晏 培，譚 壹，李登勇，邵家艷，劉中利，李 驥，李雪熒

（重慶江記酒莊有限公司，重慶江津 402289）

小曲清香型白酒是我國(guó)白酒釀酒歷史上最古老的酒種之一，其以糧谷為主要原料，小曲為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)蒸煮攤晾、培菌糖化、續(xù)糟發(fā)酵、蒸餾、陳釀、勾兌而成，出酒率高，發(fā)酵周期短，以乙酸乙酯為主體香，其風(fēng)味特點(diǎn)是“清香純正、自然協(xié)調(diào)、醇甜柔和、后味爽凈”。

目前，傳統(tǒng)白酒釀造大多為手工釀造，過程中存在設(shè)備落后、勞動(dòng)強(qiáng)度大、生產(chǎn)效率低、工藝控制粗放等問題。隨著技術(shù)的創(chuàng)新和發(fā)展，釀酒行業(yè)開始采用機(jī)械化、自動(dòng)化、智能化和信息化等手段不斷地促使傳統(tǒng)白酒釀造模式升級(jí)。機(jī)械化釀酒雖然工藝流程與傳統(tǒng)工藝相似，但因其獨(dú)特的釀造設(shè)備和環(huán)境，導(dǎo)致生產(chǎn)的基酒與傳統(tǒng)工藝相比，在風(fēng)味組成上有較明顯差異。解析手工和機(jī)械化釀造基酒差異的形成原因，將有助于機(jī)械化釀造的穩(wěn)定優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)。

微生物作為白酒發(fā)酵的核心，其群落結(jié)構(gòu)的改變會(huì)驅(qū)動(dòng)風(fēng)味物質(zhì)組成發(fā)生變化。微生物生長(zhǎng)代謝引起酒醅理化指標(biāo)呈現(xiàn)一定規(guī)律的變化，同時(shí)酒醅成分改變反促微生物群落結(jié)構(gòu)及生存環(huán)境的相應(yīng)改變，使優(yōu)勢(shì)菌群逐漸呈現(xiàn)穩(wěn)定狀態(tài)，進(jìn)而影響酒醅中風(fēng)味物質(zhì)的代謝和積累。因此，揭示小曲清香型白酒手工與機(jī)械化釀造過程中，酒醅理化指標(biāo)和微生物的變化規(guī)律及其差異，有助于進(jìn)一步了解小曲清香型白酒發(fā)酵過程中微生物變化及風(fēng)味產(chǎn)生機(jī)理。

本試驗(yàn)以小曲清香型白酒手工和機(jī)械化釀造車間酒醅為研究對(duì)象，基于高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析不同發(fā)酵時(shí)期酒醅發(fā)酵過程中微生物動(dòng)態(tài)變化，并結(jié)合酒醅理化參數(shù)的變化，揭示小曲清香白酒手工和機(jī)械化釀造過程中微生物及環(huán)境因子的變化規(guī)律，以及對(duì)酒體風(fēng)味變化的影響，以期指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)，為機(jī)械化工藝改進(jìn)和酒質(zhì)的不斷提升提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒醅：取自重慶江記酒莊有限公司手工和自動(dòng)化釀酒車間。

耗材及試劑：細(xì)菌、真菌培養(yǎng)基購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司。菌株DNA 提取、16S rDNA 片段和真菌ITS 擴(kuò)增所用的酶、Marker、dNTPs、Buffer 等購(gòu)于生工生物上海股份有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

儀器設(shè)備：Illumina Miseq PE300 高通量測(cè)序平臺(tái)；Vortex振蕩器，德國(guó)IKA公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 取樣方法

小曲清香型白酒生產(chǎn)分為培菌和窖內(nèi)發(fā)酵兩個(gè)階段；培菌1 d，手工車間窖內(nèi)發(fā)酵10 d，自動(dòng)化車間窖內(nèi)發(fā)酵20 d。手工車間選取培菌前、培菌后、發(fā)酵2 d、4 d、6 d、出窖樣品，自動(dòng)化車間選取培菌前、培菌后、發(fā)酵2 d、4 d、6 d、10 d、15 d、出窖樣品。根據(jù)等距采樣法，分別在酒窖上、中、下層等距采集3 個(gè)位點(diǎn)的樣本。樣本采集后混合均勻，并分裝于無菌袋封裝標(biāo)記，于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.2 高通量測(cè)序分析方法

酒醅基因組DNA 直接從樣本中提取，利用Illumina Miseq PE300 高通量測(cè)序平臺(tái)測(cè)序。細(xì)菌的16S rRNA V3—V4 擴(kuò) 增 引 物 為 338F（5-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACNNGGG TATCTAAT-3'），真菌擴(kuò)增引物為ITS3（5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）。PCR反應(yīng)體系：12.5 μL 2 × Taq PCR MasterMix，3 μL BSA(2 ng/μL)，2 Primer(5 μM)，2 μL 模板DNA，和5.5 μL ddHO。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性45 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸45 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min終止。擴(kuò)增序列通過Illumina MiSeq 平臺(tái)進(jìn)行Paired-end 測(cè)序，下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過QIIME（v1.8.0）軟件過濾、拼接、去除嵌合體，去除得分低于20 分、堿基模糊、引物錯(cuò)配及測(cè)序長(zhǎng)度小于150 bp的序列。

經(jīng)過上述步驟后，將標(biāo)簽分組具有97 %序列相似性的高質(zhì)量OTU 序列，細(xì)菌得到的每個(gè)OTU 代表序列比對(duì)silva 數(shù)據(jù)庫和NT 數(shù)據(jù)庫，真菌得到的OTU 代表序列比對(duì)UNITE 數(shù)據(jù)庫和NT 數(shù)據(jù)。最后再通過人工進(jìn)行檢查以獲得物種信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 手工和機(jī)械化釀造基酒的理化及風(fēng)味成分分析

對(duì)手工和機(jī)械化釀造基酒的理化和主要風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果見表1。

表1 手工和機(jī)械化釀造基酒的理化及風(fēng)味成分對(duì)比

由表1 可知，在基酒理化指標(biāo)方面，機(jī)械化釀造基酒的總酸和總酯均高于手工，但差異不明顯。在基酒主要風(fēng)味成分方面，機(jī)械化釀造基酒的乙縮醛含量顯著高于手工，其余指標(biāo)差異不顯著。

2.2 手工和機(jī)械化釀造過程中酒醅理化指標(biāo)的變化分析

對(duì)手工和機(jī)械化釀造過程酒醅的理化指標(biāo)進(jìn)行對(duì)比分析。由圖1 可知，機(jī)械化釀造出窖酒醅總酸高于手工釀造，酒醅還原糖和淀粉含量的變化趨勢(shì)相似。從培菌至發(fā)酵結(jié)束，酒醅總酸含量持續(xù)增加，而淀粉含量持續(xù)降低，前4 天變化幅度最大，說明小曲清香白酒發(fā)酵過程微生物的代謝旺盛期為前期。隨著微生物的代謝，酒精含量和酸類物質(zhì)積累、淀粉的消耗會(huì)抑制微生物的代謝活動(dòng)。小曲清香白酒采用雙邊發(fā)酵工藝，入窖之前的培菌過程中已經(jīng)積累了大量糖化酶，此時(shí)酵母菌處于大量繁殖的階段，利用還原糖發(fā)酵成乙醇的能力還不夠，所以發(fā)酵前期還原糖含量略有上升，后期酵母菌大量利用還原糖產(chǎn)生乙醇，還原糖含量降低。

圖1 手工和機(jī)械化釀造過程中酒醅理化指標(biāo)的變化分析

2.3 手工和機(jī)械化釀造過程中微生物群落多樣性結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 細(xì)菌分類

對(duì)機(jī)械化、手工釀造發(fā)酵過程中酒醅樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在屬分類水平上的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比（相對(duì)豐度＜0.1%及未鑒定出的種類歸入“其他”），結(jié)果見表2。

表2 手工、機(jī)械化發(fā)酵過程中酒醅主要細(xì)菌群類占比

對(duì)酒醅樣品中細(xì)菌群落的高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，手工、機(jī)械化釀造分別檢測(cè)到110 個(gè)、114 個(gè)細(xì)菌屬。手工釀造過程中（42.72 %）、（16.68 %）、（13.07%）、（3.86%）、（2.56%）、（2.07%）、（2.04 %）、（2.02 %）、（1.24 %）是主要細(xì)菌種類。機(jī)械化釀造過程中的主要微生物菌群種類相似，但是相對(duì)含量卻有明顯區(qū)別，相對(duì)含量最高的仍然是（42.72 %），但、、、分別從手工釀造的2.02 %、0.18 %、1.24 %及2.07 %提高到11.88 %、6.15 %、5.11 %及4.63 %；（9.89 %）、（6.69 %）的相對(duì)含量與手工釀造差異較小。

2.3.2 真菌分類

手工、機(jī)械化釀造分別檢測(cè)到74 個(gè)、82 個(gè)真菌屬（表3）。（40.27 %）、（11.25 %）、（10.05 %）、（7.96 % ）、（5.62 % ）、（4.95 %）、（4.90 %）、（4.28 % ）、（3.18 % ）、（2.25 % ）、（1.63 % ）、（1.01 %）為手工釀造主要真菌屬；與手工釀造對(duì)比，機(jī)器化釀造過程中真菌優(yōu)勢(shì)菌群種類更加集中，僅（35.47 % ）、（28.37 %）、（18.93 %）、（9.08%）、（4.36%）5 個(gè)屬的真菌的相對(duì)豐度達(dá)到91 %以上，其他真菌微生物與手工釀造相比，相對(duì)含量明顯減少。

表3 手工、機(jī)械化發(fā)酵過程中酒醅主要真菌群類占比

2.4 細(xì)菌、真菌的演替規(guī)律

2.4.1 手工和機(jī)械化釀造過程中細(xì)菌群落的演替規(guī)律分析

如圖2、圖3 所示，蒸煮攤晾、接種小曲后，兩種工藝微生物菌群種類相似，但相對(duì)含量差異較大。手 工 釀 造 時(shí)，（18.01 %）、（13.88 %）、（11.35 %）為優(yōu)勢(shì)菌，同時(shí)還有其他細(xì)菌種屬，如（7.79 %）、（7.58 %）、（6.45%）、（6.07%）等；而機(jī)械化釀造時(shí)，（19.12 %）替代成為最主要的微生物，此外，與手工釀造相比，的相對(duì)含量顯著上升，達(dá)到8.58%。

圖2 手工釀造過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化

圖3 機(jī)械化釀造過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化

經(jīng)過22 h 的培菌，手工釀造醅中和為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌，含量分別達(dá)到41.77 %和37.11 %。機(jī)器化釀造醅中（40.43 %）同樣也是絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌，但的相對(duì)含量顯著降低，僅為12.13%，和也成為主要的優(yōu)勢(shì)菌群，含量分別達(dá)到11.06%和8.58%，且為機(jī)械化釀造時(shí)特有菌屬。

窖內(nèi)發(fā)酵階段，微生物群落結(jié)構(gòu)主體演變規(guī)律相似，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，乳酸菌的大量繁殖及釀酒酵母的產(chǎn)酒導(dǎo)致酒醅變成高酸、高酒的環(huán)境，導(dǎo)致發(fā)酵結(jié)束后形成以（＞96%）為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群的群落結(jié)構(gòu)。同時(shí)，兩種釀造工藝群落結(jié)構(gòu)演變的速度及種類有明顯的差異，對(duì)于手工釀造，其群落演變速度較快，在發(fā)酵2～4 d 時(shí)就開始對(duì)數(shù)增殖，第4 天時(shí)，其相對(duì)含量達(dá)到53.63%，發(fā)酵第10天時(shí)成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群；其他優(yōu)勢(shì)微生物菌群種類單一，僅和具有較高的相對(duì)含量，且在快速降低。機(jī)器化釀造入窖后發(fā)酵前6 天，的增殖相對(duì)緩慢，除外，其他優(yōu)勢(shì)屬較多（相對(duì)含量＞5 %），例如、、、、，且相對(duì)含量在前6 d 基本維持不變，發(fā)酵第10 天時(shí)，成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌，其他微生物相對(duì)含量快速降低，但的相對(duì)含量在整個(gè)發(fā)酵周期變化相對(duì)緩慢。

2.4.2 手工和機(jī)械化釀造過程中真菌群落的演替規(guī)律分析

如圖4、圖5 所示，手工釀造培菌階段真菌多樣性較高，主要優(yōu)勢(shì)菌為、、、、、、、等。窖內(nèi)發(fā)酵階段真菌多樣性比較單一，主要為、和；從窖內(nèi)發(fā)酵開始至結(jié)束相對(duì)豐度逐漸降低，相對(duì)豐度從5.43 %升至80.38%，變化較小。

圖4 手工釀造過程中真菌群落結(jié)構(gòu)變化

圖5 機(jī)械化釀造過程中真菌群落結(jié)構(gòu)變化

機(jī)械化釀造整個(gè)過程真菌多樣性比手工釀造單一，培菌階段為優(yōu)勢(shì)菌，窖內(nèi)發(fā)酵階段、和為 主 要 優(yōu)勢(shì)菌。

3 討論與總結(jié)

在機(jī)械化白酒釀造中，作為重要催化劑的微生物，處在不同于傳統(tǒng)白酒開放式生產(chǎn)環(huán)境下，群落動(dòng)態(tài)出現(xiàn)獨(dú)特變化，微生物代謝產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)也隨之形成特有變化趨勢(shì)。本試驗(yàn)基于手工和機(jī)械化釀造酒醅高通量測(cè)序結(jié)果，結(jié)合基酒風(fēng)味、酒醅理化指標(biāo)，對(duì)比分析小曲清香型白酒手工和機(jī)械化釀造過程中微生物及環(huán)境因子的變化規(guī)律，有助于解析手工和機(jī)械化白酒生產(chǎn)過程中的差異及其形成原因。

手工、機(jī)械化釀造分別檢測(cè)到110 個(gè)、114 個(gè)細(xì)菌屬，相比濃香和醬香白酒，小曲清香白酒的細(xì)菌多樣性較簡(jiǎn)單，可能是由于小曲清香白酒曲藥微生物群落單一，并且釀造環(huán)境較干凈。在手工和機(jī)械化釀造過程中乳酸菌均為豐度最高的細(xì)菌，說明乳酸菌對(duì)小曲清香白酒發(fā)酵非常重要。這與其他研究結(jié)果相似，清香型白酒發(fā)酵過程相對(duì)豐度始終保持在較高的水平；濃香型白酒發(fā)酵過程中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位的是，在發(fā)酵3 d 后相對(duì)豐度可占整個(gè)乳酸菌屬98%以上，并持續(xù)至發(fā)酵結(jié)束。機(jī)械化釀造基酒總酸和總酯高于手工釀造的原因之一可能是由于發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)，發(fā)酵后期乳酸菌的豐度占比超過50 %，因此后期會(huì)積累大量的乳酸和乳酸乙酯，導(dǎo)致總酸和總酯的增高。機(jī)械化釀造過程中醋酸菌的豐度高于手工釀造，而且在發(fā)酵過程中持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，特別是醋酸桿菌屬（）。醋酸是白酒的主要香味成分，同時(shí)也是酯的承受體，適量醋酸菌的存在有利于釀酒酵母合成乙酸乙酯。

手工、機(jī)械化釀造分別檢測(cè)到74 個(gè)、82 個(gè)真菌屬，其核心微生物均為釀酒酵母（）、根霉（）和伊薩酵母（）。有研究表明，釀酒酵母（）、東方伊薩酵母（）和異常威克漢姆酵母（）是白酒釀過程中最核心的3種酵母菌，而根霉為小曲清香白酒的主要糖化菌。手工釀造培菌階段真菌多樣性比機(jī)械化釀造高，可能是由于手工釀造屬于開放式生產(chǎn)，從環(huán)境中接種微生物較多；自動(dòng)化培菌過程為密封方式，環(huán)境中微生物種類較少。進(jìn)入窖內(nèi)發(fā)酵階段，由于酒醅酸度和酒精度的增加，非核心微生物被淘汰，所以核心微生物相同。

本研究分析結(jié)果顯示，不同生產(chǎn)方式酒醅理化指標(biāo)、微生物動(dòng)態(tài)變化和基酒主要風(fēng)味物質(zhì)均有一定的差異。這對(duì)于解析小曲清香型白酒發(fā)酵的機(jī)理以及通過調(diào)整生產(chǎn)參數(shù)提高固態(tài)發(fā)酵過程的可控性具有重要意義。