馬 赫,蔡建超,張克中,崔金騰

(北京農(nóng)學(xué)院園林學(xué)院/城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實(shí)驗(yàn)室/北京市鄉(xiāng)村景觀規(guī)劃設(shè)計(jì)工程技術(shù)研究中心,北京 102206)

紫葉稠李(Padus virginiana)是薔薇科稠李屬落葉喬木,株高10—14 m,是一種珍貴的彩葉樹(shù)種,在我國(guó)北方,氣溫達(dá)到一定程度,紫葉稠李的初生葉由綠色逐漸轉(zhuǎn)為紫紅色,葉色靚麗極具觀賞價(jià)值[1-2]。

植物葉色變化主要由色素含量的相對(duì)變化引起,花青素是植物體內(nèi)的天然色素[3],可以遮擋部分強(qiáng)光,幫助植物抵御環(huán)境脅迫,降低光合作用對(duì)葉片的傷害[4],朱書(shū)香等[5]通過(guò)研究4種李屬植物,發(fā)現(xiàn)花色素苷能夠形成“光屏障”,吸收植物體內(nèi)的過(guò)剩光,緩解強(qiáng)光對(duì)植物光合作用的影響。

花青素的合成以苯丙氨酸為底物,經(jīng)酶促反應(yīng)、糖基化、?；冗^(guò)程最終達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài),參與合成的有PAL、CHS、CHI、F3H、F3’H、DFR、ANS、UFGT等結(jié)構(gòu)基因及MYB、bHLH、WD40等轉(zhuǎn)錄因子[6]。MYB轉(zhuǎn)錄因子對(duì)植物積累花青素具有重要意義,可通過(guò)調(diào)控花色素苷水平調(diào)控蘋(píng)果果皮的紅色和綠色條紋[7]。在楊樹(shù)中,MYB6正向調(diào)控花青素和單寧生物合成。MYB、bHLH和WD40互作可形成三元復(fù)合物,參與調(diào)節(jié)晚期類黃酮生物合成基因的表達(dá)[8]。

本研究基于花青素光保護(hù)理論對(duì)紫葉稠李進(jìn)行遮光處理,結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及生物信息學(xué)分析,對(duì)花青素合成通路上的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因和MYB家族轉(zhuǎn)錄因子MYB6和MYB10進(jìn)行驗(yàn)證,以期為紫葉稠李花色素苷調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

北京農(nóng)學(xué)院實(shí)踐基地中陸地生長(zhǎng)的2年生紫葉稠李(Padus virginiana)扦插苗。

1.2 遮光處理

選取長(zhǎng)勢(shì)良好的紫葉稠李60棵,30棵進(jìn)行20%光照處理(采用80%遮陽(yáng)網(wǎng)),另外30棵在自然條件全光照下生長(zhǎng)。試驗(yàn)期間,進(jìn)行常規(guī)管理,保持植株長(zhǎng)勢(shì)良好。遮光處理前1 d采集1次葉片,采集部位為頂端倒3葉,命名為Day0,處理30 d后,再分別采集1次葉片,20%光照處理組命名為ST_Day30,自然條件全光照處理組命名為Day30。試驗(yàn)時(shí)間為2019年4月至5月。

1.3 葉色參數(shù)測(cè)定

采用柯尼卡美能達(dá)(中國(guó))投資公司的色彩色差計(jì)(CR-400/410)測(cè)定葉色參數(shù),L*表示照度,相當(dāng)于亮度,L*的值域由0到100,表示由黑色向白色轉(zhuǎn)變。a*和b*的值域都是-127至+128,a*表示由綠色向紅色轉(zhuǎn)變;b*表示由藍(lán)色向黃色轉(zhuǎn)變,所有顏色以這三個(gè)值交互變化表示。

1.4 花色素苷含量測(cè)定

采用鹽酸提取比色法測(cè)定花色素苷含量[5],稱取植物樣品0.50 g,置于離心管中,加0.1 mol/L鹽酸溶液20 mL,使樣品完全浸于溶液中,置于32℃恒溫箱中浸提8 h,使用光徑1 cm的比色皿,以0.1 mol/L鹽酸為空白對(duì)照,測(cè)量波長(zhǎng)530 nm下的吸光值?；ㄉ剀蘸?mg/L)=A(530)/0.1×樣品質(zhì)量(g)

1.5 RNA的提取和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

使用北京艾德萊生物科技有限公司EASYspin Plus RNA快速提取試劑盒,提取紫葉稠李葉片總RNA。通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。使用Nanodrop2000檢測(cè)RNA的濃度和純度。采用Illumina Hiseq 2500進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.6 基因功能注釋、轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)和差異基因分析

將拼接得到Unigene序列與Nr、Swiss-Prot、Pfam、KOG、GO和KEGG六大數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)獲得功能注釋,與PlantTFDB數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)得到轉(zhuǎn)錄因子信息,利用DEGseq進(jìn)行組間差異表達(dá)分析,通過(guò)與GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),獲得差異基因的功能注釋及通路注釋。

1.7 關(guān)鍵基因的qRT-PCR

使用北京全式金生物技術(shù)有限公司試劑盒TransScriptOne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SupperMix將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,PCR程序設(shè)定為:55℃30 min,85℃5 s。使用北京全式金生物技術(shù)有限公司試劑盒TransScripTtop Green qPCR SupperMix配置熒光定量體系,qPCR程序設(shè)定為:94℃30 s,94℃5 s,60℃10 s,70℃10 s,45 cycles。所用引物見(jiàn)表1。根據(jù)富集結(jié)果篩選出花色素苷代謝通路PAL、CHS、CHI、F3H、F3’H、DFR、ANS、UFGT八個(gè)關(guān)鍵功能基因及轉(zhuǎn)錄因子MYB6和MYB10并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析。

表1 引物序列Table 1 Primers and sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 遮光對(duì)紫葉稠李葉色參數(shù)的影響

光照是影響彩葉植物葉色變化的重要環(huán)境因子之一,在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中,植物通過(guò)改變形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化等方式應(yīng)對(duì)復(fù)雜的光環(huán)境[1]。由圖1和圖2可知,自然全光照的葉片由綠色變?yōu)樽霞t色,80%遮光處理30 d后的紫葉稠李葉片并未完全變色,與全光照30 d的葉片相比,a*值減小,b*值增加,葉片亮度L*值增強(qiáng),葉面與葉背顏色不同,葉面偏綠色,葉背偏紫紅色。

圖1 光照強(qiáng)度對(duì)紫葉稠李葉片顏色變化的影響Fig.1 Effects of light intensity on leaf color change of Padus virginiana

圖2 遮光對(duì)紫葉稠李葉色參數(shù)的影響Fig.2 Effects of shading on leaf color parameters of Padus virginiana

2.2 遮光對(duì)紫葉稠李葉片中花色素苷含量的影響

光照可通過(guò)促進(jìn)可溶性糖的積累來(lái)激活花色素苷合成的某些酶類,從而促進(jìn)花色素苷的合成。全光照30 d后葉片花色素苷含量顯著提高,而遮光處理30 d的葉片,花色素苷雖然也有積累,但伴隨著光照強(qiáng)度的減弱,積累量明顯小于全光照組(圖3)。

圖3 遮光對(duì)紫葉稠李葉片花色素苷含量的影響Fig.3 Effects of shading on the anthocyanin content of Padus virginiana

2.3 紫葉稠李轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量統(tǒng)計(jì)

對(duì)Day0、Day30、ST_Day30三個(gè)試驗(yàn)組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,設(shè)置兩次重復(fù),總共獲得145.87GB的Clean Data,具體結(jié)果見(jiàn)表2。Day0、Day30、ST_Day30分別獲得Clean reads 102 560 220、118 348 698、112 063 772,單次重復(fù)獲得的Clean reads大于46 931 024,N50值1 266 bp,Q20值超過(guò)98%,Q30值超過(guò)94%,GC含量處于46%—47.1%,無(wú)AT和GC分離,測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較高。圖4顯示,Unigene的長(zhǎng)度分布于1—400區(qū)間的最多,達(dá)到了40 000以上,隨著分布區(qū)間的變長(zhǎng),數(shù)量逐漸減少。

圖4 紫葉稠李Unigene長(zhǎng)度分布Fig.4 Length distribution of Unigenes of Padus virginiana

表2 質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 2 Quality control data statistics

2.4 紫葉稠李轉(zhuǎn)錄組Unigene的功能注釋

本試驗(yàn)中紫葉稠李為無(wú)參轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,將該次轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的所有轉(zhuǎn)錄本與六大數(shù)據(jù)庫(kù)(NR,Swiss-Prot,Pfam,COG,GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù))進(jìn)行比對(duì),E-value值設(shè)為1e-3,Unigene所占比例分別為52.3 %、42.83%、34.8%、10.17%、20.62%、27.41%、58.62%,Unigene在NR和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)占比最高(表3)。

表3 Unigene與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果Table 3 Comparison of Unigene and six databases

NCBI_NR為綜合數(shù)據(jù)庫(kù),其中包含Swiss-Prot、PIR、PRF、PDB等蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中非冗余的數(shù)據(jù)以及從GenBank和RefSeq的CDS數(shù)據(jù)庫(kù)中翻譯所得的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)。通過(guò)與NR數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì),可以查看紫葉稠李轉(zhuǎn)錄本序列與相近物種的相似情況,以及同源序列的功能信息。NR注釋顯示紫葉稠李與歐李(Prunus avium,31%)、桃(Prunus persica,24.17%)、梅(Prunus mume,14.52%)3個(gè)物種同源關(guān)系最近(圖5)。

圖5 紫葉稠李NR庫(kù)比對(duì)物種分布占比Fig.5 Distribution of species distribution in Padus virginiana NR library

2.5 遮光對(duì)紫葉稠李基因表達(dá)的影響

設(shè)置Day30_vs_ST_Day30、Day0_vs_Day30、Day0_vs_ST_Day30三個(gè)組件對(duì)比分析。對(duì)不同樣品間的raw counts進(jìn)行基于TMM方法的標(biāo)準(zhǔn)化,默認(rèn)利用DEGseq軟件進(jìn)行組間差異表達(dá)分析,默認(rèn)閾值:padjust＜0.05&|log2FC|＞=1。以基因在兩個(gè)樣本間表達(dá)差異的倍數(shù)變化值為橫坐標(biāo),P值為縱坐標(biāo),繪制差異基因表達(dá)火山圖(圖6),從圖中可看出,Day30_vs_ST_Day30差異表達(dá)基因共2 432條,其中上調(diào)1 396條,下調(diào)1 036條;Day0_vs_Day30差異表達(dá)基因共2 811條,其中上調(diào)806條,下調(diào)2 005條;Day0_vs_ST_Day30差異表達(dá)基因共3 368條,上調(diào)1 376條,下調(diào)1 992條。

圖6 遮光處理下紫葉稠李差異基因表達(dá)分析Fig.6 The analysis of differential gene expression of Padus virginiana in shading

通過(guò)與GO數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),對(duì)紫葉稠李的差異基因按照其細(xì)胞組分(Cellular Component)、分子功能(Molecular Function)和參與的生物過(guò)程(Biological Process)進(jìn)行分類注釋,篩選顯著富集在前20位的Go Term繪制折線圖(圖7),設(shè)置篩選參數(shù)P值(FDR)＜0.05,由圖7可知,Day30 vs ST_Day30有1 125條基因富集到177個(gè)GO term中,其中,主要富集在細(xì)胞大分子代謝過(guò)程(Cellular macromolecule metabolic process)、細(xì)胞過(guò)程(Cellular process)、細(xì)胞內(nèi)部分(Intracellular part)、氧化還原過(guò)程(Oxidation-reduction process)、氧化還原酶活性(Oxidoreductase activity)、氮化合物代謝過(guò)程(Nitrogen compound metabolic process);Day0 vs Day30有1 396條基因富集到211個(gè)GO term中,其中,主要富集在碳水化合物代謝過(guò)程(Carbohydrate metabolic process)、細(xì)胞碳水化合物代謝過(guò)程(Cellular carbohydrate metabolic process)、多糖代謝過(guò)程(Polysaccharide metabolic process)、細(xì)胞壁組織(Cell wall organization)、細(xì)胞多糖代謝過(guò)程(Cellular polysaccharide metabolic process)、細(xì)胞外區(qū)域(Extracellular region)、蛋白質(zhì)復(fù)合物(Protein complex)、外部封裝結(jié)構(gòu)(External encapsulating structure);Day0 vs ST_Day30有1 069條基因富集到215個(gè)GO term中,其中,主要富集在催化活性(Catalytic activity)、細(xì)胞內(nèi)部分(Intracellular part)、氧化還原過(guò)程(Oxidation-reduction process)。

圖7 遮光處理下紫葉稠李差異基因GO富集分析Fig.7 The analysis of differentially expressed genes in GO enrichment of Padus virginiana in shading

通過(guò)與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),獲得紫葉稠李的基因或轉(zhuǎn)錄本對(duì)應(yīng)的KO編號(hào),根據(jù)KO編號(hào)獲得Unigene可能參與的具體生物學(xué)通路情況。紫葉稠李KEGG注釋到遺傳信息處理(Genetic Information Processing),代謝(Metabolism),環(huán)境信息處理(Environmental Information Processing),細(xì)胞過(guò)程(Cellular Processes),生物體系統(tǒng)(Organismal Systems)等通路,篩選顯著富集在前10位的差異基因繪制KEGG代謝通路氣泡圖(圖8),設(shè)置篩選參數(shù)P值(FDR)＜0.05。在Day30 vs ST_Day30顯著富集在前10位的代謝通路中,苯丙氨酸代謝(Phenylalanine metabolism)、淀粉和蔗糖代謝(Starch and sucrose metabolism)、氰氨基酸代謝(Cyanoamino acid metabolism)、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Plant hormone signal transduction)、脂肪酸生物合成(Fatty acid biosynthesis)5條代謝途徑富集的差異基因較多,分別為50、38、27、38和15個(gè)差異基因;Day0 vs Day30顯著富集在前10位的代謝通路中,苯丙烷類生物合成(Phenylpropanoid biosynthesis)、氨基糖和核苷酸糖代謝(Amino sugar and nucleotide sugar metabolism)、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Plant hormone signal transduction)、脂肪酸生物合成(Fatty acid biosynthesis)和氰氨基酸代謝(Cyanoamino acid metabolism)5條代謝途徑富集的差異基因較多,分別為40、32、32、24和24個(gè)差異基因;Day0 vs ST_Day30顯著性富集在前10位的代謝通路中,苯丙烷類生物合成(Phenylpropanoid biosynthesis)、脂肪酸生物合成(Fatty acid biosynthesis)、淀粉和蔗糖代謝(Starch and sucrose metabolism)、氨基糖和核苷酸糖代謝(Amino sugar and nucleotide sugar metabolism)和類黃酮生物合成(Flavonoid biosynthesis)5條代謝途徑富集的差異基因較多,分別為36、27、46、36和18個(gè)差異基因。

圖8 遮光處理下紫葉稠李差異基因KEGG富集分析Fig.8 The analysis of differential expression gene KEGG enrichment of Padus virginiana in shading

Day0 vs ST_Day30有279條差異基因顯著富集到14條代謝通路上,為苯丙烷類生物合成(Phenylpropanoid biosynthesis)、脂肪酸生物合成(Fatty acid biosynthesis)、淀粉和蔗糖代謝(Starch and sucrose metabolism)、氨基糖和核苷酸糖代謝(Amino sugar and nucleotide sugar metabolism)、類黃酮生物合成(Flavonoid biosynthesis)代謝途徑。

2.6 紫葉稠李轉(zhuǎn)錄因子統(tǒng)計(jì)

轉(zhuǎn)錄因子是一類能與基因5’端上游特定序列專一性結(jié)合,調(diào)控目的基因以特定強(qiáng)度在特定時(shí)空表達(dá)的蛋白質(zhì)分子。通過(guò)與PlantTFDB 4.0數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),得到紫葉稠李轉(zhuǎn)錄因子1 261條,其中MYB超級(jí)家族最多,共有213條,占總數(shù)的17%,數(shù)量是其他轉(zhuǎn)錄因子的兩倍以上,AP2/ERF家族96條,bHLH家族87條,NAC家族68條,bZIP家族59條(圖9)。

圖9 遮光處理下紫葉稠李轉(zhuǎn)錄因子統(tǒng)計(jì)Fig.9 Transcription factor statistics of Padus virginiana in shading

2.7 紫葉稠李花青素合成途徑關(guān)鍵基因的qRT-PCR驗(yàn)證

對(duì)比Day30自然全光照條件,紫葉稠李在經(jīng)過(guò)30 d的遮光處理后,花青素合成通路上的關(guān)鍵酶PAL、CHS、CHI、F3H、F3’H、DFR、ANS、UFGT均呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì),花青素合成在遮光下受到了抑制,MYB6與MYB10呈表達(dá)上調(diào)趨勢(shì)(圖10),說(shuō)明其對(duì)花色素苷合成途徑相關(guān)基因起到負(fù)調(diào)控的作用。

圖10 紫葉稠李花青素合成途徑關(guān)鍵基因的熒光定量分析Fig.10 The qRT-PCR verification of key genes in the anthocyanin synthesis pathway of Padus virginiana

3 結(jié)論與討論

孟祥春等[9]研究發(fā)現(xiàn),非洲菊遮光后花色素的積聚減少,無(wú)法進(jìn)行正常上色。PAL苯丙氨酸解氨酶是連接初生代謝與次生代謝途經(jīng)的紐帶,是多酚類代謝的起始酶[10-11]。顧辰辰等[12]對(duì)茶樹(shù)短期遮光的影響研究表明,短期遮光處理對(duì)茶樹(shù)花色素苷代謝通路關(guān)鍵酶基因的表達(dá)影響很大,PAL、F3’H、DFR、UFGT出現(xiàn)下調(diào)現(xiàn)象。周波等[13]研究發(fā)現(xiàn),草莓果實(shí)花色素苷的合成量受到光敏感度的影響,光不敏感草莓果實(shí)的花色素苷合成相關(guān)基因CHS、DFR、ANS遮光與不遮光表達(dá)沒(méi)有明顯差異,而光敏感草莓果實(shí)表達(dá)量受光部分要高于遮光部分。F3’H基因的上調(diào)會(huì)導(dǎo)致Penstemon barbatus花從藍(lán)色到紅色的變化[14],說(shuō)明紫葉稠李葉片的花色素苷含量與其有密切關(guān)系,UFGT是花色素苷合成過(guò)程中最后一個(gè)酶,主要是在花色素苷合成后,對(duì)碳骨架起到糖基化修飾的作用[15],它能將不穩(wěn)定的花色素苷進(jìn)行糖基化,使其轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的花色素苷。UFGT基因的表達(dá)與花色素苷含量變化趨勢(shì)相同,這一結(jié)果與蘋(píng)果、梨、葡萄中的報(bào)道一致[16-17]。

調(diào)節(jié)植物花色素苷代謝途徑的轉(zhuǎn)錄因子主要有MYB、bHLH和WD40,能與結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子結(jié)合,并影響花色素苷生物合成途徑中一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá),從而改變花色素苷的代謝[18-19]。Yao等[20]研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)錄因子PyMYBll4和PyMYB10存在相互作用及功能疊加的效應(yīng),使花色素苷的生物合成得到加強(qiáng)。

本研究發(fā)現(xiàn),遮光對(duì)紫葉稠李葉片淀粉和蔗糖代謝、苯丙烷類生物合成、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響不大,可能是植物適應(yīng)環(huán)境并進(jìn)行正常生長(zhǎng)發(fā)育的必要生命代謝活動(dòng),氰氨基酸代謝途徑的富集說(shuō)明植物啟動(dòng)了自身的防御機(jī)制以抵抗病蟲(chóng)害,另外,遮光也較顯著影響了類胡蘿卜素生物合成過(guò)程、α-亞麻酸的代謝過(guò)程,半萜類三萜類生物合成過(guò)程及玉米素合成過(guò)程。遮光對(duì)植物體內(nèi)類黃酮生物合成有顯著影響,類黃酮是植物重要的一類次生代謝產(chǎn)物,花色素苷是類黃酮合成途徑的一個(gè)分支。本研究發(fā)現(xiàn),遮光對(duì)紫葉稠李葉片的著色有顯著影響,并減少了葉片中的花色素苷合成,通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn),遮光與全日照條件下的差異基因主要富集在類黃酮生物合成代謝通路,進(jìn)一步說(shuō)明光照是紫葉稠李葉片著色和花色素苷代謝的關(guān)鍵因素之一,熒光定量分析顯示,遮光使花色素苷合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶基因PAL、CHS、CHI、F3H、F3’H、DFR、ANS、UFGT表達(dá)下調(diào),關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子MYB6、MYB10表達(dá)上調(diào)。