陳明干，龔慶豪，戴剛，朱榮華，張捷

胃癌是我國常見的消化道惡性腫瘤，其具有浸潤性生長的特征，向周圍組織浸潤的癌細(xì)胞也成為了胃癌根治術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的病理基礎(chǔ)[1]。過度增強(qiáng)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及過度激活的Janus相關(guān)激酶2(Janus associated kinase 2，JAK2)/信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transduction and activators of transcription,STAT3)信號通路是與胃癌病灶浸潤性生長直接相關(guān)的病理環(huán)節(jié)[2-3]，早期通過血清標(biāo)志物的檢測來評價病灶內(nèi)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及JAK2/STAT3信號通路激活程度，有助于及時判斷胃癌惡性程度、探究胃癌發(fā)病分子機(jī)制。胃泌素是近年來新發(fā)現(xiàn)的胃癌標(biāo)志物，胃癌患者血清胃泌素的分泌顯著增多，但胃癌病理進(jìn)程中受到胃泌素調(diào)控的生物學(xué)環(huán)節(jié)尚未明確。羅振國等[4]的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，胃泌素對胃癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及JAK2/STAT3通路均具有活化作用?，F(xiàn)分析血清胃泌素含量與胃癌患者病灶內(nèi)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化特征、JAK2/STAT3信號通路活化的相關(guān)性，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018年12月—2021年1月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院崇明分院普外科進(jìn)行根治性切除手術(shù)的胃癌患者65例作為胃癌組，其中男37例，女28例，年齡41～65(59.93±11.32)歲；吸煙20例；合并高血壓11例，糖尿病9例；均經(jīng)術(shù)后病理學(xué)結(jié)果診斷為胃癌，臨床資料完整且術(shù)前血清樣本、術(shù)后病灶標(biāo)本保留完整。選擇同期在醫(yī)院體檢且排除消化道疾病病史的健康志愿者45例作為健康對照組，男26例，女19例，年齡38～58(58.48±9.29)歲；吸煙14例；合并高血壓7例，糖尿病6例。2組性別、年齡、吸煙史及合并高血壓、糖尿病情況比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(2018120735)，受試者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 觀測指標(biāo)與方法

1.2.1 血清胃泌素測定：胃癌組入組當(dāng)天或次日、健康對照組體檢當(dāng)日收集受試者空腹肘靜脈血3 ml，離心獲取血清，采用時間分辨免疫熒光分析法(Thermo公司,SZ8382)測定胃泌素的含量。

1.2.2 病灶內(nèi)基因表達(dá)測定：手術(shù)切除后取胃癌病灶及癌旁組織適量，采用北京康為世紀(jì)公司提供的試劑盒進(jìn)行測定：首先通過Ultrapure RNA Kit試劑盒分離組織中的RNA，而后通過SuperRT One Step RT-PCR Kit試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；取cDNA 2 μl并與2×Taq Plus MasterMix試劑10 μl、引物混合液0.8 μl、去離子水7.2 μl混合，在PCR儀(ABI公司，7500型)上按照95℃ 20 s、特異性退火溫度15 s、72℃ 20 s的反應(yīng)程序重復(fù)40次，得到反應(yīng)曲線并生成循環(huán)閾值(Ct)，代入公式2-ΔΔCt計算E-cadherin、Claudin4、N-cadherin、Vimentin、Snail、ZEB1、Slug、Twist、JAK2、STAT3、MMP9、CyclinD1的mRNA表達(dá)量。引物由上海生工公司設(shè)計及合成，引物序列及退火溫度見表1。

表1 PCR反應(yīng)所用引物序列及退火溫度

2 結(jié) 果

2.1 2組血清胃泌素比較 胃癌組患者血清胃泌素含量為(19.31±2.24)pmol/L，顯著高于健康對照組的(5.89±0.72)pmol/L(t=38.779，P<0.001)。

2.2 胃癌病灶與癌旁組織內(nèi)上皮/間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志基因表達(dá)量比較 胃癌病灶內(nèi)E-cadherin、Claudin4的mRNA表達(dá)量明顯低于癌旁組織，N-cadherin、Vimentin的mRNA表達(dá)量明顯高于癌旁組織(P均<0.01)，見表2。

表2 胃癌病灶及癌旁組織內(nèi)上皮/間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志基因表達(dá)量比較

2.3 胃癌病灶與癌旁組織內(nèi)上皮/間質(zhì)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量比較 胃癌病灶內(nèi)Snail、ZEB1、Slug、Twist的mRNA表達(dá)量明顯高于癌旁組織(P<0.01)，見表3。

表3 胃癌病灶及癌旁組織內(nèi)上皮/間質(zhì)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量比較

2.4 胃癌病灶與癌旁組織內(nèi)JAK2/STAT3信號分子表達(dá)量比較 胃癌病灶內(nèi)JAK2、STAT3、MMP9、CyclinD1的mRNA表達(dá)量明顯高于癌旁組織(P<0.01)，見表4。

表4 胃癌病灶及癌旁組織內(nèi)JAK2/STAT3信號分子表達(dá)量比較

2.5 血清胃泌素與病灶內(nèi)基因表達(dá)相關(guān)性 胃癌患者血清胃泌素含量與胃癌病灶內(nèi)E-cadherin、Claudin4的mRNA表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，與胃癌病灶內(nèi)N-cadherin、Vimentin、Snail、ZEB1、Slug、Twist、JAK2、STAT3、MMP9、CyclinD1的mRNA表達(dá)量呈正相關(guān)(P均<0.05)，見表5。

表5 血清胃泌素與病灶內(nèi)基因表達(dá)相關(guān)性

3 討 論

胃癌的早期診斷有賴于血清腫瘤標(biāo)志物的測定及消化內(nèi)鏡下病灶的病理活檢，胃泌素是近年來新發(fā)展起來的胃癌標(biāo)志分子[5-6]。在生理?xiàng)l件下，胃泌素主要由胃竇G細(xì)胞分泌，十二指腸、空腸上段細(xì)胞也能分泌少量胃泌素；在胃黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生惡變的過程中，胃泌素的分泌明顯增多，進(jìn)入血液循環(huán)能夠成為腫瘤標(biāo)志物，進(jìn)入腫瘤病灶局部則能調(diào)控癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為[7-8]。本研究對胃癌患者血清中胃泌素含量的分析與以往報道的結(jié)果一致，胃癌組患者血清中胃泌素含量高于健康對照組。在胃癌的病理進(jìn)程中，癌細(xì)胞表現(xiàn)出極強(qiáng)的浸潤性生長能力，胃泌素促進(jìn)胃癌浸潤性生長相關(guān)的基礎(chǔ)研究表明，JAK2/STAT3通路的過度活化在胃泌素促進(jìn)胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中發(fā)揮了重要作用[4]。基于此，本研究圍繞胃泌素下游JAK2/STAT3通路及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化分析胃癌患者血清中胃泌素變化的意義。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是惡性腫瘤發(fā)病過程中重要的生物學(xué)特征，表現(xiàn)為極性強(qiáng)且不具遷移、運(yùn)動能力的上皮特征細(xì)胞向無極性且運(yùn)動能力極強(qiáng)的間質(zhì)特征細(xì)胞分化。E-cadherin、Claudin4是上皮標(biāo)志基因，能夠維持細(xì)胞間的極性及緊密連接，進(jìn)而使細(xì)胞錨定于局部組織、抑制細(xì)胞的遷移、運(yùn)動[9-10]；N-cadherin、Vimentin是間質(zhì)標(biāo)志基因，能夠增強(qiáng)細(xì)胞的遷移、運(yùn)動能力[11-12]。在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中會出現(xiàn)E-cadherin、Claudin4表達(dá)下調(diào)，N-cadherin、Vimentin表達(dá)上調(diào)。本研究對胃癌病灶內(nèi)相應(yīng)基因表達(dá)的分析符合上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的特征，即胃癌病灶內(nèi)E-cadherin、Claudin4的表達(dá)量明顯低于癌旁組織，N-cadherin、Vimentin的表達(dá)量明顯高于癌旁組織；進(jìn)一步通過相關(guān)性分析證實(shí)，胃癌患者的血清胃泌素含量與E-cadherin、Claudin4呈負(fù)相關(guān)，與N-cadherin、Vimentin呈正相關(guān)。這一結(jié)果提示，血清胃泌素含量的升高與胃癌病灶內(nèi)上皮標(biāo)志基因表達(dá)下調(diào)、間質(zhì)基因表達(dá)上調(diào)有關(guān)，結(jié)合胃泌素的離體生物學(xué)活性可以進(jìn)一步推測，胃癌患者體內(nèi)大量分泌的胃泌素能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中標(biāo)志基因表達(dá)的改變受到轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，Snail、ZEB1、Slug、Twist是目前已知調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用最為明確的轉(zhuǎn)錄因子[13-15]，均能結(jié)合E-cadherin基因啟動子區(qū)域的E-box序列，進(jìn)而阻礙基因的表達(dá)。已有多項(xiàng)離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，上述轉(zhuǎn)錄因子能夠使多種癌細(xì)胞內(nèi)的E-cadherin、Claudin4表達(dá)受到抑制，進(jìn)而增強(qiáng)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程[16-18]。在上述研究中對胃癌病灶內(nèi)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)錄因子的分析證實(shí)，胃癌病灶內(nèi)Snail、ZEB1、Slug、Twist的表達(dá)量明顯高于癌旁組織。這一結(jié)果表明，多種上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)錄因子在胃癌病灶內(nèi)呈高表達(dá)的趨勢，通過轉(zhuǎn)錄因子的改變能夠使上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程得到增強(qiáng)并參與胃癌的病理進(jìn)程[19-21]。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析胃癌患者體內(nèi)胃泌素大量分泌與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)錄因子高表達(dá)的相關(guān)性可知，胃癌患者血清中胃泌素的含量與胃癌病灶內(nèi)Snail、ZEB1、Slug、Twist的表達(dá)量呈正相關(guān)。這一結(jié)果提示，胃癌患者體內(nèi)大量分泌的胃泌素參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的生物學(xué)作用可能與調(diào)節(jié)相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)有關(guān)。

JAK2/STAT3信號通路是與癌細(xì)胞惡性生物學(xué)特征密切相關(guān)的信號通路，JAK2能夠介導(dǎo)生物學(xué)信號由細(xì)胞外向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而招募STAT3、使其發(fā)生活化并進(jìn)入細(xì)胞核[22-23]；入核后的STAT3能夠啟動基因MMP9、CyclinD1的表達(dá)，前者介導(dǎo)細(xì)胞侵襲加劇，后者介導(dǎo)細(xì)胞周期加速[24-25]。已有離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究表明，JAK2/STAT3信號通路的過度激活與離體培養(yǎng)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲能力的增強(qiáng)直接相關(guān)，當(dāng)該信號通路發(fā)生激活時，細(xì)胞內(nèi)MMP9、CyclinD1等下游基因的表達(dá)相應(yīng)上調(diào)[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌病灶內(nèi)JAK2、STAT3、MMP9、CyclinD1的表達(dá)量明顯高于癌旁組織，且與血清胃泌素含量呈正相關(guān)。這一結(jié)果提示血清胃泌素含量的升高與胃癌病灶內(nèi)JAK2/STAT3通路的激活有關(guān)。

綜上所述,胃癌患者血清胃泌素含量升高與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化加劇及JAK2/STAT3信號通路過度激活有關(guān)，胃泌素能夠參與胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及JAK2/STAT3信號通路激活的調(diào)控。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

陳明干：設(shè)計研究方案，實(shí)施研究過程，論文撰寫；龔慶豪、戴剛：資料搜集整理;朱榮華：進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析;張捷：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核