但曉夢,謝育媛,郭江紅,姜 紅

湖北省藥品監(jiān)督檢驗研究院,國家藥品監(jiān)督管理局血液制品質(zhì)量控制重點實驗室,武漢 430073

鹽酸氨基葡萄糖是人體關節(jié)軟骨基質(zhì)合成蛋白聚糖必需的重要成分,主要用于預防和治療各種類型的骨性關節(jié)炎,如膝關節(jié)、髖關節(jié)、脊柱、肩、手腕和踝關節(jié)等部位以及全身性的骨性關節(jié)炎[1-3]。氨基葡萄糖是軟骨基質(zhì)和滑液中合成氨基葡聚糖和蛋白聚糖的組分和首選底物。氨基葡萄糖可刺激軟骨細胞產(chǎn)生具有正常多聚體結(jié)構(gòu)的糖蛋白,抑制損害關節(jié)軟骨的酶（如膠原酶和磷脂酶A2等）的活性,抑制損傷細胞的超氧化物自由基的產(chǎn)生,從而減少損傷細胞內(nèi)毒素因子的釋放。又因其屬于生物提取物質(zhì),故安全性較高,不良反應極少,因而被廣泛用于醫(yī)藥及保健食品領域,用于治療全身各種骨性關節(jié)炎[4-6]。

隨著人們對身體健康重視程度的逐年提高,鹽酸氨基葡萄糖類藥物應用于治療骨性關節(jié)炎的使用量也隨之顯著增長。近年來,鹽酸氨基葡萄糖類藥物上市劑型由經(jīng)典的膠囊劑、普通片劑衍生出了更多的劑型,如顆粒劑、散劑、泡騰片劑,提示該類藥物的市場需求量較大[7-8]。

通過檢索國家食品藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站上的基礎數(shù)據(jù)庫可知,鹽酸氨基葡萄糖顆粒在國內(nèi)有2家生產(chǎn)企業(yè),分別為企業(yè)A（企業(yè)注冊標準YBH02202009）和企業(yè)B（企業(yè)注冊標準YBH00352014）。企業(yè)A 生產(chǎn)的鹽酸氨基葡萄糖顆粒的輔料為蔗糖、聚維酮K30,企業(yè)B的輔料為蔗糖、聚維酮K30、乳糖等?，F(xiàn)階段氨基葡萄糖類藥物國家質(zhì)量標準尚未統(tǒng)一[9-13],相關生產(chǎn)企業(yè)僅憑各自的企業(yè)注冊標準對氨基葡萄糖類藥物進行檢測,而其中含量測定等關鍵項目質(zhì)量控制方法差異較大且并不適用于鹽酸氨基葡萄糖顆粒劑的檢測,主要原因在于鹽酸氨基葡萄糖顆粒劑的輔料中包含蔗糖、乳糖等物質(zhì),均為小分子糖類,在企業(yè)注冊標準中含量測定色譜條件下較難分離,故不能有效控制產(chǎn)品含量[14-16]。因此,亟待對鹽酸氨基葡萄糖顆粒標準進行深入研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695 Alliance高效液相色譜儀,包括柱溫箱、在線真空脫氣機、2489 紫外檢測器以及Empower色譜工作站（美國Waters公司）;XP205電子天平（梅特勒-托利多公司）。

1.2 試藥

鹽酸氨基葡萄糖顆粒（企業(yè)A,批號12A170303、12A 170304;企業(yè)B,批號190202、190204、190205）。

鹽酸氨基葡萄糖對照品（批號140649-201606,質(zhì)量分數(shù)100%,中國食品藥品檢定研究院）;鹽酸氨基葡萄糖原料藥（批號1803-2018-H020,浙江誠意藥業(yè)有限公司）;蔗糖（批號20190409,嘉興市白浪淀粉制品有限公司）;聚維酮K30（批號200816,安徽山河藥用輔料有限公司）;乳糖（批號200801,企業(yè)A）;氯化鈉、磷酸氫二鉀、氨水、磷酸（分析純,國藥集團化學試劑有限公司）;乙腈（色譜純,美國Tedia天地試劑公司）;水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:CAPCELL PAK NH2柱（150 mm×4.6 mm,5μm）;流動相:磷酸鹽溶液（取磷酸氫二鉀3.5 g,加水1 000 mL使溶解,加入0.25 mL氨水,用磷酸調(diào)pH 值至7.5）-乙腈（25∶75）;流速:1.5 mL·min-1;進樣量:20μL;柱溫:30℃;檢測波長:195 nm。

2.2 溶液的制備

2.2.1 空白輔料定位溶液 蔗糖溶液:精密稱取蔗糖213.0 mg,置于10 mL 量瓶中,加水使其溶解并稀釋至刻度,搖勻,過濾,取續(xù)濾液稀釋至質(zhì)量濃度為10 mg·mL-1,即得。

聚維酮K30溶液:精密稱取聚維酮K30 205.1 mg,置于10 mL量瓶中,加水使其溶解并稀釋至刻度,搖勻,過濾,即得。

乳糖溶液:精密稱取乳糖112.5 mg,置于10 mL量瓶中,加水使其溶解并稀釋至刻度,搖勻,過濾,即得。

2.2.2 氯離子（Cl-）溶液 精密稱取12.8 mg氯化鈉置于10 mL量瓶中,加水使其溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為Cl-定位溶液。

2.2.3 供試品溶液 精密稱取鹽酸氨基葡萄糖顆粒粉末（相當于氨基葡萄糖約200 mg）,置于50 mL 量瓶中,加水使其溶解并稀釋至刻度,搖勻,過濾,取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.4 對照品溶液 精密稱取鹽酸氨基葡萄糖對照品,加水使其溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含鹽酸氨基葡萄糖4.0 mg的溶液。

2.3 專屬性實驗

精密量取2.2.1～2.2.4項下的溶液各20μL,按照2.1項下色譜條件測定,記錄色譜圖。在上述色譜條件下,鹽酸氨基葡萄糖顆粒劑中成鹽離子氯離子（Rt=2.30 min）、輔料蔗糖（Rt=11.14 min）、乳糖（Rt=15.96 min,倒峰）及聚維酮K30（Rt=1.26 min）對氨基葡萄糖（Rt=13.05 min）的測定均無干擾。結(jié)果見圖1。

圖1 鹽酸氨基葡萄糖顆粒含量測定系統(tǒng)適用性HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of system suitability test of the content determination method of Glucosamine Hydrochloride Granules

2.4 線性關系考察

精密稱取鹽酸氨基葡萄糖對照品146.64 mg,置于10 mL量瓶中,加水使其溶解并稀釋至刻度,搖勻,配制成含鹽酸氨基葡萄糖質(zhì)量濃度為14.6 mg·mL-1的溶液,作為儲備液。分別量取儲備液適量,用水稀釋制成1 mL含鹽酸氨基葡萄糖1.46、3.66、5.86、7.33、8.79、10.99 mg的溶液,分別吸取上述溶液各20μL注入液相色譜儀,記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標（y）、質(zhì)量濃度為橫坐標（x）進行線性回歸。結(jié)果表明,鹽酸氨基葡萄糖質(zhì)量濃度在1.46～10.99 mg·mL-1范圍內(nèi)時,與峰面積呈良好的線性關系。回歸方程為y=277 074x-12 990,R=0.999 1。

2.5 檢測限與定量限實驗

精密稱取鹽酸氨基葡萄糖對照品17.63 mg,置于5 mL量瓶中,加水使其溶解并稀釋至刻度,搖勻;再精密量取上述溶液1 mL,置于25 mL 量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻,在HPLC色譜儀檢測器穩(wěn)定操作的條件下進樣8μL,所得信噪比（S/N）為13.2,即定量限為1.1μg。在高效液相色譜儀檢測器穩(wěn)定操作的條件下進樣上述溶液3μL,所得信噪比（S/N）為3.1,即定量限為0.4μg。

2.6 精密度實驗

取鹽酸氨基葡萄糖顆粒適量,用水配制成質(zhì)量濃度約為4 mg·mL-1的鹽酸氨基葡萄糖溶液,重復進樣測定6 次,記錄其峰面積。計算得RSD 值為0.2%,表明該方法的精密度良好。

2.7 加樣回收率實驗

取鹽酸氨基葡萄糖顆粒（企業(yè)B,批號190205）2.635 6 g,加水300 mL使其溶解并稀釋至刻度（鹽酸氨基葡萄糖的質(zhì)量濃度為2.0 mg·mL-1）,搖勻,作為鹽酸氨基葡萄糖顆?；厥章时镜兹芤骸Ｓ糜诰芘渲坪}酸氨基葡萄糖對照品（質(zhì)量濃度4 mg·mL-1）80%、100%、120%3種不同的9份模擬樣品,扣除回收率本底溶液后已知藥物的質(zhì)量濃度分別約為3.2、4.0、4.8 mg·mL-1,作為加樣回收率供試品溶液。按照擬定的含量測定方法測定;另取鹽酸氨基葡萄糖對照品104.2 mg,置于25 mL 量瓶中,加水使其溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為對照品溶液。根據(jù)鹽酸氨基葡萄糖加入量與測得量計算回收率,計算得平均回收率為100.6%,RSD 值為0.5%。結(jié)果見表1。

表1 鹽酸氨基葡萄糖顆粒的回收率實驗結(jié)果Tab.1 Results of recovery test of Glucosamine Hydrochloride Granules

2.8 重復性實驗

按照2.2.3項下方法,稱取鹽酸氨基葡萄糖顆粒樣品（企業(yè)B,批號190205）適量,制備6份供試品溶液,精密量取20μL 注入液相色譜儀,記錄色譜圖。計算得6份供試品溶液的平均含量為99.6%,RSD值為0.6%,說明該方法的重復性良好。

2.9 穩(wěn)定性實驗

稱取鹽酸氨基葡萄糖顆粒適量,用水配制成氨基葡萄糖質(zhì)量濃度約為4 mg·mL-1的溶液,分別于0、2、16、37 h 測定峰面積,考察供試品溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果表明,供試品溶液在37 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 樣品測定

本實驗共收集到5批鹽酸氨基葡萄糖顆粒樣品,精密稱取各批裝量差異項下樣品（約相當于氨基葡萄糖200 mg）,按照2.2.3項下供試品溶液配制方法進行配制,以鹽酸氨基葡萄糖對照品為外標,結(jié)果見表2。結(jié)果顯示,5批樣品均符合規(guī)定[本品含鹽酸氨基葡萄糖（C6H13NO5·HCl）應為標示量的90.0%～110.0%]。

表2 5批樣品的測定結(jié)果Tab.2 Determination results of 5 samples

3 討論

3.1 現(xiàn)行標準含量測定方法存在的問題

現(xiàn)行質(zhì)量標準均采用高效液相色譜-紫外檢測法（HPLC-UV）測定含量,企業(yè)注冊標準YBH02202009采用的流動相體系為pH 2.5磷酸二氫鉀溶液-乙腈（30∶70）,企業(yè)注冊標準YBH00352014 采用的流動相體系為pH 7.0的磷酸氫二鉀溶液-乙腈（33∶67）。2種流動相體系pH 值差異較大,pH 2.5磷酸二氫鉀溶液-乙腈體系的pH 值較低,會引發(fā)氨基柱填料水解;pH 7.0的磷酸氫二鉀溶液-乙腈體系無法分離氨基葡萄糖峰與其輔料蔗糖峰。本文擬采用氨基柱-HPLC-UV 法,該方法適用性較強,與柱前衍生等方法相比,操作簡單且專屬性較強?？紤]到各企業(yè)生產(chǎn)的氨基柱差異較大,擬對氨基柱進行嚴格的篩選,最終確定以大曹三耀公司生產(chǎn)的氨基柱（CAPCELL PAK NH2,150 mm×4.6 mm,5μm）為分離色譜柱,以磷酸鹽緩溶液（取磷酸氫二鉀3.5 g,加水1 000 mL使溶解,加入0.25 mL 氨水,用磷酸調(diào)節(jié)pH 值至7.5）-乙腈（25∶75）為流動相體系,在該色譜條件下,既能實現(xiàn)氨基葡萄糖與其成鹽離子氯離子的較好分離,又能實現(xiàn)鹽酸氨基葡萄糖顆粒劑中氨基葡萄糖與其輔料蔗糖、乳糖和聚維酮K30 的良好分離,從而有效、準確地測定其主藥成分氨基葡萄糖的含量。

3.2 色譜柱的選擇

考慮到鹽酸氨基葡萄糖顆粒中輔料蔗糖、乳糖和聚維酮K30對主藥氨基葡萄糖的影響,在擬定的流動相體系下對4個品牌的色譜柱進行了篩選和考察。結(jié)果顯示:①美國Phenomenex 公司生產(chǎn)的氨基柱（Luna NH2150 mm×4.6 mm,5μm）雖能較好地分離氨基葡萄糖峰與其成鹽離子峰,峰形較好,但無法分離輔料蔗糖峰和氨基葡萄糖峰,調(diào)整流動相比例后仍無法分離;②納譜分析氨基柱（250 mm×4.6 mm,5μm）分離蔗糖峰和氨基葡萄糖峰的能力較弱,且氨基葡萄糖峰與乳糖峰的保留時間相對較近,調(diào)整流動相比例后會出現(xiàn)氨基葡萄糖峰與乳糖峰部分重疊的情況;③Waters氨基柱（150 mm×4.6 mm,5μm）能較好地分離氨基葡萄糖峰與其成鹽離子峰和輔料乳糖峰、聚維酮K30峰,但無法完全分離氨基葡萄糖峰和輔料蔗糖峰;④大曹氨基柱（CAPCELL PAK NH2,150 mm×4.6 mm,5μm）能較好地分離主峰氨基葡萄糖與其成鹽離子氯離子峰,亦能較好地分離氨基葡萄糖峰與其輔料蔗糖峰、乳糖峰。在確定選用大曹三耀公司生產(chǎn)的氨基柱后,為了進一步提高氨基葡萄糖與蔗糖的分離度,對色譜柱的使用溫度進行了篩選,在柱溫30、35℃下分別進樣鹽酸氨基葡萄糖顆粒供試品溶液,發(fā)現(xiàn)在柱溫為30℃時,氨基葡萄糖峰與蔗糖峰能較好分離。經(jīng)實驗最終確定將大曹三耀公司的氨基柱（CAPCELL PAK NH2,150 mm×4.6 mm,5μm）作為本研究的方法學色譜柱。

4 小結(jié)

鹽酸氨基葡萄糖顆?，F(xiàn)行各質(zhì)量標準收載的含量測定方法均不一致,流動相體系差異較大,且均無法分離主藥氨基葡萄糖與其輔料蔗糖、乳糖等,不能有效控制藥物含量。在本研究建立的含量測定條件下,鹽酸氨基葡萄糖顆粒劑中的主藥氨基葡萄糖與其成鹽離子（Cl-）能被較好地分離,同時氨基葡萄糖與其輔料蔗糖、乳糖也能被較好地分離。結(jié)果表明,該方法專屬性強、重復性好,能較好地滿足相關藥物生產(chǎn)企業(yè)的檢測條件,故該含量測定方法能滿足準確測定鹽酸氨基葡萄糖顆粒含量的要求。該研究可為鹽酸氨基葡萄糖顆粒劑或其他劑型的后續(xù)研究提供參考,為氨基葡萄糖類藥物質(zhì)量標準的提高提供技術(shù)支持。