安艷蘇，畢秋左，張順平

曲靖市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，云南 曲靖 655000

和血明目片是收載于《中國藥典》的處方藥，由蒲黃、丹參、地黃、墨旱蓮、菊花、黃芩、龍膽等十九味中藥組成，主要功能涼血止血、滋陰化瘀、養(yǎng)肝明目，可用于陰虛肝旺，熱傷經(jīng)脈所引起的眼底出血［1］。龍膽中的龍膽苦苷具有抗炎、抗癌、利膽等作用［2-4］。黃芩含多種黃酮類化合物，主要有黃芩苷、黃芩素等，具有抑菌、利尿、抗炎、抗變態(tài)及解痙作用［5-8］。菊花中的木犀草苷具有祛痰、止咳、平喘的作用［9-10］。本文采用高效液相色譜法同時(shí)測定和血明目片中的龍膽苦苷、木犀草苷、黃芩苷的含量。方法專屬性強(qiáng)、操作簡便、穩(wěn)定、結(jié)果準(zhǔn)確，適用于和血明目片產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司，包括G7129A 型四元泵、G7115A 型自動(dòng)進(jìn)樣器及柱溫箱和G7162A 型紫外檢測器）；MS205DU 電子分析天平（上海梅特勒儀器有限公司）；AS-B 系列超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）。色譜柱：Hypersil ODS2 C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）(大連依利特分析儀器有限公司，柱號：E2816705，批號：15112)。

1.2 試藥

龍膽苦苷對照品（批號110770-201515，含量100.0%）；木犀草苷對照品（批號111720-201408，含量94.9%）；黃芩苷對照品（批號110715-201720，含量93.5%）均購于中國食品藥品檢定研究院。甲醇（分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司，批號2021072001）；乙腈（色譜純，德國默克有限公司，批號72-2440）；水為超純水。和血明目片（國藥準(zhǔn)字Z20073062，規(guī)格：0.31 g）均購自西安碑林藥業(yè)股份有限公司（批號：PA221010021、PA220060501、PA220060402）。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液制備

取樣品適量，研細(xì)，取0.6 g，精密稱定，置于50 mL 容量瓶中，加入甲醇適量，超聲處理（功率240 W，頻率45 kHz）30 min，放冷至室溫，用甲醇定容至刻度，搖勻，過0.45 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.2 陰性樣品溶液制備

按照和血明目片處方比例及工藝方法分別制備不含龍膽、菊花、黃芩的陰性樣品，并按“2.1”項(xiàng)下方法，制成陰性樣品溶液。

2.3 混合對照品溶液的制備

2.3.1 龍膽苦苷、黃芩苷混合對照品的制備 精密稱取龍膽苦苷對照品10.05 mg，黃芩苷對照品14.22 mg于同一25 mL 容量瓶中，加適量甲醇充分溶解，甲醇定容，搖勻，即得。

2.3.2 木犀草苷對照品的制備 精密稱取木犀草苷對照品10.80 mg 于50 mL 容量瓶中，加適量甲醇充分溶解，甲醇定容，搖勻，即得。

2.3.3 混合對照品溶液的制備 分別精密吸取“2.3.1”項(xiàng)下的混合對照品5 mL，“2.3.2”項(xiàng)下的對照品4 mL 于同一25 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得龍膽苦苷80.40 μg/mL，木犀草苷32.80 μg/mL，黃芩苷106.37 μg/mL 的混合對照品溶液。

2.4 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS2 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.1%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～7 min，90% A；7～11 min，90%→87% A；11～20 min，87%→82% A；20～43 min，82%→80% A；43～44 min，80% →50% A；44～50 min，50% A；50～51 min，50%→90% A；51～55 min，90% A）；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；檢測波長：254 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)及專屬性考察

按照“2.4”項(xiàng)下色譜條件下，取陰性樣品溶液、混合對照品溶液與供試品溶液各10 μL 進(jìn)樣，記錄色譜圖。龍膽苦苷、木犀草苷、黃芩苷的保留時(shí)間依次為11.7 min、25.4 min、42.4 min；理論板數(shù)依次為12 535、85 439、51 314；3 個(gè)成分均完全分離，陰性樣品溶液在與混合對照品溶液相應(yīng)保留時(shí)間處未出現(xiàn)色譜峰，說明和血明目片中的其他成份對測定無干擾，見圖1。

圖1 HPLC色譜圖：A.混合對照品；B.樣品；C.龍膽陰性樣品；D.菊花陰性樣品；E.黃芩陰性樣品

2.6 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.3”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，分別稀釋成5 個(gè)不同濃度的混合對照品系列，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，以進(jìn)樣濃度X 為橫坐標(biāo)，峰面積Y 為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程，結(jié)果見表1。

表1 3種成分的線性回歸方程

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取已知含量的和血明目片樣品（批號PA22101 0021），分別按照“2.1”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下的方法測定其含量，結(jié)果龍膽苦苷、木犀草苷、黃芩苷3 種成分的含量的RSD 值分別為2.21%、1.42%、1.82%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，室溫下分別于0、8、16、24、30 h 進(jìn)樣測定，考察龍膽苦苷、木犀草苷、黃芩苷在室溫下溶液的穩(wěn)定性，記錄色譜圖，以峰面積進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果RSD 分別為1.21%、0.89%、1.05%。結(jié)果表明供試品溶液在室溫下30 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取6 份已知含量的樣品（批號PA221010021），每份約0.3 g，精密稱定，分別精密加入“2.3.1”項(xiàng)下的混合對照品2.5 mL、“2.3.2”項(xiàng)下的對照品0.5 mL，按“2.1”項(xiàng)下的方法制備加樣回收樣品溶液，按“2.4”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 3種成分的回收率結(jié)果（n=6）

2.10 樣品測定

取3 批次和血明目片樣品（批號：PA221010021、PA220060501、PA220060402），每批各取3 份，分別按“2.1”項(xiàng)下方法制得供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，按“2.6”項(xiàng)下回歸方程計(jì)算各成分的含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果（mg/g，n=3）

3 討論

3.1 樣品提取條件的優(yōu)化

和血明目片由十九味中藥材組成，化學(xué)成分比較復(fù)雜，供試品的制備通過參考相關(guān)文獻(xiàn)［5-10］，以超聲提取為基礎(chǔ)，依次考察了甲醇、乙醇、50%甲醇和50%乙醇作為提取溶劑，提取時(shí)間考察了20 min、30 min、45 min、60 min，結(jié)果顯示以乙醇為溶劑時(shí)，龍膽苦苷和木犀草甘峰形不太好，用甲醇和50%甲醇提取時(shí)，甲醇提取效率較高，30 min 內(nèi)能提取完全，并且各成分分離度較好，峰形理想，因此本試驗(yàn)最終選擇了50 mL 甲醇超聲提取30 min，作為最終的提取方法。

3.2 波長的選擇

本方法選用DAD 檢測器在200～400 nm 波長處，分別掃描龍膽苦苷、木犀草甘、黃芩苷對照品溶液和供試品溶液，結(jié)果表明3 個(gè)主要成分的最大吸收波長均不相同，在254 nm 波長條件下，HPLC 圖譜中色譜峰峰形和峰強(qiáng)度均較為理想，故本試驗(yàn)最終選擇254 nm 作為檢測波長。

3.3 流動(dòng)相的考察

對不同流動(dòng)相組成及比例進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)在流動(dòng)相中加入一定比例的酸有助于提高待測成分與雜質(zhì)峰之間的分離度，且峰形好，經(jīng)過進(jìn)一步考察，確定用乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，可以獲得理想的色譜圖。

4 總結(jié)

本試驗(yàn)建立高效液相色譜法同時(shí)測定和血明目片中龍膽苦苷、木犀草苷、黃芩苷的方法?，F(xiàn)行和血明目片標(biāo)準(zhǔn)含量測定僅以丹參素作為指標(biāo)成分，本試驗(yàn)所建立的含量測定方法能對3 味主藥（龍膽、菊花、黃芩）的含量同時(shí)進(jìn)行控制，該方法前處理方法簡便、快捷，梯度洗脫方法靈敏、準(zhǔn)確，測定結(jié)果穩(wěn)定、可靠，重復(fù)性好，適用性強(qiáng)，樣品的分離度較好，陰性樣品無干擾，能夠?yàn)楹脱髂科馁|(zhì)量控制提供更準(zhǔn)確、更全面的參考依據(jù)。