王柯

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江杭州 310053）

通過在PCR反應(yīng)的體系中加入了熒光基團(tuán)，接著利用熒光信號(hào)的累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR的進(jìn)程，最終通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的技術(shù)方法，就是實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)。由于常規(guī)PCR技術(shù)在應(yīng)用過程中暴露出了許多問題，如假陽(yáng)性的弊端、造成環(huán)境污染問題等，這些問題將會(huì)限制了PCR技術(shù)在臨床的進(jìn)一步應(yīng)用[1]。與常規(guī)PCR相比，它更加準(zhǔn)確、特異、靈敏和快速，所以短時(shí)間內(nèi)就被廣泛應(yīng)用到醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域。本文將具體闡述實(shí)時(shí)熒光定量PCR及初步說明檢測(cè)鑒定新型冠狀病毒中的作用。

1. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的簡(jiǎn)要介紹

1.1 TaqMan探針

TaqMan探針為一寡核苷酸，在其兩端分別用一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)以及一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記。當(dāng)探針完整的時(shí)候，淬滅基團(tuán)吸收?qǐng)?bào)告基團(tuán)所發(fā)射的熒光信號(hào)。進(jìn)行延伸反應(yīng)時(shí)，探針會(huì)被聚合酶的5′-3′外切酶活性切斷，使得熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離開，繼而能夠發(fā)射出熒光。一分子的產(chǎn)物的產(chǎn)生，同時(shí)也就伴隨著一分子的熒光信號(hào)產(chǎn)生，隨著擴(kuò)增循環(huán)的數(shù)目不斷增加疊加，所釋放出來的熒光基團(tuán)也不斷積累并增加，最后我們根據(jù)熒光強(qiáng)度可定量分析。新型TaqMan-MGB探針，其3′端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)是一種幾乎無熒光本底的小溝結(jié)合物，使其特異性、靈敏度、穩(wěn)定性都有所提高。該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可以應(yīng)用于單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)（SNP）和多重病原體檢測(cè)等領(lǐng)域。

1.2 SYBR熒光染料

熒光染料的檢測(cè)方法是非特異性檢測(cè)的一種方法，PCR反應(yīng)體系中的總核酸量通過此方法能夠被反應(yīng)，主要包括溴化乙錠、SYBR GreenⅠ等。當(dāng)熒光染料與雙鏈DNA結(jié)合之后，其熒光將增強(qiáng)，但是沒有摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)放射任何的熒光信號(hào)，因此熒光的增強(qiáng)程度與復(fù)制的進(jìn)行是同步關(guān)聯(lián)的。SYBR熒光染料的優(yōu)越性體現(xiàn)在操作簡(jiǎn)單、靈敏性高、通用性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)等方面。只要測(cè)定PCR反應(yīng)液中的熒光強(qiáng)度，就可以對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行定量分析，目標(biāo)基因的Tm值也可以通過此方法測(cè)定出來。在使用過程中需把握熒光染料的濃度，若濃度過低，擴(kuò)增的樣品可能無法檢出。若濃度過高，SYBR GreenⅠ則又可以抑制PCR反應(yīng)，進(jìn)而降低PCR反應(yīng)速率，可以采取合適的Mg2+濃度來對(duì)抗它對(duì)反應(yīng)的抑制作用。

1.3 分子信標(biāo)

分子信標(biāo)帶有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，是一種雙標(biāo)記寡核苷酸探針，也是一種TaqMan探針的衍生形式。由于其兩側(cè)的核酸序列是互補(bǔ)配對(duì)的，會(huì)導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)相互貼近，因而無法產(chǎn)生熒光。但在退火進(jìn)程中，分子信標(biāo)中間的部分會(huì)與特定的DNA序列進(jìn)行配對(duì)并結(jié)合，使得熒光基因與淬滅基因相分離產(chǎn)生熒光。分子信標(biāo)的靈敏度高、操作簡(jiǎn)便，被用于生物學(xué)和生物分析等領(lǐng)域，對(duì)基因突變所引起的疾病、活細(xì)胞RNA及蛋白質(zhì)的檢測(cè)發(fā)揮著很大作用。

分子信標(biāo)的靈敏度要比其他同長(zhǎng)的寡核苷酸探針高，它適用于檢測(cè)點(diǎn)突變，僅有一個(gè)核苷酸差別的DNA序列也能得到區(qū)分，其弊端在于與模板結(jié)合的穩(wěn)定性較差。從分子信標(biāo)首次提出以來，它在很多重要的生化分析領(lǐng)域中扮演著越來越重要的角色[2]。

2. 新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）及檢測(cè)方法

2.1 SARS-CoV-2的及其特點(diǎn)

2019年12月，新型冠狀病毒在武漢城爆發(fā)，該病毒的所致癥狀通常為發(fā)燒、乏力、干咳等，逐漸發(fā)展為呼吸困難，嚴(yán)重者表現(xiàn)為ARDS，甚至膿毒癥休克，以及難以恢復(fù)的代謝性酸中毒還有凝血功能的障礙，其傳播途徑為呼吸道飛沫傳播和接觸傳播。該病毒因其危害性大且傳染性強(qiáng)，有潛伏期，沒有相關(guān)特異的治療方法，目前新型冠狀病毒肺炎在全世界范圍內(nèi)蔓延。

新型冠狀病毒是引起此次新型冠狀病毒肺炎的病原體，屬于β屬冠狀病毒，其基因組為單鏈RNA。新冠肺炎疫情傳播非常迅速，感染面很廣，防控的難度很大。但是目前我們對(duì)于新型冠狀病毒的來源還不是非常確定，存在著諸多爭(zhēng)議。SARS-CoV-2還有很多的變異株，如奧密克戎等，其快速的變異性更是對(duì)控制新冠起了巨大的阻礙作用。

2.2 SARS-CoV-2的檢測(cè)

檢測(cè)SARS-CoV-2的特異核酸序列，首先要將SARSCoV-2核酸（RNA）逆轉(zhuǎn)錄為DNA，再用多聚酶鏈反應(yīng)的方法將DNA進(jìn)行擴(kuò)增，用來檢測(cè)特定的基因序列。PCR是擴(kuò)增DNA的方法，是將篩選出的具有特異性的新冠病毒部分特有的相關(guān)基因片段作為靶標(biāo)DNA，這種序列的擴(kuò)增是是一種指數(shù)級(jí)的擴(kuò)增。每一個(gè)新擴(kuò)增出來的DNA序列，我們都可預(yù)先就加入的一段熒光標(biāo)記得探針結(jié)合，用于產(chǎn)生熒光信號(hào)。擴(kuò)增過程中擴(kuò)增出來的基因愈多，累計(jì)的熒光信號(hào)就越強(qiáng)，以此方法可以確定樣本中是否有病毒的核酸，也就是表示受檢者是否感染[3]。

國(guó)家衛(wèi)生健康委辦公廳關(guān)于印發(fā)《新型冠狀病毒肺炎診療方案》和《新型冠狀病毒肺炎防控方案》中指出，熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR可以快速檢測(cè)病人標(biāo)本中的SARSCoV-2 RNA[4]。其步驟包括標(biāo)本采集、試劑與儀器準(zhǔn)備、提取RNA、RT-q PCR等。

確診感染的最重要指標(biāo)之一是進(jìn)行新型冠狀病毒核酸的檢測(cè)，如何確保檢測(cè)的精準(zhǔn)性是實(shí)驗(yàn)室目前的重點(diǎn)。診斷試劑、核酸檢測(cè)質(zhì)量體系是較令人注意的內(nèi)容，在標(biāo)本取材的方面質(zhì)量控制通過“內(nèi)標(biāo)”RNase P的設(shè)置是一種較好監(jiān)控是否采集到足夠量的細(xì)胞的方法。但是核酸RNA在取材后的降解這方面卻容易被忽略，也是由于各式各樣的取材管，無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)與要求，后期的核酸檢測(cè)結(jié)果就容易出現(xiàn)假陰性的現(xiàn)象[5]。

在RT-PCR的實(shí)驗(yàn)過程中，為防止陽(yáng)性核酸的污染，進(jìn)行試劑配制、核酸抽提、核酸擴(kuò)增等需要進(jìn)行分區(qū)處置。并將陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行復(fù)測(cè)，或在核酸重新抽提后復(fù)測(cè)，因此在檢測(cè)的過程中，建議加入dUTP以及UNG酶的防污染系統(tǒng)[6]。

傳統(tǒng)當(dāng)中的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的檢測(cè)方法需要進(jìn)行加樣、核酸提取、離心等生物安全風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)較大的步驟，同時(shí)在新冠病毒核酸的檢測(cè)在樣品的保存等實(shí)驗(yàn)內(nèi)容、實(shí)驗(yàn)室中人員操作的熟練程度、生物安全意識(shí)等方面有著較高需求。目前隨著分子診斷內(nèi)容的廣泛開展，其核酸提取擴(kuò)增檢測(cè)一體化的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀不斷在臨床中得到應(yīng)用[7]。

2.3 數(shù)字PCR

現(xiàn)在運(yùn)用廣泛的熒光定量PCR（RT-PCR）在檢測(cè)SARS-CoV-2方面可能會(huì)存在“假陰性”的結(jié)果，存在需要多次取樣、重復(fù)檢測(cè)等缺陷，因此亟需建立一種靈敏度更高、樣本用量更少、操作更簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法，以快速、精確的方式篩查出患者。數(shù)字PCR作為一種新興的痕量核酸分子技術(shù)，它不僅有靈敏度高、耐受性強(qiáng)的特點(diǎn)，也擁有可以絕對(duì)定量等優(yōu)點(diǎn)，在病毒檢測(cè)的領(lǐng)域中受到廣泛應(yīng)用。同時(shí)，數(shù)字PCR對(duì)反應(yīng)抑制劑的耐受性比較強(qiáng)、受到背景野生DNA分子干擾小，當(dāng)樣本珍貴、病毒載量低、樣本核酸存在降解時(shí)，數(shù)字PCR優(yōu)勢(shì)明顯。迅速、便捷、準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)環(huán)境中的病毒也是數(shù)字PCR的一大特點(diǎn)，早發(fā)現(xiàn)、早隔離、早治療，對(duì)維護(hù)全球公共衛(wèi)生安全具有顯著的深遠(yuǎn)影響[8]。

然而我國(guó)的數(shù)字PCR技術(shù)存在著諸多弊端，例如缺乏共性理論的研究，與數(shù)字PCR方法的發(fā)展實(shí)際聯(lián)系不夠貼近。若要應(yīng)用于臨床研究，數(shù)字PCR方法尚未獲得監(jiān)管部門許可，這也許是造成醫(yī)療衛(wèi)生等范疇無任何有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的主要原因。我國(guó)數(shù)字PCR方法與標(biāo)準(zhǔn)的國(guó)際化存在一定的差距，原因是未引起對(duì)其國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化的重視[9]。

2.4 病毒基因測(cè)序

基因測(cè)序作為一種新型的基因檢測(cè)技術(shù)，它能夠通過血液或唾液分析測(cè)定基因序列，從而預(yù)測(cè)病毒感染等疾病的可能性，根據(jù)與已知的新型冠狀病毒是否高度同源，進(jìn)而判斷是否感染新冠病毒。

2.5 存在問題與對(duì)策

新冠的標(biāo)本在采集完成后如果存在標(biāo)本蓋沒有擰緊或者由于傾倒轉(zhuǎn)輸?shù)倪^程中經(jīng)過劇烈震蕩搖晃的情況也可以造成交叉污染。正因如此，在日常工作當(dāng)中就應(yīng)該制訂有關(guān)標(biāo)本采集的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)操作程序，加強(qiáng)對(duì)相關(guān)人員的系統(tǒng)培訓(xùn)與考核，確保標(biāo)本在采集、運(yùn)輸、保存等各個(gè)途徑中都沒有被污染的可能性。核酸檢測(cè)也需要在符合生物安全的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，所有設(shè)備例如生物安全柜、離心機(jī)等，若被陽(yáng)性質(zhì)?；蜿?yáng)性標(biāo)本所污染，就可以導(dǎo)致假陽(yáng)性的結(jié)果出現(xiàn)，儀器的性能如果不佳也會(huì)造成擴(kuò)增出現(xiàn)假陽(yáng)性。除此之外，實(shí)驗(yàn)室的污染、核酸檢測(cè)的人員防護(hù)意識(shí)以及防污染的意識(shí)不夠強(qiáng)，或者其對(duì)實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作的規(guī)程不熟悉，也容易導(dǎo)致污染，最終使結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性的情況[10]。

RT-PCR的檢測(cè)的可信度比較高，但在最開始也存在假陰性的問題。實(shí)際上核酸檢測(cè)呈現(xiàn)假陰性的原因有：研發(fā)的試劑盒質(zhì)量并不是很高，經(jīng)過改進(jìn)以后，這一方面的短板得以解決，患者在做前幾次檢測(cè)時(shí)，病毒也許沒有充分侵入人體。所以說，有人經(jīng)多次檢測(cè)才查出病毒核酸陽(yáng)性的結(jié)果[3]。其解決方法有：標(biāo)本采集進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化培訓(xùn)，并且提高試劑盒的質(zhì)量控制，增加檢測(cè)明確性質(zhì)，對(duì)出院患者進(jìn)行密切隨訪等。核酸檢測(cè)假陰性的情況同樣需要被重視，所以必須重視輕癥患者的出院標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)提高治愈出院的標(biāo)準(zhǔn)[11]。

2.6 展望

對(duì)SARS-CoV-2核酸的RT-PCR檢測(cè)，以及利用病毒基因測(cè)序與已知的新型冠狀病毒高度同源等方法途徑作為臨床確診的主要判斷依據(jù)，防控疫情取得了較好的效果[12]。PCR的熒光定量PCR、數(shù)字PCR等診斷技術(shù)各有其優(yōu)劣之處，因此它們適用于不同的條件。在目前實(shí)時(shí)熒光定量PCR的發(fā)展是較為完善的，在臨床檢測(cè)中適用面較廣泛。在醫(yī)院、第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)等場(chǎng)所，熒光定量PCR是SARS-CoV-2檢測(cè)的主要手段，然而其檢測(cè)效率會(huì)被假陰性所制約，檢出率不高。數(shù)字PCR可以定量檢測(cè)病毒的拷貝數(shù)目，且靈敏度要高于熒光定量PCR，對(duì)于恢復(fù)期患者低病毒載量的上呼吸道的樣本，數(shù)字PCR仍可以檢出SARS-CoV-2，但其檢測(cè)的成本高，且操作相對(duì)繁雜，難以普及[13]。

本土疫情已基本得到控制，但由于境外疫情的發(fā)展以及國(guó)內(nèi)局部地區(qū)新冠疫情時(shí)有發(fā)生，面臨著新冠肺炎輸入疫情的境地與存在著疫情反彈的風(fēng)險(xiǎn)，面臨恢復(fù)正常生產(chǎn)需求、生活秩序的迫切需要等問題，新冠疫情防控的形勢(shì)依然十分嚴(yán)峻[14]，全球新冠肺炎疫情以及連帶效應(yīng)，給全世界的人民帶來的是多重危機(jī)。為了有效面對(duì)并戰(zhàn)勝疫情所帶來的危機(jī)，構(gòu)建人類命運(yùn)共同體的迫切性與重要性更加能夠得到凸顯[15]。其診斷方法依然是當(dāng)下的研究的重中之重，我們?nèi)孕枰咛禺愋院挽`敏度、低成本易操作且時(shí)間短的診斷方法。相信隨著不斷的深入研究，新型可靠的診斷技術(shù)將不斷滿足臨床當(dāng)中的需求，更好地為患者生命得健康保駕護(hù)航[12]。