謝永平， 華春珍， 魏林琳， 汪洪姣， 王高良， 李建平

（1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院感染病科，浙江 杭州 310003；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)中心，浙江 杭州 310003）

呼吸道感染是臨床常見(jiàn)的疾病之一，以肺炎為代表的下呼吸道感染是造成兒童門(mén)診和住院的最常見(jiàn)原因[1]。發(fā)展中國(guó)家兒童肺炎以細(xì)菌感染多見(jiàn)，其中肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）、流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae）和卡他莫拉菌（Moraxella catarrhalis）是全球公認(rèn)的社區(qū)獲得性肺炎三大細(xì)菌學(xué)病原[1-3]，這些病原菌的確定往往通過(guò)氣道分泌物——肺泡灌洗液、肺穿刺液、深部痰液培養(yǎng)協(xié)助診斷。肺泡灌洗液、肺穿刺液檢測(cè)為創(chuàng)傷性檢查，在兒科臨床不常用；采集兒童痰液比較困難[4]，＜1歲的患兒不能自主咳痰，通過(guò)誘導(dǎo)收集的痰液樣本合格率也較低[5-6]，明顯影響肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌等呼吸道苛氧菌的檢出率[4-6]。此外，百日咳再現(xiàn)是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的熱點(diǎn)問(wèn)題[7-8]，百日咳的病原——百日咳鮑德特菌（Bordetella pertussis，BP）是上呼吸道病原，鼻咽拭子是培養(yǎng)百日咳鮑德特菌的最理想樣本，而且鼻咽拭子采集很容易規(guī)范化操作。本研究通過(guò)對(duì)類百日咳綜合征和急性肺炎患兒同時(shí)進(jìn)行鼻咽拭子培養(yǎng)和深部誘導(dǎo)口腔吸取物培養(yǎng)，比較2種樣本細(xì)菌培養(yǎng)的陽(yáng)性率和分離菌種，并結(jié)合患兒臨床癥狀和治療后細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果，評(píng)價(jià)鼻咽拭子培養(yǎng)在兒童細(xì)菌性呼吸道感染中的診斷價(jià)值，為兒童呼吸道樣本的采集方式選擇提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2019年1月1日—6月30日浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院某病區(qū)疑診為急性肺炎和類百日咳綜合征的患兒。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡＜1歲；（2）符合肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；（3）類百日咳綜合征患兒具有類似百日咳的臨床表現(xiàn)[10]。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）胃食管反流等影響負(fù)壓抽吸誘導(dǎo)痰液患兒；（2）因出牙影響吸痰患兒；（3）近期有鼻腔出血或其他鼻腔問(wèn)題影響鼻咽拭子采集患兒。本研究獲浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理編號(hào)：2016-IRB-014），患兒監(jiān)護(hù)人均知情同意。

1.2 儀器和試劑

英國(guó)OXOID 公司CM0119碳瓊脂培養(yǎng)基（生產(chǎn)批號(hào)1824403）、選擇性鮑德特菌培養(yǎng)基添加物（每支含頭孢氨芐20.0 mg）；英國(guó)Remel Europe公司百日咳鮑德特菌凝集血清（生產(chǎn)批號(hào)1508264）和副百日咳鮑德特菌凝集血清（生產(chǎn)批號(hào)1751599）；意大利Copan公司無(wú)菌藻酸鈣鼻咽拭子。法國(guó)生物梅里埃公司含5%羊血的哥倫比亞基礎(chǔ)瓊脂培養(yǎng)皿和嗜血桿菌選擇性培養(yǎng)基（HAE）、VITEK 2 Compact自動(dòng)化鑒定藥敏儀。德國(guó)Bruker公司Microflex LT/SH質(zhì)譜儀。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 同時(shí)采集患兒入院時(shí)鼻咽拭子和口腔吸取物樣本。鼻咽拭子采集時(shí)固定患兒頭部及上肢，將拭子貼鼻孔壁，沿垂直于耳垂方向慢慢轉(zhuǎn)動(dòng)進(jìn)入患兒1側(cè)鼻孔內(nèi)，至鼻腭處（深度約為鼻尖至耳垂距離），然后邊擦拭邊旋轉(zhuǎn)至少3圈，慢慢取出，置于原裝無(wú)菌套管內(nèi)立即送檢。口腔吸取物采集時(shí)患兒行0.9%氯化鈉溶液霧化，經(jīng)口腔負(fù)壓抽吸深部口腔吸取物至少5 mL，置于無(wú)菌痰杯立即送檢。合格口腔吸取物的標(biāo)準(zhǔn)為涂片鏡檢每低倍鏡視野白細(xì)胞＞25個(gè)、上皮細(xì)胞＜10個(gè)[5]。

1.3.2 樣本的接種、培養(yǎng)和鑒定 樣本采集后（包括不合格口腔吸取物）立即分區(qū)劃種于含5%羊血的哥倫比亞基礎(chǔ)瓊脂培養(yǎng)皿。嗜血桿菌選擇性培養(yǎng)皿和碳瓊脂培養(yǎng)皿。前兩者置5%CO2孵箱，35 ℃（濕度60%～70%）孵育18～20 h；后者置普通孵箱，35 ℃（濕度60%～70%）孵育7 d。

1.3.3 細(xì)菌鑒定 流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌的鑒定采用NH卡，肺炎鏈球菌的鑒定采用GPI卡加Optochin試驗(yàn)。百日咳鮑德特菌的鑒定采用抗血清凝集試驗(yàn)+質(zhì)譜分析驗(yàn)證。百日咳鮑德特菌只要分離到，無(wú)論定量多少，均有臨床意義；其他細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果“+++”及以上考慮有臨床意義[11]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料以±s表示，非正態(tài)分布資料用中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25，P75）]表示。計(jì)數(shù)資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患兒一般情況

共納入患兒403例，其中男145例（36.0%），年齡（157±97）d；女258例（64%），年齡（158±88）d。有7例（1.7%）患兒合并基礎(chǔ)疾病，其中先天性喉軟骨軟化3例、癲癇2例、腦萎縮和支氣管肺發(fā)育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）各1例。有303例（75.2%）患兒入院前經(jīng)β-內(nèi)酰胺酶類抗菌藥物治療5（3，10）d，31例（7.7%）單用大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物治療4（3，5）d，69例（17.1%）入院前未經(jīng)抗菌藥物治療。按照痰液的標(biāo)準(zhǔn)，403份口腔吸取物樣本合格率僅為12.2%（49/403）。

2.2 口腔吸取物和鼻咽拭子培養(yǎng)結(jié)果比較

分別有50份（12.4%）口腔吸取物樣本和127份（31.5%）鼻咽拭子樣本樣本分離到致病菌（如百日咳鮑德特菌）或條件致病菌“+++”以上。鼻咽拭子培養(yǎng)總陽(yáng)性率（χ2=42.92，P＜0.001）和百日咳鮑德特菌（χ2=49.10，P＜0.001）、流感嗜血桿菌（χ2=4.17，P=0.041）、卡他莫拉菌（χ2=7.38，P=0.007）、肺炎鏈球菌（χ2=4.37，P=0.037）的分離率均顯著高于口腔吸取物樣本。62.0%（31/50）的患兒鼻咽拭子細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果與口腔吸取物細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果一致。2種樣本細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 403例患兒2種樣本病原培養(yǎng)結(jié)果比較

2.3 患兒臨床特點(diǎn)和治療轉(zhuǎn)歸

鼻咽拭子培養(yǎng)到條件致病菌的127例患兒中，男性患兒69例（54.3%）、女性患兒58例（45.7%）；百日咳患兒54例（42.5%），其中38例合并肺炎；類百日咳綜合征患兒24例（18.9%），其中10例合并肺炎；無(wú)百日咳樣咳嗽肺炎患兒49例（38.6%），其中2例合并膿毒癥、1例合并鵝口瘡、1例合并流行性感冒、1例合并血小板減少性紫癜。除5例百日咳患兒癥狀改善不明顯外，其余122例（96.1%）患兒治療后，均治愈或好轉(zhuǎn)，無(wú)并發(fā)癥和后遺癥發(fā)生。127例恢復(fù)期患兒經(jīng)鼻咽拭子培養(yǎng)復(fù)查，病原陰轉(zhuǎn)率為98.4%（125/127），僅2例百日咳患兒百日咳鮑德特菌持續(xù)陽(yáng)性。

3 討論

人體鼻咽部是一個(gè)含大量正常菌群的巨大微生態(tài)系統(tǒng)，這些正常菌群通常包括鏈球菌屬、嗜血桿菌屬、葡萄球菌屬、莫拉菌屬和棒狀桿菌屬，是人體抵御致病菌、條件致病菌的一道重要的微生物屏障[12-13]。肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌為鼻咽部常見(jiàn)條件致病菌，在鼻咽部少量存在時(shí)構(gòu)成正常菌群的一部分，但當(dāng)某種細(xì)菌呈絕對(duì)優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)時(shí)，可引起機(jī)體感染。痰液培養(yǎng)在下呼吸道感染病原診斷中的價(jià)值一致受到爭(zhēng)議[14]。一般認(rèn)為，上述細(xì)菌在痰液等上呼吸道有菌定植或寄生來(lái)源的樣本分區(qū)劃種半定量達(dá)“+++”及以上時(shí)，應(yīng)考慮感染可能，可界定為陽(yáng)性[15]。鼻咽部菌群與下呼吸道感染關(guān)聯(lián)，當(dāng)鼻咽部某些細(xì)菌增多，開(kāi)始優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)時(shí)，就可能向下呼吸道移行，引起肺部感染[16]。本研究403份口腔吸取物樣本中僅有12.4%的樣本細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果陽(yáng)性，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌這三大社區(qū)獲得性肺炎病原菌分離率較低，除與這些苛養(yǎng)菌體外生存能力較弱、對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較高有關(guān)外，還與本研究人群為＜1歲患兒有較大關(guān)系，從患兒口腔按照吸痰操作吸出的部分吸取物并非真正的痰液，近90%不符合痰液標(biāo)準(zhǔn)，與相關(guān)研究結(jié)果[6]一致。本研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽拭子培養(yǎng)條件致病菌半定量達(dá)“+++”及以上的分離率顯著高于口腔吸取物培養(yǎng)，尤其是流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌和卡他莫拉菌等苛養(yǎng)菌的分離率大幅度提高，且病原菌與臨床感染符合，治療后患兒臨床癥狀改善的同時(shí)，這些病原菌在鼻咽部?jī)?yōu)勢(shì)生長(zhǎng)的狀態(tài)不復(fù)存在，提示鼻咽拭子培養(yǎng)的結(jié)果對(duì)患兒細(xì)菌性下呼吸道感染的病原診斷有參考價(jià)值。

百日咳是由百日咳鮑德特菌感染引起的急性呼吸道傳染病，近年來(lái)在國(guó)內(nèi)外發(fā)病率大幅度上升[17-18]，已引起廣泛關(guān)注。百日咳鮑德特菌是上呼吸道病原，主要感染部位在鼻咽部，很少侵入下呼吸道引起肺炎，因此鼻咽拭子是監(jiān)測(cè)百日咳鮑德特菌的最佳樣本。本研究由于入組時(shí)納入較多類百日咳綜合征患兒，百日咳鮑德特菌分離率最高，也提示百日咳是兒科臨床常見(jiàn)病種[19]。本研究中，口腔吸取物極少培養(yǎng)到百日咳鮑德特菌，符合百日咳的特點(diǎn)。本研究還發(fā)現(xiàn)，百日咳患兒合并或繼發(fā)流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌和肺炎鏈球菌感染的概率較高，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

采集鼻咽拭子作為病毒檢測(cè)的樣本應(yīng)用廣泛，但關(guān)于鼻咽拭子培養(yǎng)在下呼吸道感染患兒病原菌診斷中的價(jià)值，國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。鼻咽拭子樣本采集較為簡(jiǎn)單，操作過(guò)程容易規(guī)范，包括進(jìn)入鼻腔的深度和刷取黏液時(shí)拭子旋轉(zhuǎn)的次數(shù)都可數(shù)據(jù)化界定，可確保不同人員采集的樣本質(zhì)量都能均質(zhì)穩(wěn)定。本研究的不足之處在于研究樣本量不夠大，且僅僅是單中心研究。為更客觀地評(píng)價(jià)鼻咽拭子培養(yǎng)在兒童呼吸道感染病原診斷中的價(jià)值，我們擬建立多中心研究平臺(tái)，在細(xì)菌培養(yǎng)的同時(shí)，采用鼻咽拭子高通量測(cè)序分析鼻咽部的菌群類型和各優(yōu)勢(shì)菌屬、菌種的絕對(duì)豐度、相對(duì)豐度，分析鼻咽拭子分區(qū)劃種培養(yǎng)半定量結(jié)果與高通量測(cè)序菌群豐度之間的定量關(guān)系，并與臨床診治結(jié)果相關(guān)聯(lián)，以更好地評(píng)價(jià)鼻咽拭子培養(yǎng)在兒童呼吸道感染病原診斷中的價(jià)值。