程思雅 王東興 李濤 李彥明 程冠昌? 翁曉菲 汪萍萍

1 河南大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,河南 開封 475000;2湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院,長沙 410013;3河南大學(xué)淮河醫(yī)院 心內(nèi)科,河南 開封475000

通過干細(xì)胞移植以修復(fù)損傷的心肌細(xì)胞,是心梗治療的前沿?zé)狳c。但是,目前對于干細(xì)胞心肌分化的機(jī)制所知有限,各種誘導(dǎo)策略并不能完全消除誘導(dǎo)效率較低、細(xì)胞分化混雜等問題,嚴(yán)重影響誘導(dǎo)分化效率和分化細(xì)胞均一度。

在心肌分化的進(jìn)程中,有多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的參與,包括骨形成蛋白(BMP)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、成纖維生長因子(FGF)、Wnt、Notch 和Hedgehog等。通過調(diào)制這些信號通路,可引導(dǎo)細(xì)胞定向分化為成熟的心肌細(xì)胞。文獻(xiàn)報道體外誘導(dǎo)過程中可以通過BMP2、BMP4、Activin A、b FGF、FGF10、Wnt3a等分子的單一或聯(lián)合應(yīng)用,提高多能干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的效率[1]。這些方法的局限性是誘導(dǎo)劑價格昂貴,不利于大規(guī)模使用。相對而言,小分子誘導(dǎo)劑價格便宜,同時能有效影響特定的信號通路,提高心肌分化效率,具有較好的發(fā)展前途。維生素C被發(fā)現(xiàn)通過激活MEK-ERK1/2信號通路促進(jìn)膠原合成,進(jìn)而促進(jìn)心肌前體細(xì)胞的生成,有利于心肌分化[2]。誘導(dǎo)早期加入GSK3β抑制劑(BIO、LiCl等)、CK1激酶抑制劑CHIR99021,通過抑制GSK3β、CK1 以達(dá)到活化β-catenin介導(dǎo)的經(jīng)典Wnt通路的作用,可以促進(jìn)心肌分化[3-5]。心肌分化晚期抑制Wnt信號,使用KY02111 等新型Wnt抑制劑可提高分化心肌細(xì)胞的成熟度[6]。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

P19CL6小鼠畸胎瘤干細(xì)胞由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部周春燕教授惠贈。DMSO、雷帕霉素和 Hoechst33342購自Sigma公司,MC1568購自Selleck公司。心肌肌鈣蛋白-T(troponin-T)抗體購自Abcam公司,抗α-actinin抗體購自Sigma公司,抗Mef2c抗體購自Santa Cluz公司,抗Gapdh 抗體、辣根過氧化酶及FITC標(biāo)記的二抗均購自Abclonal公司。RNAVzol試劑盒購自北京威格拉斯公司,PCR 引物由上海生工生物公司合成。

1.2 P19CL6細(xì)胞的培養(yǎng)及貼壁誘導(dǎo)分化

液氮凍存的P19CL6 細(xì)胞解凍后常規(guī)培養(yǎng)傳代,培養(yǎng)于α-MEM+10%(v/v)胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)+100 U/mL 青霉素和100μg/mL 鏈霉素(雙抗)。將P19CL6細(xì)胞進(jìn)行消化、計數(shù),按3.7×105細(xì)胞密度用含1%(v/v)DMSO(細(xì)胞培養(yǎng)級)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基接種于60 mm 的細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)。待細(xì)胞貼壁后,每隔2天換液1次。誘導(dǎo)當(dāng)天記為第0天(day 0)。貼壁誘導(dǎo)8 d后撤除DMSO,繼續(xù)培養(yǎng),隔天換液。

1.3 Real-time PCR

RNAVzol提取RNA 方法參照產(chǎn)品說明。Real-time PCR 采用TOYOBO 公司的SYBR Green Real-time PCR Master Mix 在ABI7700型定量PCR儀上進(jìn)行。

1)反應(yīng)體系。7.5μL 2×SYBR Green Master Mix buffer,0.25 μL forward primer(10 pmol/μL),0.25μL reverse primer(10 pmol/μL),1μL c DNA 模板,滅菌去離子水補(bǔ)足至15μL。

2)PCR 反應(yīng)條件。95 ℃變性10 min,95 ℃15 s,60℃1 min,40個循環(huán)。測定樣品的Ct值(Cycle threshold,循環(huán)閾值)通過計算2-△△Ct來比較不同樣品之間特定基因的表達(dá)差異。

3)PCR 引物。18S基因forward primer 5′-GT A A CCCGTTGAACCCCAATT-3′,reverse primer 5′-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3′;Mef2c基因forward primer 5′-CTGAGCGTGCTGTGCGA CT GT-3′,reverse primer 5′-GCTCTCGTGCGGCTC GTTGTA-3′;Isl1基因forward primer 5′-CTGCT TTTCAGCAACTGGTCA-3′,reverse primer 5′-T AGG ACTGGCTACCATGCTGT-3′;β-Mhc 基 因forward primer 5′-ACAACCC CTACGATTAT GC GT-3′;reverse primer 5′-ACGTCAAAGGCA CTA TCCGTG-3′。

1.4 免疫熒光

分化后的細(xì)胞團(tuán)加入胰酶消化,細(xì)胞滴于6孔板內(nèi)的蓋玻片上,待其貼壁2 h后,4%(v/v)多聚甲醛于室溫固定切片15 min;0.5%(v/v)的Triton X-100/PBS(PBST)膜打孔10 min;2% BSA 37 ℃孵育30 min,以封閉非特異性結(jié)合位點;2% (v/v)BSA 稀釋的抗α-actinin抗體或抗Mef2c抗體,4 ℃孵育過夜;PBST 漂洗3遍后加入TRITC標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗,濕盒內(nèi)避光孵育30 min;PBST 充分漂洗后,1μg/mL Hoechst33342 核復(fù)染色5 min,漂洗后,緩沖甘油封片(PBS、甘油體積比=1∶9),置熒光顯微鏡(Fluoview300,Olympus)下觀察。

1.5 蛋白印跡

將細(xì)胞用冰預(yù)冷的PBS洗兩遍,將細(xì)胞刮下收集到Eppendorf管中,5 000 r/min離心5 min,沉淀細(xì)胞,加入預(yù)冷的裂解緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl,p H=8.0,150 mmol/L NaCl,0.1%(v/v)SDS,1% (v/v)NP-40,0.5%(v/v)脫氧膽酸鈉),將細(xì)胞重懸,冰上孵育30 min后,12 000 r/min離心15 min,上清即為全細(xì)胞裂解液。BCA 法蛋白定量。30μg蛋白煮沸后,10%(v/v)SDS-PAGE 電泳轉(zhuǎn)膜,5%(v/v)脫脂奶粉封閉1 h后加入一抗雜交,辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗孵育后化學(xué)發(fā)光法顯色。

1.6 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)以表示,采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行t檢驗和單因素方差分析。P＜0.05代表差異具備顯著性,標(biāo)志為*;P＜0.01代表差異具備非常顯著性,標(biāo)志為**。

2 結(jié)果

2.1 雷帕霉素促進(jìn)心肌分化

參照文獻(xiàn),用1%(v/v)的DMSO 誘導(dǎo)小鼠P19CL6畸胎瘤細(xì)胞向心肌分化。細(xì)胞匯合后以集落的方式生長,形成的“擬胚體”樣結(jié)構(gòu),即發(fā)生三胚層分化[7]。通常在前4天誘導(dǎo)心肌分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá),而后誘導(dǎo)心肌分化成熟基因表達(dá)。在誘導(dǎo)后的第8～10天,在細(xì)胞復(fù)層生長區(qū)域開始零星出現(xiàn)跳動的細(xì)胞群。隨著繼續(xù)培養(yǎng),自發(fā)搏動的細(xì)胞團(tuán)數(shù)目逐步增加。參考文獻(xiàn)[8],我們采用20 nmol/L雷帕霉素(Rapa)與DMSO 聯(lián)合誘導(dǎo),在誘導(dǎo)第1～8天持續(xù)處理細(xì)胞,見圖1A。在誘導(dǎo)分化第12天,統(tǒng)計產(chǎn)生自發(fā)搏動的擬胚體數(shù)量。如圖1B 所示,雷帕霉素組顯著增強(qiáng)了產(chǎn)生自發(fā)搏動的擬胚體數(shù)量。Western blot檢測心肌細(xì)胞分化標(biāo)志物心肌肌鈣蛋白-T(troponin-T)在誘導(dǎo)至第12天的表達(dá)量,亦可見雷帕霉素的促進(jìn)作用,見圖1C。α-輔肌動蛋白(α-actinin)免疫熒光染色同樣顯示,雷帕霉素處理能增強(qiáng)成熟心肌細(xì)胞的產(chǎn)生,見圖1D。以上研究表明,雷帕霉素能夠促進(jìn)心肌分化。

圖1 雷帕霉素促進(jìn)心肌分化

2.2 羥氯喹抑制心肌分化

由于雷帕霉素抑制m TOR 通路,從而促進(jìn)細(xì)胞自噬。為了進(jìn)一步闡釋自噬和心肌分化的關(guān)系,我們采用自噬抑制劑羥氯喹(HCQ)處理心肌誘導(dǎo)分化過程中的P19CL6細(xì)胞。2μmol/L 羥氯喹對細(xì)胞增殖和凋亡的影響相對較小,但嚴(yán)重影響了心肌分化效率,自發(fā)搏動的擬胚體數(shù)目顯著降低,見圖2A。Western blot同樣表明羥氯喹處理抑制了心肌分化標(biāo)志物心肌肌鈣蛋白-T 的表達(dá),見圖2B。這些證據(jù)表明,抑制自噬會導(dǎo)致心肌分化受阻,進(jìn)一步驗證了自噬和心肌分化有重要的關(guān)聯(lián)。

圖2 HCQ 抑制心肌分化

2.3 雷帕霉素促進(jìn)Mef2c表達(dá)

為進(jìn)一步闡釋雷帕霉素的效應(yīng)機(jī)制,我們通過real-time PCR 檢測了雷帕霉素對心肌分化轉(zhuǎn)錄因子Mef2c表達(dá)的影響。Mef2c是重要的心肌分化轉(zhuǎn)錄因子,與Gata4、Nkx2.5 等轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同促進(jìn)心肌前體細(xì)胞向成熟心肌的轉(zhuǎn)化。如圖3A 所示,在誘導(dǎo)分化第4、8、12 天,雷帕霉素處理組的Mef2c表達(dá)顯著高于對照組。免疫熒光實驗同樣證實雷帕霉素處理增強(qiáng)了Mef2c的表達(dá),見圖3B。因此,我們的研究表明,雷帕霉素促進(jìn)心肌分化早期關(guān)鍵基因Mef2c的表達(dá)。

圖3 雷帕霉素增強(qiáng)Mef2c的表達(dá)

2.4 MC1568取消雷帕霉素的促進(jìn)效應(yīng)

MC1568是組蛋白去乙?；?Hdac)Ⅱa類家族抑制劑,通過穩(wěn)定Mef2-Hdac4-Hadc3相互作用,使得Mef2家族轉(zhuǎn)錄因子處于沉默狀態(tài),發(fā)揮抑制Mef2家族轉(zhuǎn)錄因子活性的作用。本項研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)雷帕霉素與2μmol/L MC1568 共同處理P19CL6細(xì)胞時,可抑制分化早期(第4天)標(biāo)志物Isl1的表達(dá);在分化晚期(第8 天),可發(fā)現(xiàn)β肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain,β-Mhc)表達(dá)顯著受到抑制,見圖4A、B。在分化第12天,MC1568聯(lián)合處理組比雷帕霉素單獨處理組,自發(fā)搏動的擬胚體數(shù)量大幅減少,見圖4C。Western blot同樣表明,MC1568處理抑制了心肌肌鈣蛋白-T 的表達(dá),見圖4D。這些結(jié)果顯示:Mef2c的表達(dá)和活化是心肌分化所必需的,雷帕霉素誘導(dǎo)Mef2c 來增強(qiáng)心肌分化;MC1568可能通過抑制Mef2c,從而拮抗雷帕霉素增強(qiáng)的心肌分化。

圖4 MC1568取消雷帕霉素的促進(jìn)效應(yīng)

3 討論

自噬是真核生物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)化保守、廣泛存在的一種應(yīng)激保護(hù)機(jī)制。自噬主要指細(xì)胞經(jīng)溶酶體對細(xì)胞器、長壽命蛋白質(zhì)進(jìn)行降解,為細(xì)胞應(yīng)激、修復(fù)再生提供基本原材料,從而實現(xiàn)氨基酸和能量物質(zhì)的再循環(huán)利用。自噬有助于清除、降解細(xì)胞內(nèi)受損的或衰老的細(xì)胞器和冗余的大分子,發(fā)揮保護(hù)性作用。在缺血缺氧、營養(yǎng)缺失、氧化應(yīng)激或感染等不良因素刺激下,細(xì)胞可啟動自噬來維護(hù)自身能量和代謝穩(wěn)態(tài),但是過度的激活自噬可導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。

m TOR 通路是調(diào)節(jié)自噬的重要機(jī)制。m TOR是一個絲蘇氨酸蛋白激酶,m TOR 分子可以形成兩個復(fù)合物——m TORC1 和m TORC2,這兩個復(fù)合物分別調(diào)控不同的生物學(xué)事件,擁有不同的作用底物。m TORC1主要調(diào)控蛋白質(zhì)和核糖體的生物合成、營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和細(xì)胞自噬等過程。m TORC2調(diào)控肌動蛋白細(xì)胞骨架的排列、細(xì)胞的存活、脂質(zhì)的合成等過程。二者對雷帕霉素有著不同的敏感性,雷帕霉素抑制mTORC1 的激酶活性,然而m TORC2則對雷帕霉素不敏感。雷帕霉素是一種大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑,可以抑制m TOR 信號通路的m TORC1,從而激活自噬。

除參與應(yīng)激反應(yīng)外,自噬與細(xì)胞的生長、發(fā)育及衰老關(guān)系密切。多個研究發(fā)現(xiàn),自噬參與脂肪、血管、造血和神經(jīng)分化[9-10]。已有的研究發(fā)現(xiàn),m TOR通路促進(jìn)胚胎干細(xì)胞自我更新,抑制向中胚層和內(nèi)胚層分化。Oct4、Sox2 和Nanog是調(diào)控干細(xì)胞自我更新和未分化狀態(tài)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,自噬參與這些重要分子的降解。因而,通過小分子化合物雷帕霉素或RNAi技術(shù)抑制m TOR,能促進(jìn)Oct4、Sox2和Nanog含量降低,抑制干細(xì)胞自我更新,促進(jìn)早期分化[11]。

在心臟發(fā)育的過程中,敲除自噬相關(guān)基因,會導(dǎo)致心臟發(fā)育障礙、異常環(huán)化、異常心室形態(tài)、瓣膜結(jié)構(gòu)異常等,導(dǎo)致胚胎停育死亡[12]。多個研究顯示,自噬與干細(xì)胞心肌分化相關(guān)。有研究顯示,抑制m TORC1促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向心肌分化,m TORC2與之相反,當(dāng)m TORC2活化時促進(jìn)心肌方向的分化[13-14]。也有研究顯示,自噬通過P53通路減少細(xì)胞分化過程中的凋亡,從而促進(jìn)心肌分化[15]。自噬也能促進(jìn)干性基因Nanog從細(xì)胞中清除,從而有利于心肌分化[16]。也有研究顯示,自噬促進(jìn)β-catenin降解,從而抑制經(jīng)典Wnt通路,促進(jìn)晚期心肌分化[7]。

既往的研究發(fā)現(xiàn)雷帕霉素能促進(jìn)心肌分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Gata4表達(dá)[8]。在本項研究中我們發(fā)現(xiàn),雷帕霉素處理促進(jìn)了另一個心肌分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Mef2c的表達(dá)。Mef2c屬于肌肉增強(qiáng)因子2(Mef2)家族,是Olson等在1993 年從成鼠心cDNA 文庫中分離到的[17]。在轉(zhuǎn)基因小鼠中刪除Mef2c負(fù)責(zé)蛋白互作或DNA 結(jié)合的結(jié)構(gòu)域,會導(dǎo)致心臟發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)缺陷,例如心房收縮減弱、心室小梁柱缺乏、心室發(fā)育不良、心管不能形成右循環(huán)。與此同時,心臟分化的幾種標(biāo)志基因表達(dá)下調(diào)或不能表達(dá)。因此,Mef2 對于心肌發(fā)生和形態(tài)學(xué)形成是必要的[18]。

Mef2c與Gata4、Nkx2.5等心肌分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同調(diào)控下游基因表達(dá)。Mef2c也受到乙?；{(diào)控。MEF2C 在非激活態(tài)時,與核內(nèi)的Ⅱ型Hadc4/5/7/9結(jié)合導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄沉默。當(dāng)calcineurin、Ca MK、PKD 活化后,導(dǎo)致Hdac4/5/7/9 磷酸化后與14-3-3結(jié)合,轉(zhuǎn)移出核經(jīng)泛素化降解;Mef2c得以與P300結(jié)合,得以乙酰化修飾活化,繼而激活下游基因。MC1568 是Ⅱ型選擇性組蛋白去乙?；?Ⅱa)抑制劑,但是它可以穩(wěn)定Hdac4與Mef2家族轉(zhuǎn)錄因子的相互作用,從而使得Mef2家族轉(zhuǎn)錄因子始終處于抑制狀態(tài),因此也可以被視為Mef2家族轉(zhuǎn)錄因子的功能抑制劑[19]。在本項研究中,我們發(fā)現(xiàn)雷帕霉素促進(jìn)Mef2c表達(dá)。而MC1568 則能抑制雷帕霉素誘導(dǎo)的心肌早期和晚期分化標(biāo)志基因表達(dá)。這一結(jié)果顯示,雷帕霉素誘導(dǎo)的Mef2c表達(dá)是增強(qiáng)心肌分化能力所必需的。

總的來說,本研究發(fā)現(xiàn)通過雷帕霉素誘導(dǎo)自噬可以促進(jìn)心肌分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Mef2c 表達(dá),Mef2c的活化狀態(tài)對于心肌分化效率非常重要。