任婷月，韓 英，甄 攀，李永強，王曉勇，閆福新

（山西杏花村汾酒廠股份有限公司技術中心，山西汾陽 032205）

植物內生菌是指能在健康植物組織內棲居，對植物不造成實質性危害且與植物建立了和諧聯合關系的微生物。植物與其內生菌的這種共生現象在生物進化過程中歷史悠久且普遍，內生菌具有促進植物生長、生物固氮、增加宿主植物抗病能力等作用。植物內生菌還是一種新的微生物資源，在尋找抗菌抗癌物質、抗植物病蟲害方面，具有潛在的藥用價值。此外，還有一部分植物內生菌為植物病原菌，會引起多種經濟作物病害。植物內生菌分布廣、種類多，目前研究的植物種類僅幾百種。目前有關大麥內生菌的研究尚少。大麥是汾酒制曲原料之一，不同品種的大麥可能由于其內生菌多樣性不同，對制曲造成一定的影響。

傳統(tǒng)植物內生菌多樣性的研究采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)然后通過形態(tài)學、生理生化特性、分子鑒定方法進行鑒定。傳統(tǒng)分離方法分離培養(yǎng)工作量大、鑒定過程繁瑣復雜。近年來隨著細胞學、遺傳學、分子生物學等學科的發(fā)展，微生物的鑒定分類和多樣性研究有了很大的發(fā)展，出現了很多新技術，如限制性片段長度多態(tài)性分析、變性梯度凝膠電泳、高通量測序等。Janpen 等通過變形梯度凝膠電泳（DGGE）和傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法相結合分析了栽培稻中內生細菌的群落結構多樣性。Sessitsch 等用TRFLP 和DGGE 技術對不同馬鈴薯品種內生細菌多樣性進行了研究。高通量測序技術可以對一個物種基因組進行細致全貌的分析，快捷方便的讀取樣品中復雜的微生物結構，具有明顯的先進性和優(yōu)勢。目前，高通量測序技術已經運用于各種分子生物學領域，包括人體微生物研究、土壤微生物群落研究等。有關大麥內生菌多樣性的研究尚少。本研究采用高通量測序技術對3 個不同品種的大麥內生菌進行了細菌16S rRNA V3—V4 區(qū)基因序列和真菌ITS2 區(qū)基因序列測序，對其內生菌多樣性進行了對比研究，旨在為清香型白酒制曲原料大麥的選擇與豐富提供合理依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：3 個不同品種的大麥分別標記為DM1、DM2、DM3。

試劑及耗材：MoBio PowerSoil DNA Isolation Kit(100)，QIAGEN；2×Taq Plus Master Mix，Vazyme；Agencourt? AMPure? XP(核酸純化試劑盒)，Beckman Coulter；KAPA Library Quantification Kit(文庫定量試劑盒)，KAPA；MiSeq? Reagent Kit v3(600 cycle)(PE300)，illumina。

儀器設備：Eppendorf 高速臺式冷凍離心機，Eppendorf；電泳儀，Bio-Rad ；ABI 9700 PCR 儀，ABI；凝膠電泳成像分析系統(tǒng)，UVP Bioimaging System；Agilent 2100 生物分析儀，Agilent；Labchip GX生物大分子分析儀，PerkinElmer；ABI Qpcr儀，美國ABI；高通量二代測序儀，illumina。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取

將10 g 大麥樣品置于50 mL 無菌離心管中，加入1×PBS緩沖液后旋渦振蕩，使得微生物從物體表面充分脫落并聚集在PBS 緩沖液中。將大麥樣品用無菌鑷子取出，轉移至50 mL 無菌離心管中，直接研磨進行DNA 提取。使用PowerSoil DNA Isolation Kit(MoBio Laboratories,Carlsbad,CA)試劑盒提取基因組DNA。使用NanoDrop 2000 型超微量分光光度計測定其濃度和純度。

1.2.2 PCR擴增

利用細菌核糖體16S rRNA 基因的V3—V4 高變區(qū)進行擴增，建立克隆文庫測序，相關引物對為338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3') 和806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')。真核微生物擴增的序列為非編碼rRNA 的ITS2 regions 區(qū)域，相關引物對為：上游引物為GATGAAGAACGYAGYRAA，下游引物是TCCTCCGCTTATTGATATGC。對不同樣品的通用引物進行特異性設計，加入含有特異的8 個堿基的序列標簽(barcode)進行區(qū)分。PCR 反應體系（總體系為25 μL）：12.5 μL 2xTaq Plus Master Mix、3 μL BSA（2 ng/μL）、1 μL Forward Primer(5 μM)、1 μL Reverse Primer(5 μM)、2 μL DNA（加入的DNA總量為30 ng），最后加入5.5 μL dd HO補足至25 μL。反應參數：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性45 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸45 s，28 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 產物使用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增目的條帶大小，并用Agencourt AMPure XP 核酸純化試劑盒純化。

1.2.3 MiSeq 測序

PCR 產物用于構建微生物多樣性測序文庫，在北京奧維森基因科技有限公司使用Illumina Miseq PE300 高通量測序平臺進行Paired-end 測序。測序原始序列上傳至NCBI的SRA數據庫。

1.2.4 數據分析處理

下機數據經過QIIME1（v1.8.0）軟件根據Barcode 序列拆分樣本，使用Pear（v0.9.6）軟件對數據進行過濾、拼接。去除打分低值于20，含有模糊堿基，引物錯配的序列。拼接后使用Vsearch（v2.7.1）軟件去除長度小于230 bp 的序列，并根據Gold Database 數據庫用uchime 方法比對去除嵌合體序列。使用Vsearch（v2.7.1）軟件uparse 算法對優(yōu)質序列進行OTU 聚類（Operational Taxonomic Units），序列相似性閾值為97%。每個OTU 都有一個代表序列，將代表性序列與一會物種的使用RDP 數據庫進行比對，設置70%的置信度閾值，對每個代表性序列進行物種注釋。再利用QIIME1（v1.8.0）軟件進行α多樣指數分析（包括Shannon、Simpson 和Chao1 等指數）?；谖锓N注釋及相對豐度結果，使用R（v3.6.0）軟件進行物種組成柱狀圖分析。使用QIIME1（v1.8.0）計算beta 多樣性距離矩陣，并使用R（v3.6.0）軟件進行PCA分析。

2 結果與分析

2.1 Venn圖

OTU與物種呈現對應關系，可通過分析OTU分布情況了解樣本中微生物的多樣性與存在量。由圖1 可知，9 個大麥樣本共產生了158 個細菌OTU，3 個品種大麥共有細菌OTU 數為22 個，說明3 個品種大麥的細菌組成相似性不高。DM1 獨有的細菌OTU 數50 個，DM2 獨有的細菌OTU 數27 個，DM3獨有的細菌OTU 數1 個。由圖2 可知，9 個大麥樣本共產生了239 個真菌OTU，3 個品種大麥共有真菌OTU 數為50 個，說明3 個品種大麥的真菌組成相似性不高。DM1 獨有的真菌OTU 數58 個，DM2獨有的真菌OTU 數43 個，DM3 獨有的真菌OTU 數18個。

圖1 基于細菌OTU的Venn圖

圖2 基于真菌OTU的Venn圖

2.2 稀釋性曲線

稀釋性曲線是可以用來比較測序數據量不同的樣品中物種的豐富度，也可以用來說明樣本的測序數據量是否合理。當曲線趨向平坦時，說明測序數據量合理，更多的數據量只會產生少量新的OTU，反之則表明繼續(xù)測序還可能產生較多新的OTU。3 個不同品種大麥樣品的稀釋性曲線見圖3和圖4。由圖3 和圖4 可知，曲線最終趨勢都趨于平坦，說明此次測序深度能反映樣品中的物種信息。

圖3 細菌稀釋性曲線

圖4 真菌稀釋性曲線

2.3 Alpha多樣性分析

通過Alpha 多樣性分析可以知道微生物群落的豐富度和多樣性。Chao1 指菌種豐富度指數，用以估計群落中的OTU 數目，通常Chao1 指數越高，樣品中物種豐富度越大。Shannon（香農指數）是用來估算樣品中微生物多樣性指數之一，通常Shannon 指數值越大，表示樣本中物種多樣性越高，反之，樣品中的物種多樣性越低。由圖5 可知，DM1 的Chao1 指數與Shannon 指數均最高，說明DM1 的細菌豐富度和多樣性最高，DM3 的細菌豐富度最低，DM2 的細菌多樣性最低。由圖6 可知，DM1 的Chao1 指數與Shannon 指數均最高，說明DM1 的真菌豐富度和多樣性最高，DM2 的真菌豐富度和多樣性最低。

圖5 細菌Alpha多樣性box圖

圖6 真菌Alpha多樣性box圖

2.4 細菌群落多樣性

基于門和屬水平，3 個不同品種大麥樣品內生菌細菌群落結構見圖7。

由圖7（a）可知，基于門水平，大麥內生菌樣本中，相對豐度較高的依次是藍細菌門（Cyanobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）。DM1 中還有少量的厚壁菌門（Firmicutes），相對豐度為1.18%。

由圖7（b）可知，基于屬水平，大麥內生菌樣本中，相對豐度較高的依次是藍細菌門一類未分類的屬（unidentified）、__、泛菌屬（）、假單胞菌屬（）。在DM1 中相對豐度依次為69.6 %、23.4 %、2.3 %、1.3 %，在DM2 中的相對豐度依次為68.9 %、29.3%、0.3%、0.2%，在DM3 中的相對豐度依次為64.4%、33.4%、1.7%、0.2%。DM1 中泛菌屬（）和假單胞菌屬（）的相對豐度較高，分別是2.3%和1.3%，DM3 中泛菌屬（）相對豐度較高，為1.7 %。泛菌屬()是一類革蘭氏陰性菌，屬于腸桿菌科，細胞呈直桿狀，大多數菌株能產生黃色素。泛菌屬在自然界中分布廣泛，主要存在于水和土壤中，寄主包括植物、人以及昆蟲。研究發(fā)現，泛菌屬還存在于多植物種子中，且多為優(yōu)勢類群。泛菌屬作為多種植物內生菌具有固氮和促生功能，有些對植物病原菌具有生防作用。假單胞菌屬（）是一大類革蘭氏陰性菌，廣泛存在于土壤、水、空氣中，也是一種常見的植物內生菌。Rahman 等對來自于不同的品種、地理位置和世代的大麥內生微生物組進行研究，均檢測到、和相關類群，并表明在溫室條件下具有促進植物生長和抵抗真菌性病害等功能。在連續(xù)3 代的蘿卜種子中，發(fā)現和也是主要類群。

圖7 基于門(a)和屬(b)水平細菌群落結構分布

2.5 真菌群落多樣性

基于門和屬水平，3 個不同品種大麥樣品內生菌真菌群落結構見圖8。

圖8 基于門(a)和屬(b)水平真菌群落結構分布

由圖8（a）可知，在真菌門水平上，大麥內生菌樣本中主要是擔子菌門（Basidiomycota）和子囊菌門（Ascomycota）。3 個品種大麥樣本中比例不同，擔子菌門（Basidiomycota）和子囊菌門（Ascomycota）在DM1 中相對豐度依次為74.6 %、25.3 %，在DM2 中的相對豐度依次為82.6%、16.5%，在DM3中的相對豐度依次為53.6 %、46.3 %。子囊菌門（Ascomycota）在DM3中相對豐度較高。

由圖8（b）可知，在真菌屬水平上，大麥內生菌樣本中，相對豐度較高的依次是一類未鑒定的屬（unidentified）、鏈格孢屬（）、類型孢子菌屬（），在DM1 中相對豐度依次為70.1%、19.7 %、2.6 %，在DM2 中的相對豐度依次為83.2 %、16.3 %、0.2 %，在DM3 中的相對豐度依次為48.2 %、43.7 %、2.7 %。3 個品種大麥樣本中比例不同，DM3 中鏈格孢屬（）相對豐度較高。鏈格孢屬()屬于子囊菌，座囊菌綱，隔孢菌目，隔孢菌科，是一種在自然界廣泛分布的暗色真菌，多數兼性寄生于植物上，少數腐生于土壤或多種有機質中。鏈格孢屬是經濟上重要的真菌屬之一，大多數種類會引起多種經濟植物病害，造成田間和產后損失。另外，DM1 中發(fā)現少量鐮刀菌屬（），相對豐度為2.6 %鐮刀菌屬是一類重要的植物病原真菌，對糧食生產有重大的危害。DM3 中發(fā)現少量短梗霉屬（），相對豐度為2.1 %，擲孢酵母屬（），相對豐度為1.5%。短梗霉屬（）是一種世界性的酵母樣真菌，因其能產生黑色素而被稱為黑酵母。短梗霉作為生防菌可有效拮抗植物病原真菌和細菌。

2.6 PCA分析

PCA 分析(Principal Component Analysis)，即主成分分析，是一種對數據進行簡化分析的技術。PCA運用方差分解，將多組數據的差異反映在二維坐標圖上，坐標軸取能夠最大反映方差值的兩個特征值。樣本組成越相似，反映在PCA 圖中的距離越近。

圖9 中橫坐標PC1 和縱坐標PC2 分別表示排名第一和第二的主成分的得分，分別是55.79 %和20.47%，每個散點代表一個樣本，散點的顏色和形狀表示不同的分組，樣本全部處于95 %置信區(qū)間內。從PCA 得分圖的結果可以看出，3 個大麥品種組距離較遠，細菌群落組成差異較大。圖10 中橫坐標PC1 和縱坐標PC2 分別表示排名第一和第二的主成分的得分，分別是54.13 %和29.22 %，樣本全部處于95%置信區(qū)間內。從PCA 得分圖的結果可以看出，3 個大麥品種組分布在不同的象限內，距離較遠，因此真菌群落結構差異較大。由此表明3 個大麥品種內生菌群落結構差異較大。這與Venn圖分析結果相吻合。

圖9 基于細菌OTU水平的PCA分析

圖10 基于真菌OTU水平的PCA分析

3 結論

不同品種大麥，其內生菌可能對大曲的發(fā)酵有不同的影響，本研究采用Illumina Miseq 高通量測序技術對不同大麥品種內生細菌和內生真菌群落結構進行了分析。

從細菌群落結構分析來看，在屬水平上，3個大麥品種優(yōu)勢菌相同，相對豐度較高的依次是藍細菌門一類未分類的屬、__屬，在DM1 中相對豐度依次為69.6 %、23.4 %，在DM2 中的相對豐度依次為68.9%、29.3%，在DM3中的相對豐度依次為64.4%、33.4%。豐度較低的泛菌屬（）和假單胞菌屬（）在3個大麥品種差異較大。由Venn 圖分析和PCA 分析可知，3個大麥品種細菌群落組成差異較大。

從真菌群落結構分析來看，在真菌屬水平上，3個大麥品種優(yōu)勢菌相同，相對豐度較高的依次是一類未鑒定的屬（unidentified）、鏈格孢屬（）、類型孢子菌屬（）。在DM1 中相對豐度依次為70.1 %、19.7 %、2.6 %，在DM2 中的相對豐度依次為83.2 %、16.3 %、0.2 %，在DM3 中的相對豐度依次為48.2 %、43.7 %、2.7 %。3 個品種大麥樣本中比例不同，DM3 中鏈格孢屬（）相對豐度較高；DM1 中發(fā)現少量鐮刀菌屬（），相對豐度為2.6%；DM3 中發(fā)現少量短梗霉屬（）和擲孢酵母屬（），相對豐度分別是2.1%和1.5%。由Venn 圖分析和PCA 分析可知，3 個大麥品種內生菌真菌群落組成差異較大。

Alpha 多樣性分析結果表明，DM2 的細菌多樣性和真菌多樣性均最低。真菌屬水平上，DM1 中發(fā)現少量鐮刀菌屬（），鐮刀菌屬是一類重要的植物病原真菌，對糧食生產有重大的危害。DM3 中能引起經濟作物病害的鏈格孢屬（）相對豐度較高為43.7 %，比DM1、DM2 分別高24%、27.4%。在清香型白酒制曲原料大麥的選擇上，應避免選擇含有鐮刀菌屬（）及鏈格孢屬（）等植物病原菌，或植物病原菌含量較多的原料。