徐海剛，劉佳慧，熊 智

（1.貴州輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 貴陽 550000；2.西南林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650000；3.貴州省農(nóng)作物技術(shù)推廣總站，貴州 貴陽 550000）

解淀粉芽孢桿菌屬于一種對人畜無毒害的G+細(xì)菌[1]，產(chǎn)芽孢，具有防治植物病害、促進(jìn)植物生長、改善根際土壤微生物種群結(jié)構(gòu)等作用，對于病害防治、植物促生和果蔬采后保鮮等具有重要意義[2]。

解淀粉芽孢桿菌是一類高效、安全、多功能并且具有極大的開發(fā)潛力的微生物菌種，應(yīng)用廣泛[3-6]。例如，解淀粉芽孢桿菌可以通過產(chǎn)生3-吲哚乙酸以及其他代謝產(chǎn)物促進(jìn)農(nóng)作物生長，其合成的脂肽類化合物、聚酮類化合物、細(xì)菌素能夠?qū)ν寥乐械闹虏【a(chǎn)生拮抗作用[7]，抑制病原菌的生長或繁殖，從而達(dá)到防治病害的作用[8]；脂肽是芽孢桿菌非核糖體多肽合成酶系產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，因廣譜抑菌、低耐藥性、可生物降解、安全低毒，被視為安全健康的抗菌分子[9]；板藍(lán)根經(jīng)解淀粉芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵后可顯著提高(R,S)-告依春含量[10]。

淀粉酶是近年來引起工業(yè)界廣泛關(guān)注的一類酶，約占世界酶市場份額的25%[11]。α-淀粉酶是一類作用于淀粉內(nèi)部通過水解α-1,4 糖苷鍵從而將淀粉水解為糊精、低聚糖和單糖的酶，該類酶已被廣泛應(yīng)用于面包生產(chǎn)及洗滌等工藝中[12]。其中酸性α-淀粉酶可以廣泛應(yīng)用于發(fā)酵、飼料、食品和生物制藥等多個領(lǐng)域[13]。另外高產(chǎn)淀粉酶菌株往往具有高糖化作用，對于提高白酒出酒率和縮短白酒釀造周期具有重要的作用[12,14]。

解淀粉酶芽孢桿菌作為重要的生防芽孢桿菌，其代謝產(chǎn)物有脂肽、抗菌蛋白、大環(huán)內(nèi)酯類等，可以有效抑制病原真菌，被廣泛應(yīng)用于生物防治、食品保鮮加工等領(lǐng)域[15-16]。本文以實(shí)驗(yàn)室篩選出的解淀粉芽孢桿菌為實(shí)驗(yàn)菌株，通過液態(tài)培養(yǎng)基發(fā)酵，對淀粉濃度、接種量、發(fā)酵時間、培養(yǎng)基pH 4 個因素進(jìn)行了單因素和正交試驗(yàn)，確定了解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)α-淀粉酶的最佳發(fā)酵條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

解淀粉芽孢桿菌菌株，由貴州輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室篩選分離。

1.1.2 培養(yǎng)基

（1）富集培養(yǎng)基。蛋白胨5 g，硫酸銨2 g，牛肉膏5 g，磷酸氫二鉀5 g，氯化鈣0.1 g，氯化鈉5 g，七水硫酸鎂0.2 g，水1 000 mL。

（2）種子培養(yǎng)基。蛋白胨5 g，硫酸銨2 g，磷酸氫二鉀5 g，牛肉膏5 g，七水硫酸鎂0.2 g，氯化鈣 0.1 g，氯化鈉5 g，水1 000 mL。

1.1.3 試劑

主要試劑見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)試劑

1.1.4 主要儀器

主要實(shí)驗(yàn)儀器見表2。

表2 實(shí)驗(yàn)儀器表

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試劑的制備

（1）原碘液的配制。用天平分別稱量碘11 g、碘化鉀22 g，用去離子水溶解并用500 mL 容量瓶定容。

（2）稀碘液。用移液管移?。?）中溶液2 mL 于去離子水中，并用500 mL 容量瓶定容。

（3）20 g·L-1可溶性淀粉溶液。稱量2 g 可溶性淀粉，并用100 mL 容量瓶定容。

（4）磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液（pH 值6.5）。分別配制0.2 mol·L-1的磷酸氫二鈉溶液和0.1 mol·L-1的檸檬酸溶液，借助pH 計配制不同pH 值的緩沖溶液，備用[17]。

（5）酶解反應(yīng)終止液。稱取氯化銅1.003 2 g，用蒸餾水定容至10 mL；取37%的鹽酸9 mL，稀釋至90 mL，將二者混合即為終止液，備用[18]。

1.2.2 酶活力測定

樣品管：取一組比色管，分別加入1.00 mL 不同濃度的α-淀粉酶溶液；標(biāo)準(zhǔn)試管：用1.00 mL 的緩沖溶液代替酶液。在37 ℃的水浴中恒溫2 min后，依次加入同溫度預(yù)熱的0.008 g·mL-1淀粉溶液 5 mL，然后立刻攪拌均勻。在37 ℃下反應(yīng)10 min，加入1 mL 的停止溶液。搖勻之后，將其冷卻至室溫，分別取0.2 mL 于試管中，加入7 mL 碘液，搖勻，在580 nm 處測定吸光度，以相同濃度的淀粉在加入不同量α-淀粉酶前后吸光度的變化為依據(jù)，測量α-淀粉酶活性，酶活力按式（1）計算[17]。

式中：4 表示樣品管和標(biāo)準(zhǔn)管中淀粉量均為 5 mL 0.8%的淀粉；AX為樣品管中吸光度；AS為標(biāo)準(zhǔn)管中吸光度。

1.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計

1.3.1 pH 值對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶酶活力的影響

選擇發(fā)酵時間48 h，淀粉濃度2%，接種量6%，研究酵培養(yǎng)基初始pH 值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶酶活力的影響。

1.3.2 發(fā)酵時間對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶酶活力的影響

選擇pH=7.0，接種量為6%，淀粉濃度2%，研究發(fā)酵培養(yǎng)時間（24 h、36 h、48 h、60 h、72 h）對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶酶活力的影響。

1.3.3 接種量對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶酶活力的影響

選擇pH=7.0，淀粉濃度2%，培養(yǎng)48 h，研究接種量（2%、4%、6%、8%、10%）對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶酶活力的影響。

1.3.4 淀粉濃度對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶酶活力的影響

選擇pH=7.0，接種量6%，發(fā)酵48 h，研究培養(yǎng)基淀粉濃度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶酶活力的影響。

1.4 正交試驗(yàn)設(shè)計

以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，通過正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)α-淀粉發(fā)酵條件。設(shè)計4 因素3 水平，按L9(34)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[19]，以酶活力為指標(biāo)，選擇最佳發(fā)酵條件，正交試驗(yàn)因素水平表見表3。

表3 正交試驗(yàn)因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 pH 值對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶酶活力的影響

如圖1 所示，隨著解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液初始pH 值的增大，酶活力呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)pH值為7.0 時酶活力最高，pH 值為5.0 ～6.0 對產(chǎn)淀粉酶活力影響不大。出現(xiàn)上述結(jié)果可能是由于微生物具有自身保護(hù)細(xì)胞的正常新陳代謝和產(chǎn)酶機(jī)制的調(diào)節(jié)能力，外界酸堿度對其代謝和產(chǎn)酶具有重要的影響作用，這種情況導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)酸堿度受到了一定程度影響，進(jìn)而對菌株的新陳代謝及產(chǎn)酶反應(yīng)造成一定的影響。

圖1 pH 值對產(chǎn)酶的影響

2.2 發(fā)酵時間對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶酶活力的影響

如圖2 所示，隨著發(fā)酵時間的增加，酶活力呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)發(fā)酵時間為48 h 時，酶活力最高，因此48 h 是最適發(fā)酵時間。

圖2 發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響

2.3 接種量對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶酶活力的影響

接種量的不同會影響發(fā)酵時間和酶生產(chǎn)。當(dāng)接種量太小時，會延長延滯期，引起菌體濃度降低，最后導(dǎo)致α-淀粉酶產(chǎn)量減??；當(dāng)接種量太大時，菌體的數(shù)量過多會導(dǎo)致空間內(nèi)的氧氣和養(yǎng)料不夠，從而影響菌種的生長，最終導(dǎo)致α-淀粉酶降低。如圖3 所示，淀粉酶活力隨著接種量的增加先升高后降低，特別是接種量在2%～4%時酶活力上升的速率最快；在接種量大于4%時酶活力的上升幅度減緩，當(dāng)接種量達(dá)到6%時淀粉的酶活力最高，超過6%后酶活力又迅速降低。低密度菌株相對底物的生物值比較豐富，由于菌株的大量繁殖，其代謝更加旺盛。密度高的菌株新陳代謝及產(chǎn)酶所需消化生物質(zhì)的量很大，會使其產(chǎn)生出小于菌株生長所需時酶活力下降的情況。通過研究表明微生物的接種量對發(fā)酵過程具有重要作用[19-20]。

圖3 接種量對產(chǎn)酶的影響

2.4 淀粉濃度對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶酶活力的影響

淀粉不僅是氮源，還能提供多種微量元素與生長因子。從圖4 可以看出，當(dāng)?shù)矸蹪舛仍?.5%～1.5%時，酶活力呈現(xiàn)緩慢上升趨勢，當(dāng)?shù)矸蹪舛冗_(dá)到1.5%時酶活力最高；淀粉濃度為1.5%～2.0%時酶活力呈下降趨勢，繼續(xù)增大淀粉濃度，酶活力不再下降。

圖4 淀粉濃度對產(chǎn)酶的影響

2.5 正交實(shí)驗(yàn)分析

正交試驗(yàn)結(jié)果見表4，方差分析結(jié)果見表5。比較4 個因素的極差可知，影響解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶因素的大小順序?yàn)榈矸蹪舛龋揪N接種量＞培養(yǎng)基pH 值＞發(fā)酵時間，即淀粉濃度對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶的影響最大，其次是菌種接種量、培養(yǎng)基pH 值，最后是發(fā)酵時間；同時由方差分析結(jié)果可以看出，培養(yǎng)基pH 值、發(fā)酵時間、接種量及淀粉濃度對菌株水解淀粉試驗(yàn)過程中的影響都極顯著。K值分析可知，A3B3C1D2為最佳組合，即培養(yǎng)基pH=8.0、發(fā)酵時間60 h、菌種接種量4%、淀粉濃度1.5%。將以上優(yōu)化的最佳發(fā)酵條件A3B3C1D2產(chǎn)出的酶活力與正交試驗(yàn)表中直接得出的最佳發(fā)酵條件A2B3C1D2產(chǎn)出的酶活力進(jìn)行對照，得出A3B3C1D2為最佳 （399.3 U·mL-1）。

表4 正交試驗(yàn)方案和試驗(yàn)結(jié)果

表5 正交實(shí)驗(yàn)方差分析表

3 結(jié)論

解淀粉芽孢桿菌是一類高效、安全、多功能并且具有極大的開發(fā)潛力的微生物菌種，應(yīng)用廣泛[21-22]。 本文通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)得出解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)α-淀粉酶的最佳發(fā)酵條件為培養(yǎng)基pH=8.0、發(fā)酵時間60 h、菌種接種量4%、淀粉濃度1.5%，在此條件下生產(chǎn)淀粉芽孢桿菌產(chǎn)α-淀粉酶酶活力相對最高（399.3 U·mL-1），為α-淀粉酶的工業(yè)生產(chǎn)提供了理論數(shù)據(jù)。