張靖楠，昌行行，張嘉祺，何培新，張志平，宋麗麗，楊旭，魏濤

鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001

0 引言

隨著全球工業(yè)化的發(fā)展，環(huán)境污染和能源危機(jī)已成為制約社會(huì)發(fā)展的重要因素。氫能作為一種高效、清潔的可再生能源，在社會(huì)生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)展，是未來重要的新能源物質(zhì)[1]。暗發(fā)酵制氫是指微生物利用氫酶的催化作用降解有機(jī)物產(chǎn)生H2，同時(shí)生成揮發(fā)性脂肪酸(VFAs)、醇類等代謝產(chǎn)物[2]。與其他制氫方法相比，暗發(fā)酵制氫具有產(chǎn)H2速率高、工藝簡單、底物利用范圍廣等優(yōu)勢(shì)[3]。目前，暗發(fā)酵制氫通常采用堆肥、污泥[4-5]、牧畜糞便[6-7]等作為發(fā)酵菌源。這些天然混合菌源中不僅含有嚴(yán)格厭氧的梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)、兼性厭氧的埃希氏菌屬(Escherichia)、腸桿菌屬(Enterobacter)[8]等產(chǎn)氫菌，同時(shí)也存在產(chǎn)甲烷菌[9]、產(chǎn)乙酸菌[10]等耗氫菌。耗氫微生物的存在勢(shì)必會(huì)對(duì)暗發(fā)酵制氫產(chǎn)生負(fù)面影響。為了獲得高效的產(chǎn)氫菌，同時(shí)抑制或殺滅耗氫菌，在暗發(fā)酵制氫前通常需要對(duì)菌源進(jìn)行預(yù)處理。目前常用的菌源預(yù)處理方式主要包括酸、堿[11-12]、化學(xué)抑制劑[13]、水熱[14]、超聲波[15-16]等，這些預(yù)處理方法普遍存在操作復(fù)雜、處理時(shí)間長、能耗高等缺點(diǎn)。因此，有必要尋求新的安全高效、操作簡便的菌源預(yù)處理方法。

微波是指波長為1 mm～1 m，頻率為300 MHz～3000 GHz的電磁波[17]。微波輻射作為一種節(jié)能高效的熱能技術(shù)，具有加熱效率高、過程易控、環(huán)境友好等特點(diǎn)[18]，被廣泛用于生物質(zhì)酶解產(chǎn)糖、食品加工、環(huán)境污染治理等諸多領(lǐng)域[19-20]。馬歡等[21]采用微波輻射技術(shù)對(duì)水稻秸稈進(jìn)行預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)微波輻射可以破壞水稻秸稈表面特殊的“角質(zhì)-雙硅層”結(jié)構(gòu)和木質(zhì)素-半纖維素復(fù)合體，提高纖維素酶的酶解效果。微波輻射還可以通過熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)破壞微生物菌體[22]，抑制和殺滅不耐受高溫的微生物菌體。目前，微波輻射及微波輔助酸或堿預(yù)處理工農(nóng)業(yè)有機(jī)廢物暗發(fā)酵制氫的研究多側(cè)重于預(yù)處理工藝優(yōu)化或?qū)τ袡C(jī)廢物結(jié)構(gòu)變化的影響[23-26]，鮮見微波輻射預(yù)處理引起菌源微生物群落結(jié)構(gòu)變化進(jìn)而影響暗發(fā)酵制氫的研究。

本文以牛糞堆肥為天然菌源、葡萄糖為發(fā)酵底物，擬考查微波輻射預(yù)處理對(duì)生物暗發(fā)酵制氫性能的影響，采用Illumina NovaSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)微波輻射預(yù)處理前后菌源的菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，以期揭示微波輻射預(yù)處理引起的微生物群落結(jié)構(gòu)變化影響暗發(fā)酵制氫的機(jī)制，為構(gòu)建穩(wěn)定、高效的暗發(fā)酵制氫體系提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛糞堆肥(含水率40%左右)，取自鄭州市新鄭奶牛場(chǎng)；葡萄糖及其他常用化學(xué)試劑，均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)。

1.2 培養(yǎng)基

種子發(fā)酵培養(yǎng)基(600 mL)：葡萄糖6.0 g，L-半胱氨酸0.3 g，蛋白胨2.4 g，NaCl 1.8 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.06 g，KH2PO40.6 g，K2HPO40.6 g，MgCl20.06 g，pH值為7.0。

發(fā)酵產(chǎn)氫培養(yǎng)基(50 mL)：葡萄糖0.5 g，L-半胱氨酸0.025 g，KH2PO40.05 g，NH4HCO30.05 g，去離子水45 mL，種子液5 mL，營養(yǎng)液0.3 mL，調(diào)節(jié)pH值為 6.5。

營養(yǎng)液(1 L)：FeCl20.002 78 g，NaCl 0.01 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，CaCl2·2H2O 0.01 g，Na2MO4·2H2O 0.01 g，MnSO4·7H2O 0.015 g。

1.3 主要儀器與設(shè)備

M1-L213B型微波爐，美的集團(tuán)股份有限公司產(chǎn)；THZ-82B型氣浴恒溫振蕩器，江蘇金怡儀器科技有限公司產(chǎn)；Aglient-7890B型氣相色譜儀、Aglient-7820A型氣相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司產(chǎn)；D2012plus型離心機(jī)，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器股份公司產(chǎn)；SHC-A型H2發(fā)生器、QLB-A型純凈空氣泵，北京創(chuàng)杰新世紀(jì)科技發(fā)展有限公司產(chǎn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 菌源預(yù)處理在前期研究的基礎(chǔ)上，將牛糞堆肥與去離子水按照料液比1∶2.2(g/mL)混合，微波輻射5 min后，用篩網(wǎng)過濾收集菌液。未微波輻射處理的菌源作為對(duì)照組。

1.4.2 種子預(yù)培養(yǎng)將1.4.1中所得菌液放入裝有種子發(fā)酵培養(yǎng)基的血清瓶中，充N2營造厭氧環(huán)境，封蓋后放入搖床，設(shè)置搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，溫度(35±1) ℃進(jìn)行種子預(yù)培養(yǎng)。

1.4.3 暗發(fā)酵產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)采用10%接種量將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的種子液移取至含有葡萄糖的發(fā)酵產(chǎn)氫培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)發(fā)酵體系初始pH值為6.5，充入高純N2除去培養(yǎng)基中的O2，封蓋后放入搖床，設(shè)置搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，溫度(35±1) ℃進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)，定期取樣分析氣體成分和液相代謝產(chǎn)物。

1.5 分析方法

1.5.1 氣相產(chǎn)物分析采用定時(shí)排飽和食鹽水法測(cè)量發(fā)酵瓶內(nèi)的氣體體積。采用氣相色譜儀(Aglient-7890B)測(cè)定氣相產(chǎn)物(H2，CH4，CO2)含量，檢測(cè)條件如下：色譜儀安裝熱導(dǎo)池檢測(cè)器(TCD)，色譜柱為6英尺Porapak Q不銹鋼填充柱，高純N2為載氣(30 mL/min)，TCD檢測(cè)溫度為150 ℃，柱溫為50 ℃，手動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣量為400 μL，進(jìn)樣口溫度為150 ℃[27]。

1.5.2 液相代謝產(chǎn)物分析采用氣相色譜儀(Aglient-7820A) 測(cè)定液相代謝產(chǎn)物，檢測(cè)條件如下：色譜儀安裝氫火焰檢測(cè)器(FID)，F(xiàn)ID檢測(cè)溫度為280 ℃，色譜柱為HP-5毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，高純N2為載氣(30 mL/min)，升溫過程為35 ℃保持1 min，以5 ℃/min升至100 ℃并保持2 min；SHC-A型H2發(fā)生器的H2流量為40 mL/min；QLB-A型純凈空氣泵的空氣流量為400 mL/min；自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣量為0.5 μL，進(jìn)樣口溫度為220 ℃；分流比為10∶1。進(jìn)樣前，將發(fā)酵液抽濾后加入濃度為6 mol/L的HCl進(jìn)行酸化，再用高速離心機(jī)于8000 r/min條件下離心10 min，取1.5 mL上清液，用0.45 μm濾膜過濾后進(jìn)行測(cè)定[27]。

1.5.3 菌群結(jié)構(gòu)分析采用Illumina NovaSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)細(xì)菌16S rDNA V3-V4 區(qū)和古生菌16S rDNA進(jìn)行測(cè)序。細(xì)菌V3-V4區(qū)引物為：357F(5′-ACTCCTACGGRAGGCAGCAG-3′)，806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。古生菌引物為：Arch519F(5′-CAGCCGCCGCGGTAA-3′)，Arch915R(5′-GTGCTCCCCCGCCAATTCCT-3′)。對(duì)測(cè)定后的原始序列進(jìn)行質(zhì)控、拼接和序列優(yōu)化，優(yōu)化后的序列用Usearch軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行去嵌合體和聚類分析，以97%相似度為標(biāo)準(zhǔn)將序列聚類成為分類單元，將操作分類單元(Operational Taxonomic Unit, OTU)代表序列與Silva數(shù)據(jù)庫比對(duì)并進(jìn)行物種注釋，利用mothur(Version 1.33.3)進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)分析(包括Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)等物種多樣性分析)；選取不同的分類水平進(jìn)行群落組成的統(tǒng)計(jì)分析；利用R語言進(jìn)行韋恩(Venn)圖、群落結(jié)構(gòu)柱形圖等統(tǒng)計(jì)學(xué)和可視化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波輻射預(yù)處理對(duì)暗發(fā)酵產(chǎn)氣的影響分析

暗發(fā)酵制氫過程中累積產(chǎn)氣量變化曲線如圖1所示。由圖1可以看出，微波輻射預(yù)處理樣品在24 h左右累積產(chǎn)H2量達(dá)到最大值，為109.9 mL/g，對(duì)照組在28 h累積產(chǎn)H2量達(dá)到最大值，為85.9 mL/g，微波輻射預(yù)處理組累積產(chǎn)H2量較對(duì)照組提高了27.9%；無論對(duì)照組還是微波輻射預(yù)處理組，均在第8 h檢測(cè)到CO2的產(chǎn)生，但在暗發(fā)酵過程中，微波輻射預(yù)處理組的累計(jì)產(chǎn)CO2量始終大于對(duì)照組。在整個(gè)暗發(fā)酵過程中，無論是微波輻射預(yù)處理組還是對(duì)照組，均未檢測(cè)到CH4的產(chǎn)生。這可能是因?yàn)楫a(chǎn)甲烷菌的最佳生長pH值為6.5～8.2[28]，而本實(shí)驗(yàn)發(fā)酵初始pH值為6.5，酸化和產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸階段生成的揮發(fā)性有機(jī)酸會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵系統(tǒng)pH值大幅度下降[29]，當(dāng)pH值<6或pH值>8時(shí)，會(huì)對(duì)產(chǎn)甲烷菌的活性產(chǎn)生抑制，進(jìn)而影響CH4的生成[30]。

圖1 暗發(fā)酵制氫過程中累積產(chǎn)氣量變化曲線Fig.1 Change curve of cumulative gas production during dark fermentative hydrogen production

2.2 微波輻射預(yù)處理對(duì)液相代謝產(chǎn)物的影響分析

揮發(fā)性有機(jī)酸醇是暗發(fā)酵制氫過程中的主要副產(chǎn)物。液相代謝產(chǎn)物組成及其質(zhì)量濃度如圖2所示。由圖2可以看出，在發(fā)酵初期(0～4 h)，丙酸和乙酸均為微波輻射預(yù)處理組和對(duì)照組的主要液相代謝產(chǎn)物。在發(fā)酵中期(4～24 h)，液相代謝產(chǎn)物發(fā)生明顯變化，對(duì)照組丙酸含量大幅增加，乙酸含量相對(duì)減少；微波輻射預(yù)處理組丙酸含量明顯減小，丁酸含量明顯增加。發(fā)酵24 h時(shí)，微波輻射預(yù)處理組的丁酸累積含量達(dá)到最大值0.8 g/L，此時(shí)累積產(chǎn)H2量也達(dá)到最大值。暗發(fā)酵結(jié)束時(shí)，微波輻射預(yù)處理組的丁酸含量較對(duì)照組提高了24.1%。這與宋梓梅等[31]的研究結(jié)果一致，代謝產(chǎn)物中丁酸含量的增長有助于提高厭氧發(fā)酵的H2產(chǎn)量。

圖2 液相代謝產(chǎn)物組成及其質(zhì)量濃度Fig.2 Composition and mass concentration of liquid phase metabolites

2.3 微波輻射預(yù)處理對(duì)菌源菌群結(jié)構(gòu)的影響分析

2.3.1Alpha多樣性指數(shù)分析菌源菌群Alpha多樣性指數(shù)比較見表1。由表1可知，各組樣品的Coverage指數(shù)均>0.99，表明本次測(cè)序?qū)悠分械募?xì)菌和古生菌的覆蓋率較高，可滿足各組樣品中細(xì)菌和古生菌Alpha多樣性分析的需要。微波輻射預(yù)處理組中，細(xì)菌和古生菌的Chao1指數(shù)都低于對(duì)照組，表明經(jīng)微波輻射預(yù)處理后，菌源物種種類減少，豐度降低；古生菌的Chao1指數(shù)遠(yuǎn)低于細(xì)菌，也表明菌源中古生菌的豐度遠(yuǎn)低于細(xì)菌。另外，與對(duì)照組相比，微波輻射預(yù)處理組中細(xì)菌和古生菌的Shannon指數(shù)較小，而Simpson指數(shù)較大，表明經(jīng)微波輻射預(yù)處理后，細(xì)菌和古生菌的多樣性降低。

表1 菌源菌群Alpha多樣性指數(shù)比較Table 1 Comparison of Alpha diversity index of bacteria

2.3.2Veen圖分析Venn圖可用于統(tǒng)計(jì)多個(gè)樣本所共有和獨(dú)有的OTU數(shù)目，能直觀反映樣本的物種數(shù)目組成相似性及重疊情況[32]。細(xì)菌和古生菌基于OTU水平的群落Veen圖如圖3所示。由圖3可以看出，細(xì)菌群落共有的OTU數(shù)目為916個(gè)，分別占對(duì)照組和微波輻射預(yù)處理組樣本OTU總數(shù)的92.9%和93.1%；古生菌群落共有的OTU數(shù)目為52個(gè)，分別占對(duì)照組和微波輻射預(yù)處理組樣本OTU總數(shù)的70.3%和81.3%。這表明，經(jīng)微波輻射預(yù)處理后，菌源樣本的細(xì)菌群落相對(duì)較穩(wěn)定，豐度有一定程度降低，而古生菌群落豐度下降較大。

圖3 細(xì)菌和古生菌基于OTU水平的群落Veen圖Fig.3 Community Venn diagram of bacteria and archaea based on OTU level

2.3.3 群落結(jié)構(gòu)分析1)細(xì)菌門和屬的變化分析。16S rRNA基因高通量測(cè)序及分析表明，細(xì)菌群落共發(fā)現(xiàn)29個(gè)門，176個(gè)屬。細(xì)菌群落在門水平上的相對(duì)豐度如圖4a)所示。由圖4a)可以看出，對(duì)照組中，相對(duì)豐度相對(duì)較高的細(xì)菌依次為變形菌門(Proteobacteria，44.9%)、綠彎菌門(Chloroflexi，14.43%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，11.5%)、放線菌門(Actinobacteria，6.51%)和厚壁菌門(Firmicutes，2.89%)；微波輻射預(yù)處理組中，相對(duì)豐度相對(duì)較高的細(xì)菌依次為變形菌門(46.5%)、綠彎菌門(14.42%)、放線菌門(7.7%)、擬桿菌門(6.11%)和厚壁菌門(4.7%)。這表明，經(jīng)微波輻射預(yù)處理后，菌源中的變形菌門、放線菌門和厚壁菌門的相對(duì)豐度均升高，而擬桿菌門的相對(duì)豐度降低。

細(xì)菌群落在屬水平上的相對(duì)豐度如圖4b)所示。由圖4b)可以看出，檢測(cè)到的主要細(xì)菌屬為特呂珀菌屬(Truepera)、Bauldia、膨脹芽孢桿菌屬(Tumebacillus)、假洪吉氏菌屬(Pseudohongiella)和芽孢桿菌屬(Bacillus)。微波輻射預(yù)處理后，能有效降解有機(jī)物的特呂珀菌屬[33]和膨脹芽孢桿菌屬[34-35]細(xì)菌的相對(duì)豐度均升高。值得注意的是，與對(duì)照組相比，經(jīng)微波輻射預(yù)處理后，菌源中芽孢桿菌屬的相對(duì)豐度增加，表明微波輻射預(yù)處理能夠有效抑制或殺滅不產(chǎn)芽孢的細(xì)菌。芽孢桿菌是主要的厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫菌[8]，其相對(duì)豐度的增加有利于發(fā)酵系統(tǒng)產(chǎn)H2量的增加。

圖4 細(xì)菌群落在門水平和屬水平上的相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundance of bacterial community at level of phylum and genus

2)古生菌門和屬的變化分析。古生菌群落在門水平上的相對(duì)豐度如圖5a)所示。由圖5a)可以看出，對(duì)照組中，廣古生菌門(Euryarchaeota)的相對(duì)豐度較高，為51.68%；奇古生菌門(Thaumarchaeota) 相對(duì)豐度為48.32%。廣古生菌門是耗氫產(chǎn)甲烷菌的主要來源[36]。經(jīng)微波輻射預(yù)處理后，廣古生菌門相對(duì)豐度減少至31.65%，而奇古生菌門相對(duì)豐度增長至68.35%，表明經(jīng)微波輻射預(yù)處理后，菌源中的產(chǎn)甲烷菌數(shù)量減少。

古生菌群落在屬水平上的相對(duì)豐度如圖5b)所示。由圖5b)可以看出，未確定分類地位的古生菌相對(duì)豐度較高(91%左右)。屬水平上，主要的優(yōu)勢(shì)古生菌為甲烷短桿菌屬(Methanobrevibater)、甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina)、第七產(chǎn)甲烷古菌屬(Methanomassiliicoccus)、甲烷球形菌屬(Methano-sphaera)和甲烷囊菌屬(Methanoculleus)，此外還有少量的產(chǎn)甲烷桿菌屬(Methanobacterium)和鬃毛甲烷菌屬(Methanosaeta)古生菌。產(chǎn)甲烷桿菌屬和甲烷短桿菌屬都屬于氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌，均能夠以H2作為電子供體，通過電子傳遞，還原CO2生成CH4[37-38]；甲烷球形菌屬同樣可以利用H2作為電子供體，還原甲醇生成CH4，但必須以乙酸作為生長因子[39]；鬃毛甲烷菌屬以H2、甲酸鹽、二元醇和CO作為電子供體，還原CO2生成CH4[40]；第七產(chǎn)甲烷古菌屬屬于甲基營養(yǎng)型和氫營養(yǎng)型的混合型[41]；甲烷八疊球菌屬在厭氧消化過程中以乙酸作為代謝底物[42]，同時(shí)還能以甲醇、甲胺、H2/CO2為代謝基質(zhì)[43]。經(jīng)微波輻射預(yù)處理后，甲烷八疊球菌屬、第七產(chǎn)甲烷古菌屬、甲烷球形菌屬的相對(duì)豐度均減小，甲烷短桿菌屬的相對(duì)豐度略有升高。這可能是因?yàn)楫a(chǎn)甲烷桿菌屬和鬃毛甲烷菌屬的相對(duì)豐度減小，造成甲烷短桿菌屬的相對(duì)豐度略有升高。上述分析表明，微波輻射預(yù)處理后，產(chǎn)甲烷菌相對(duì)豐度的減小降低了暗發(fā)酵制氫過程中的耗氫作用，使系統(tǒng)的產(chǎn)H2性能得以提高。

圖5 古生菌群落在門水平和屬水平上的相對(duì)豐度Fig.5 Relative abundance of archaea community at level of phylum and genus

3 結(jié)論

本文研究了微波輻射預(yù)處理牛糞堆肥菌源微生物群落結(jié)構(gòu)變化對(duì)暗發(fā)酵制氫性能的影響。結(jié)果表明，經(jīng)微波輻射預(yù)處理后，菌源暗發(fā)酵的最大累積產(chǎn)H2量達(dá)109.9 mL/g，比對(duì)照組提高了27.9%；高通量測(cè)序顯示，微波輻射預(yù)處理導(dǎo)致菌源微生物數(shù)量減少，而主要的厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫菌芽孢桿菌屬的相對(duì)豐度比對(duì)照組有所升高，產(chǎn)甲烷桿菌屬等產(chǎn)甲烷耗氫菌的相對(duì)豐度降低。微波輻射能夠損傷微生物基因組DNA，抑制或殺滅敏感的耗氫菌。主要的產(chǎn)氫微生物芽孢桿菌則具有極強(qiáng)的耐輻射和耐熱能力，短時(shí)間微波輻射處理不會(huì)對(duì)其造成損傷，因而微波輻射預(yù)處理后系統(tǒng)的產(chǎn)H2能力得以提高?？梢姡捎梦⒉ㄝ椛漕A(yù)處理產(chǎn)氫菌源，能夠抑制產(chǎn)甲烷耗氫菌的活性，同時(shí)保留產(chǎn)氫微生物芽孢桿菌的活性，是有效提高暗發(fā)酵制氫產(chǎn)H2量的方法之一。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步探究微生物種群之間的互作關(guān)系，解析微生物代謝途徑與產(chǎn)H2量之間的關(guān)聯(lián)性，以期為暗發(fā)酵制氫提供更好的技術(shù)調(diào)控策略。