李志遙，李珂，張妮，任海，宋俊蓉，王紹江，陳超，潘衛(wèi)東*，3

(1.貴州大學(xué) 藥學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550002；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 省部共建藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550014；3.貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 貴州省天然藥物工程研究中心， 貴州 貴陽(yáng) 550014；4.貴陽(yáng)單寧科技有限公司， 貴州 貴陽(yáng) 550001)

0 引言

五倍子(Gallachinensis)為倍蚜科昆蟲(chóng)角倍蚜或蛋倍蚜在其寄主漆樹(shù)科植物鹽膚木、青麩楊或紅麩楊等樹(shù)上形成的干燥蟲(chóng)癭，其藥用歷史悠久，收載于2020版《中國(guó)藥典》[1-3]。研究表明，單寧酸具有多種生物活性，如抗菌、抗癌、抗氧化、治腹瀉、止血等[4-7]。五倍子中的主要成分為單寧酸，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%～70%[8]。單寧酸在市場(chǎng)上的應(yīng)用十分廣泛，目前國(guó)家林業(yè)局根據(jù)其用途不同將單寧酸分為3個(gè)不同等級(jí)，主要包括：食品級(jí)單寧酸，在食品工業(yè)中用作食品添加劑或酒類(lèi)、飲料的澄清劑和穩(wěn)定劑[9-10]；工業(yè)級(jí)單寧酸，主要用于皮革、墨水、木材粘連劑等化工行業(yè)[11-12]；藥用級(jí)單寧酸，作為止血?jiǎng)?、抗癌藥、重金屬解毒劑等藥品的組成廣泛運(yùn)用于醫(yī)藥行業(yè)。其中食品級(jí)單寧酸和藥用級(jí)單寧酸的使用標(biāo)準(zhǔn)最高，而沒(méi)食子酸雜質(zhì)的含量是評(píng)價(jià)其等級(jí)的重要考察指標(biāo)之一。沒(méi)食子酸不易從單寧酸中除去，嚴(yán)重影響了單寧酸的品質(zhì)，導(dǎo)致其使用范圍受限。分析沒(méi)食子酸的來(lái)源主要有2個(gè)方面：一是植物代謝；二是提取與純化過(guò)程中條件控制不當(dāng)而引發(fā)單寧酸水解生成沒(méi)食子酸。由于沒(méi)食子酸的物化性質(zhì)與單寧酸相似，因此在純化過(guò)程中不易被去除。雖然單寧酸中沒(méi)食子酸的純化工藝有所報(bào)道，如活性碳吸附、大孔樹(shù)脂吸附、膜分離技術(shù)、離子交換技術(shù)、分子蒸留技術(shù)等[13-14]；但上述純化工藝復(fù)雜，成本高，污染嚴(yán)重，不適合工業(yè)放大生產(chǎn)，因此新的純化工藝亟待研究開(kāi)發(fā)。

對(duì)比分析沒(méi)食子酸與單寧酸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，其中從沒(méi)食子酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)(3,4,5-三羥基苯甲酸)可以判斷其同時(shí)具有苯酚和羧酸的化學(xué)性質(zhì)。連苯三酚、苯甲酸的酸度系數(shù)(pKa)分別為15.2、4.2，由此可知苯甲酸的酸性比連苯三酚的酸性強(qiáng)，從而推測(cè)沒(méi)食子酸水溶液遇到碳酸氫鈉等堿性物質(zhì)時(shí)，優(yōu)先與羧基反應(yīng)生成3,4,5-三羥基苯甲酸鈉鹽，而單寧酸只有連苯三酚基團(tuán)而無(wú)羧基，不會(huì)優(yōu)先與碳酸氫鈉等堿性物質(zhì)反應(yīng)。在荊才等[15]的實(shí)驗(yàn)中，考察了以pH為6.8、7.5的磷酸鈉鹽溶液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、3%碳酸鈉溶液為反萃劑考察對(duì)單寧酸中沒(méi)食子酸殘留量的影響，單因素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用pH為6.8的磷酸鈉溶液作為反萃劑時(shí)，單寧酸中沒(méi)食子酸殘留量最低，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.02%，同時(shí)認(rèn)為反萃劑對(duì)單寧酸中沒(méi)食子酸殘留含量有極顯著影響。在此實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)設(shè)想在粗品單寧酸(除了沒(méi)食子酸含量高于食品級(jí)指標(biāo)，其他指標(biāo)均達(dá)到食品級(jí))水溶液中加入其他堿性物質(zhì)，使沒(méi)食子酸生成鹽，溶于水中，以乙酸乙酯為萃取劑，利用單寧酸在乙酸乙酯溶液和反萃(取)劑分配系數(shù)不同，通過(guò)萃取技術(shù)使極大部分單寧酸分配進(jìn)入乙酸乙酯，從而達(dá)到提純目的；采用單因素實(shí)驗(yàn)方法，考察堿性物質(zhì)對(duì)單寧酸純化工藝的影響，建立單寧酸生產(chǎn)中的精制工藝，減少生產(chǎn)成本，提高相關(guān)產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑和儀器

安捷倫1200型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；天平(賽多利斯，SQP型)；分析柱為C8色譜柱(依利特，4.6 mm×250 mm，5 μm)。

1.2 材料及試劑

超純水(貴陽(yáng)單寧科技有限公司)；對(duì)照品：?jiǎn)螌幩岽制?貴陽(yáng)單寧科技有限公司)，其指示為干燥失重≤ 9.0%， 灼燒殘?jiān)|(zhì)量分?jǐn)?shù)≤ 0.6%， 砷的質(zhì)量比≤ 3 μg/g，鉛的質(zhì)量比≤ 5 μg/g， 重金屬(以Pb計(jì))的質(zhì)量比≤ 20 μg/g，樹(shù)膠、糊精試驗(yàn)無(wú)渾濁，樹(shù)脂試驗(yàn)無(wú)渾濁，沒(méi)食子酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.47%，其中除沒(méi)食子酸含量超過(guò)食品級(jí)指示(0.75%)，其余均達(dá)到食品級(jí)指標(biāo)，單寧酸，比利時(shí)Omnichem公司；沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(北京恒元啟天化工技術(shù)研究院與北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司聯(lián)合研制)；色譜純甲醇(美國(guó)天地)；磷酸(安耐吉)；乙酸乙酯(安耐吉)；對(duì)照品及供試品均為自行配制。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

根據(jù)已有研究[15]，不同反萃劑對(duì)單寧酸中沒(méi)食子酸的殘留量有一定的關(guān)系，因此，選擇在25 ℃條件下，考察不同濃度的碳酸氫鈉對(duì)單寧酸中沒(méi)食子酸殘留量的影響，進(jìn)行單因素考察實(shí)驗(yàn)。

分別稱(chēng)取10 g單寧酸粗品于A、B、C和D瓶中，加入30 mL超純水，溶解后，攪拌下分別緩慢加入碳酸氫鈉 0.8、0.6、0.4、0.2 g，繼續(xù)攪拌30 min，分別用30、20、10 mL乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯，減壓除去乙酸乙酯后，50 ℃真空干燥5 h，得純品單寧酸DNSCP 9.1 g、DNSCP-1 9.2 g、DNSCP-2 9.1 g和DNSCP-3 9.1 g。

1.3.2 色譜條件與檢測(cè)方法

采用高效液相色譜方法(HPLC)檢測(cè)沒(méi)食子酸的含量[16-18]。C8色譜柱，柱溫為30 ℃；DAD檢測(cè)器調(diào)節(jié)檢測(cè)波長(zhǎng)為275 nm；甲醇-0.3%磷酸水溶液(體積比為20/80，v/v)等度洗脫；流速為0.6 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL。

1.3.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)品沒(méi)食子酸0.24 mg于100 mL容量瓶中，用甲醇溶液定容，搖勻，過(guò)0.45 μm 微孔濾膜，即得沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度為2.4×10-4mg/μL)。

1.3.4 供試品溶液的制備

精密稱(chēng)取比利時(shí)Omnichem公司單寧酸、貴陽(yáng)單寧科技有限公司單寧酸粗品以及按照1.3.1方法純化的單寧酸純品DNSCP、DNSCP-1，DNSCP-2和DNSCP-3對(duì)照品適量，加入色譜甲醇配置質(zhì)量濃度為2.17×10-3、2.00×10-3、2.06×10-3、2.04×10-3、2.07×10-3、2.14×10-3mg/μL的對(duì)照品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 單寧酸純化方法的確定

根據(jù)沒(méi)食子酸的結(jié)構(gòu)，結(jié)合文獻(xiàn)[15]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，堿性化合物的選擇需滿(mǎn)足以下條件：①堿不能水解單寧酸；②堿易與沒(méi)食子酸完全反應(yīng)且不易與單寧酸反應(yīng)；③實(shí)驗(yàn)體系中多余的堿易除去?；诖?，本實(shí)驗(yàn)首先排除使用有機(jī)堿，有機(jī)堿通常是含氮化合物，易與酚羥基形成氫鍵，不易完全除去，從而引入新的雜質(zhì)。對(duì)于無(wú)機(jī)堿，綜合經(jīng)濟(jì)性、安全性、穩(wěn)定性的選擇原則，選擇碳酸氫鈉，相比氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀等常用堿具有顯著的優(yōu)勢(shì)。其理由如下：①氫氧化鈉和氫氧化鉀是強(qiáng)堿，容易水解單寧酸中的酯鍵，生成沒(méi)食子酸；②與碳酸氫鈉相比，碳酸鈉和碳酸鉀不僅價(jià)格高，而且其堿性比碳酸氫鈉強(qiáng)，有促進(jìn)單寧酸中酯鍵水解的風(fēng)險(xiǎn)；③碳酸氫鉀與碳酸氫鈉性質(zhì)相似，但碳酸氫鈉價(jià)格更低。綜上分析，碳酸氫鈉是最優(yōu)選擇。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

試驗(yàn)前期考察了不同的流動(dòng)相(甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.2%磷酸溶液、甲醇-0.3%磷酸水溶液、甲醇-0.5%磷酸水溶液)、流速(0.5、0.6、0.8、1.0 mL/min)、柱溫(25、30、35℃)、檢測(cè)波長(zhǎng)190 ～ 400 nm、進(jìn)樣量(5、10、15、20、25 μL)等條件，以色譜峰的分離情況、基線(xiàn)平穩(wěn)程度、雜質(zhì)峰的干擾情況等為評(píng)價(jià)指標(biāo)，最終確定在275 nm檢測(cè)波長(zhǎng)，30 ℃柱溫條件下，進(jìn)樣20 μL，甲醇-0.3%磷酸水溶液以流速0.6 mL/min洗脫為最佳色譜條件。

2.3 線(xiàn)性關(guān)系考察

對(duì)照品沒(méi)食子酸溶液2、4、6、8、10 μL按1.3.1節(jié)的色譜條件注入高效液相色譜儀。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y進(jìn)行線(xiàn)性回歸，求得線(xiàn)性回歸方程y=242.34x+ 49.06，R= 0.999 9(圖1)，結(jié)果表明峰面積與進(jìn)樣量呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

圖1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 Gallic acid standard curve

2.4 單寧酸中沒(méi)食子酸含量測(cè)定

按1.3.1節(jié)色譜條件, 將1.3.2節(jié)中制備的樣品溶液進(jìn)樣20 μL，HPLC結(jié)果如圖2所示，其中沒(méi)食子酸的保留時(shí)間為7.9 min，單寧酸的保留時(shí)間為5.1 min，重復(fù)進(jìn)樣3次，取平均值，根據(jù)方程y=242.34x+ 49.06計(jì)算沒(méi)食子酸含量，其結(jié)果見(jiàn)表1。

分別取DNSCP、DNSCP-1、DNSCP-2、DNSCP-3樣品進(jìn)行沒(méi)食子酸含量分析，結(jié)果見(jiàn)表1。從中可以看出，DNSCP、DNSCP-1中沒(méi)食子酸含量低于進(jìn)口比利時(shí)單寧酸中沒(méi)食子酸含量0.34%，但二者中沒(méi)食子酸含量差值小，分別為0.15%和0.21%，因此當(dāng)沒(méi)食子酸含量低于一定值時(shí)，隨著碳酸氫鈉使用量的增加對(duì)單寧酸純度的提高沒(méi)有成比例增加，此外，從質(zhì)量要求和成本考慮，本批次貴陽(yáng)單寧科技公司的單寧酸使用碳酸氫鈉最優(yōu)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%最理想，當(dāng)碳酸氫鈉的用量低于單寧酸質(zhì)量4%時(shí)，其沒(méi)食子酸含量高于比利時(shí)單寧酸。

表1 單寧酸中沒(méi)食子酸含量分析Tab.1 Analysis of gallic acid content in tannic acid

(a)沒(méi)食子酸

(b)Omnichem公司單寧酸

(c)貴陽(yáng)單寧科技公司粗品

(d)貴陽(yáng)單寧科技公司粗品單寧酸純化后

2.5 精密度試驗(yàn)

在上述優(yōu)化的色譜條件下，精密進(jìn)樣單寧酸標(biāo)準(zhǔn)液20 μL，重復(fù)5次測(cè)定，以峰面積計(jì)算系統(tǒng)的精密度，其峰面積分別為19 216.1、19 110.3、19 250.1、19 323.2、19 209.2，結(jié)果單寧酸峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.4%，說(shuō)明儀器的精密度良好。

2.6 工藝放大量實(shí)驗(yàn)

按上述實(shí)驗(yàn)方法，單寧酸的純化質(zhì)量放大為160 kg，純化后的單寧酸中沒(méi)食子酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.21%，同樣實(shí)現(xiàn)了沒(méi)食子酸含量低于比利時(shí)單寧酸且超過(guò)食品級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論

針對(duì)五倍子單寧酸提取物的純化工藝優(yōu)化，本研究采用簡(jiǎn)單易得的無(wú)機(jī)堿碳酸氫鈉選擇性去除單寧酸提取物中的主要雜質(zhì)沒(méi)食子酸。使用碳酸氫鈉處理后的單寧酸，其沒(méi)食子酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)從2.47%降低至0.15%，遠(yuǎn)低于比利時(shí)Omnichem公司進(jìn)口的單寧酸中沒(méi)食子酸雜質(zhì)含量。同時(shí)為了驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)方法的可靠性，將單寧酸的單次純化量放大至每批次160 kg，結(jié)果純化后的沒(méi)食子酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.21%，仍低于比利時(shí)單寧酸中沒(méi)食子酸的含量，證明了本方法的實(shí)用性。綜上，此純化方法便捷可靠，操作簡(jiǎn)單，具有巨大的潛在工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。