUs，莼菜不同組織間和與生長(zhǎng)環(huán)境間的OTUs數(shù)量存在差異.莼菜種植水樣中OTUs最高，達(dá)535個(gè)；莼菜嫩芽中內(nèi)生細(xì)菌OTUs數(shù)為242個(gè)；莖中內(nèi)生細(xì)菌OTUs數(shù)為414個(gè)；葉中最少，內(nèi)生細(xì)菌OTUs數(shù)為200個(gè).莼菜嫩芽、莖、葉和水樣4種樣品里有19個(gè)共有的OTUs；水樣和嫩芽中有56個(gè)共有的OTUs；水樣和莖中有57個(gè)共有的OTUs；水樣和葉中有35個(gè)共有的OTUs；嫩芽和莖中有41個(gè)共有的OTUs；嫩芽和葉中有46個(gè)共有的OTUs；莖和葉中有63個(gè)共有的OTUs.可見，莼菜植物體和種植水樣中均含有豐富的內(nèi)生細(xì)菌種類，種植水樣品中內(nèi)生細(xì)菌群多樣性大于植物樣品菌群，且在莼菜組織中莖的內(nèi)生細(xì)菌群更為豐富，表明莼菜的莖與生長(zhǎng)環(huán)境接觸更密切，可能與生長(zhǎng)環(huán)境所共享的內(nèi)生細(xì)菌更多，彼此共有的內(nèi)生細(xì)菌種類更豐富，因此莼菜各部位的內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與各部位所在環(huán)境有著密切關(guān)系.

圖2 莼菜不同部位和水樣微生物OTUs的分布Fig.2 Distribution of microbial OTUs in different organs of Brasenia schreberi and water

基于OTU的稀疏曲線結(jié)果見圖3，隨著測(cè)序數(shù)的增加，稀釋曲線逐漸趨于平坦，可認(rèn)為測(cè)序深度能夠基本覆蓋到樣品中絕大多數(shù)物種.而水樣的稀疏曲線未開始趨于平緩，更大深度的測(cè)序可能會(huì)顯示出更多的OTUs.

圖3 α稀疏曲線Fig.3 Alpha rarefaction curves

根據(jù)Alpha多樣性指數(shù)分析（表1），莼菜不同組織和水樣中的內(nèi)生細(xì)菌多樣性具有顯著差異.Chao1指數(shù)反映內(nèi)生細(xì)菌群落豐富度（community richness），從大到小排列為水樣＞莖＞嫩芽＞葉，樣本間具有差異（0.01≤P≤0.05）.Shannon指數(shù)反映內(nèi)生細(xì)菌群落豐富度和均勻度，從大到小排列為水樣＞莖＞嫩芽＞葉.從表1可以看出，莼菜種植水樣中的內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性比植物組織更加豐富.在莼菜不同組織中，莖的內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性更為豐富.Beta多樣性分析中NMDS分析結(jié)果見圖4，莼菜不同組織、水樣的菌群結(jié)構(gòu)之間的差異具有解釋意義（stress=0.126），且嫩芽、莖、葉與水樣間細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異.因此，OTU豐富度依賴于植物的 不同組織和生長(zhǎng)環(huán)境.

表1 莼菜內(nèi)生細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)Tab.1 Alpha diversity index of entophytic bacteria of Brasenia schreberi

圖4 莼菜內(nèi)生細(xì)菌菌群Beta多樣性分析Fig.4 Beta diversity analysis of entophytic bacteria of Brasenia schreberi

2.3 莼菜內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成分析和差異分析

根據(jù)測(cè)定的1391個(gè)內(nèi)生細(xì)菌OTUs，屬于21個(gè)門和399個(gè)屬.從圖5可見，在門（phylum）水平上，種植水樣和莼菜組織間的內(nèi)生細(xì)菌所測(cè)得的門種類相似，但在不同生態(tài)位中所占比例不同.主要有以下4種優(yōu)勢(shì)菌門，變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes），其中變形菌門（Proteobacteria）在所有樣品中占主要優(yōu)勢(shì).另外，在水樣中疣微菌門（Verrucomicrobia）的相對(duì)豐度占比均高于莼菜各組織，達(dá)9.48%；嫩芽中不含綠彎菌門（Chloroflexi），而在莖中的相對(duì)豐度占比（1.77%）均高于水樣和葉.

圖5 莼菜內(nèi)生細(xì)菌門水平的相對(duì)豐度Fig.5 Relative abundance of entophytic bacteria at phylum level of Brasenia schreberi

從屬的分類水平上分析見圖6，對(duì)每種樣本的最大豐度排名前20的屬統(tǒng)計(jì)，嫩芽樣本中相對(duì)豐度占比大于2%的菌屬包括假單胞菌屬（Pseudomonas，11.71%）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter，11.34%）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium，9.42%）等9個(gè)菌屬.莖樣本中相對(duì)豐度占比大于2%的菌屬包括嗜冷桿菌屬（Psychrobacter，13.46%）、泉發(fā)菌屬（Crenothrix，4.71%）、伯克氏菌屬（Burkholderia，3.86%）、弧菌屬（Vibrio，2.97%）等7個(gè)菌屬.葉樣本中相對(duì)豐度占比大于2%的菌屬包括其他根瘤菌屬-新根瘤菌屬-副根瘤菌屬-根瘤菌屬（Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium，16.81%）、伯克氏菌屬（Burkholderia，8.57%）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter，2.63%）等6個(gè)菌屬.水樣中相對(duì)豐度占比大于2%的菌屬包括多核桿菌屬（Polynucleobacter，15.91%）、

圖6 莼菜內(nèi)生細(xì)菌屬水平的相對(duì)豐度Fig.6 Relative abundance of entophytic bacteria at genus level of Brasenia schreberi

FukuN18_freshwater_group（8.57%）、Rhodoluna（5.43%）等8個(gè)菌屬.水樣和莼菜組織間中共有29個(gè)共有菌屬，占內(nèi)生細(xì)菌所有種類的7.27%.

根據(jù)LEfSe物種分類等級(jí)分析結(jié)果見圖7顯示，在水樣本中衣原體門（Chlamydiae）具有相對(duì)優(yōu)勢(shì)，在莖樣本中綠彎菌門（Chloroflexi）具有相對(duì)優(yōu)勢(shì)，在葉樣本中變形菌門（Proteobacteria）具有相對(duì)優(yōu)勢(shì).在屬水平上，水樣本中占相對(duì)優(yōu)勢(shì)的有芽孢桿菌屬（Bacillus）、Sediminibacterium、棲水菌屬（Enhydrobacter）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、軍團(tuán)菌屬（Legionella）；在莖樣本中占相對(duì)優(yōu)勢(shì)的有Methylotenera、SWB02、紅長(zhǎng)命菌屬（Rubrivivax）；在葉樣本中占相對(duì)優(yōu)勢(shì)的是其他根瘤菌屬-新根瘤菌屬-副根瘤菌屬-根瘤菌屬（Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium）；在嫩芽樣本中占相對(duì)優(yōu)勢(shì)的是Obscuribacterales.分析結(jié)果表明：具有相對(duì)優(yōu)勢(shì)的10個(gè)菌屬對(duì)4種樣本間差異具有顯著性影響（LDA分值＞2）.

圖7 莼菜內(nèi)生細(xì)菌菌群差異分析Fig.7 Analysis on the difference of entophytic bacteria in Brasenia schreberi

2.4 莼菜內(nèi)生細(xì)菌菌群宏基因組功能預(yù)測(cè)

利用PICRUSt2分析軟件，通過(guò)對(duì)比KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)莼菜組織內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行初步的功能預(yù)測(cè).從圖8可見，獲得了與莼菜微生物生態(tài)系統(tǒng)功能密切相關(guān)的6類第一等級(jí)生物代謝通路功能，包括代謝、遺傳信息處理等.其中代謝相關(guān)基因豐度最高，為內(nèi)生細(xì)菌最主要的功能；其次為遺傳信息處理、細(xì)胞進(jìn)程、環(huán)境信息處理通路；生物體系統(tǒng)和人類疾病通路的相關(guān)基因豐度較小，因此這兩個(gè)通路不是莼菜內(nèi)生細(xì)菌的主要功能.

圖8 KEGG功能通路豐度圖Fig.8 Abundance map of KEGG functional pathway

上述生物代謝通路可以進(jìn)一步細(xì)分為第二等級(jí)功能，共包含34個(gè)子功能.其中代謝通路中的功能基因豐度最大的為碳水化合物代謝，其次為氨基酸代謝、輔酶維生素代謝、異生素降解與代謝；遺傳信息處理通路中功能基因豐度最大的為DNA復(fù)制與修復(fù)，其次為折疊、分類和降解、翻譯、轉(zhuǎn)錄；細(xì)胞進(jìn)程通路中其豐度最大為細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，其次為細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡；環(huán)境信息處理通路中最大為膜運(yùn)輸.

3 討論

以前研究通常利用微生物分離、培養(yǎng)和鑒定的方法來(lái)研究其多樣性，不能準(zhǔn)確地分析菌群結(jié)構(gòu)［8］.隨著測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，基于微生物16S rRNA基因的高通量測(cè)序能高通量、高準(zhǔn)確度地處理大批數(shù)據(jù)，被廣泛應(yīng)用于微生物生態(tài)學(xué)領(lǐng)域［9-11］.本實(shí)驗(yàn)利用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)分析16S rRNA，從基因水平分析了莼菜微生物的群落結(jié)構(gòu).分析結(jié)果顯示種植水樣的OTU豐富程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于芽、莖、葉；在莼菜組織中，莖的內(nèi)生細(xì)菌多樣性大于其他組織.雖然植物樣品含有較少的內(nèi)生細(xì)菌總數(shù)，但內(nèi)生細(xì)菌種類很豐富，此外內(nèi)生細(xì)菌群落組成的分布依賴于植物的不同組織.

本研究發(fā)現(xiàn)莼菜內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門、厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門，與其他植物內(nèi)生菌的優(yōu)勢(shì)菌門相似［12］.變形菌門細(xì)菌均為革蘭氏陰性菌，大多數(shù)細(xì)菌營(yíng)兼性或?qū)Ｐ詤捬跫爱愷B(yǎng)或自養(yǎng)化能生物生活，有研究認(rèn)為變形菌門的豐度越大，其中的有機(jī)質(zhì)和C、N養(yǎng)分含量就越多.厚壁菌門多數(shù)為革蘭氏陽(yáng)性菌，包括厭氧的梭菌綱（Clostrida）、兼性或者專性好氧的芽孢桿菌綱（Bacilli）、Erysipelotrichia、Negativicutes等.放線菌門是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，可以降解不溶性有機(jī)物質(zhì).這些菌門下屬綱的特征預(yù)示著莼菜微生物具有豐富的菌落多樣性.進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)相對(duì)豐度占比大于2%的菌屬，嫩芽樣本中包括嗜糖假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬、雙歧桿菌屬等9個(gè)菌屬.莖樣本中包括嗜冷桿菌屬、泉發(fā)菌屬、伯克氏菌屬、弧菌屬等7個(gè)菌屬.葉樣本中包括根瘤菌屬、伯克氏菌屬、不動(dòng)桿菌屬等6個(gè)菌屬.水樣中包括多核桿菌屬、FukuN18_freshwater_group、Rhodoluna等8個(gè)菌屬.水樣和莼菜組織中有29個(gè)共有菌屬，說(shuō)明莼菜組織存在主動(dòng)富集菌群的可能，并且共有菌屬作為基礎(chǔ)菌屬在莼菜組織中起著重要作用.如假單胞菌屬的一些菌株可以分泌生長(zhǎng)素和抗生素，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)、提高植物的免疫力以及抑制多種致病菌活性［13-14］.伯克氏菌屬的一些細(xì)菌具有生物防治［15］、促進(jìn)植物生長(zhǎng)［16］和生物修復(fù)［17］等功能.莼菜不同組織的內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)不同，在門水平和屬水平上均有差異，如在莼菜的莖樣本中綠彎菌門（Chloroflexi）的相對(duì)豐度占比均高于水樣、葉和嫩芽，為莖中的顯著標(biāo)志物種.由于莼菜的莖一直處于水中，且綠彎菌門的細(xì)菌能通過(guò)光合作用固碳，因此能為莼菜莖的生長(zhǎng)提供能量.在莖樣本中嗜冷桿菌屬的相對(duì)豐度最大.結(jié)果表明莼菜內(nèi)生細(xì)菌功能與其結(jié)構(gòu)相適應(yīng)，組織間的內(nèi)生細(xì)菌差異有助于其特異性功能的實(shí)現(xiàn).

微生物的群落結(jié)構(gòu)受到環(huán)境特性、群落特征等外界因素及自身遺傳物質(zhì)的內(nèi)在因素的共同影響.對(duì)莼菜內(nèi)生細(xì)菌潛在功能進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，代謝通路相關(guān)功能基因的豐度最大，成為內(nèi)生細(xì)菌群落最主要的功能.且在其第二等級(jí)通路中的功能基因豐度較大的為碳水化合物代謝和氨基酸代謝，說(shuō)明莼菜內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)功能主要集中在碳、氮兩種元素的分解轉(zhuǎn)化，為細(xì)菌生存提供保障.由于莼菜植物體大部分位于水中，可能會(huì)受到水的脅迫，因此莼菜內(nèi)生細(xì)菌豐富的代謝功能，能協(xié)助莼菜抵抗環(huán)境的影響.

本研究?jī)H針對(duì)莼菜內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性特征，其不同組織間內(nèi)生細(xì)菌群落差異可能與植物不同組織生理結(jié)構(gòu)有關(guān).但這些菌群對(duì)莼菜的發(fā)育及其外周多糖的影響尚不清楚，應(yīng)進(jìn)一步開展這些菌群功能的研究，為莼菜的內(nèi)生細(xì)菌資源挖掘和可持續(xù)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)奠定更好的理論基礎(chǔ).